생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

다음 실험의 전반적인 목표는 케모카인 기울기를 향한 순환 세포의 이동을 정량적으로 측정하는 것입니다. 생리학적 전단 응력 조건 하에서 이를 달성하기 위해, 우선 콜라겐이 코팅된 미세다공성 인서트 위에 혈관 내피 세포 단일층을 배양한 다음, 케모카인이 포함된 별도의 정적 구획을 덮도록 이들을 유동 챔버에 조립합니다. 그 후, 혈관 내의 생리학적 조건을 모사하기 위해 세포에 전단 응력을 가합니다.

두 번째 단계로서, 백혈구 줄기세포나 종양 세포와 같이 관심 대상이 되는 테스트 세포들이 순환 과정 동안 3D 시스템 내에서 순환하도록 합니다. 정적 구획(static compartment) 내의 성분들은 순환 세포와 혈관 내피세포 간의 상호작용 효율에 영향을 미치며, 결과적으로 내피세포 층을 가로지르는 테스트 세포의 투과 속도에 영향을 줍니다. 다음으로 3D 시스템을 분해하고 하단 정적 구획에서 투과된 테스트 세포를 수집하여 세포 투과 정도를 정량적으로 측정합니다. 최신 기술의 다양한 분석 방법을 통해, 정적 구획 내 케모카인 농도에 따라 순환하는 테스트 세포가 생리학적 흐름 조건에서 혈관 내피세포와 상호작용하고 혈관 밖으로 나가는 능력을 보여주는 결과를 얻게 됩니다.

평행 라미나 흐름 챔버(parallel lamina flow chambers)나 정적 전이 분석(static transfer assays)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상단 구획의 전단 응력(shear stress)과 하단 정적 구획의 화학 유인 물질(chemokines)을 모두 결합했다는 점입니다. 이를 통해 연구자는 생리적 흐름 조건과 화학 유인 물질 농도 구배에 따른 순환 세포의 외출(externalization)을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 국소 미세환경 세포와 혈관 내피세포 간의 상호작용(crosstalk)이 순환 세포의 혈관 외 유출(extravasation)에 미치는 영향을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.

내피 세포 아래의 별도 인서트에 추가 세포층을 보조함으로써, 본 절차의 시연은 저희 연구실의 기술자인 Valentina against rova가 진행하겠습니다. 우선, 실험에 필요한 인서트 수를 계산하여 각 인서트를 별도의 멸균 페트리 접시에 넣으십시오. 개별 설정에 따라 총 선량이 11 gray에 도달할 때까지 감마선 조사를 통해 멸균하십시오.

그 다음, stock collagen Type one 용액을 4°C에 보관된 0.01 M 염산을 사용하여 50 µg/mL로 희석하고, 각 인서트당 154 µL씩 최종 용액을 분주하여 준비합니다. 이어서, 하나의 Eloqua에서 몇 방울을 취해 인서트 표면에 원형 패턴으로 떨어뜨립니다.

그런 다음, 나머지 분주액을 넣어 인서트 표면에 하나의 큰 방울을 형성합니다. 이때 피펫 팁이 어느 지점에서도 인서트에 닿지 않도록 하고, 콜라겐이 인서트의 전체 표면을 덮되 밖으로 흘러내리지 않도록 주의하십시오. 인서트가 덮이면 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 평평한 표면에 조심스럽게 놓습니다.

배양 후 인서트를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 콜라겐 용액을 흡입하여 제거한 다음 160 µL의 PBS로 막을 세척합니다. 그다음 PBS를 흡입하여 제거합니다. 뚜껑을 덮고 파라필름으로 디쉬를 감쌉니다.

인서트를 당일에 사용할 경우, 페트리 접시를 실온의 건조한 곳에 보관하십시오. 그렇지 않은 경우에는 접시를 4 °C에 보관하고 7일 이내에 인서트를 사용하십시오. 사용 직전에 배양된 인간 제대정맥 내피세포를 수확하여 원하는 배양액에 2.5 million cells/mL 농도로 재현탁하십시오.

세포 수를 측정할 때, 트라이판 블루(trypan blue)를 사용하여 세포 생존율이 98% 이상인지 확인한 후, 각 인서트에 세포 현탁액 160 µL를 첨가하십시오. 먼저 콜라겐이 코팅된 인서트 표면에 작은 방울 여러 개를 원형으로 떨어뜨린 다음, 나머지 세포 현탁액을 조심스럽게 추가하여 하나의 큰 방울을 형성하게 합니다. 완료되면 뚜껑을 닫고 디쉬를 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 조심스럽게 넣고 30분 동안 배양하여 세포가 막에 부착되도록 합니다.

30분 후, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 각 인서트 위에 미리 데워둔 배양액 5 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 이때 인서트가 디쉬 바닥에 유지되고 배양액으로 완전히 덮이도록 주의하십시오. 그런 다음 뚜껑을 닫고 디쉬를 조심스럽게 인큐베이터 배양기로 다시 넣습니다.

세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 유체 챔버를 조립하려면 먼저 상판과 하판을 나사로 결합하십시오. 그런 다음 벽 두께가 0.8 mm이고 내경이 1.42 mm인 PVC 튜브를 사용하여 플레이트를 가스 교환 장치에 연결합니다.

다음으로, 조립된 장치를 깨끗한 플라스틱 백에 넣고 총 조사량이 11 gray에 도달할 때까지 감마선 조사를 통해 멸균합니다. 다음 단계는 인큐베이터 트레이를 꺼내 멸균된 조직 배양 후드 안에 놓고 70% ethanol로 소독하는 것입니다. 그런 다음 트레이를 커다란 멸균 냅킨으로 덮습니다.

다음으로, 플라스틱 백에서 장치를 꺼내 멸균된 인큐베이터 트레이 위에 놓습니다. 그런 다음 장치를 연동 펌프에 연결하고 펌프 속도를 0.2 mL/min으로 설정합니다. 입구 측에 사용할 멸균된 15 mL 튜브에 원하는 배양액 5~7 mL를 피펫으로 분주합니다.

그런 다음, 튜브의 무균 상태를 유지하기 위해 작은 멸균 냅킨을 사용하여 튜브에서 금속 바늘을 당겨 입구 튜브와 출구 튜브의 연결을 분리합니다. 금속 입구 바늘을 배지가 들어 있는 15 milliliter 튜브에 넣고, 출구 튜브를 빈 15 milliliter 튜브에 넣습니다. 다음으로, 유동 방향이 반시계 방향이 되도록 펌프를 켭니다. 음압을 통해 15 milliliter 입구 튜브의 배지가 튜브 내부로 흡입되도록 하며, 배지가 장치에 진입하기 직전 튜브 끝에 도달하면 펌프를 멈춥니다.

그 다음 튜브 플레이트를 풀어 장치를 열고 상단 플레이트를 조심스럽게 제거합니다. 하단 웰에 1,500~1,550 µL의 배지를 분주하며, 이때 웰 내의 배지가 하단 플레이트 위로 1~2 mm 높이의 반구를 형성할 만큼 충분한지 확인합니다. 이어서, 페트리 접시에 준비된 인서트를 하단 플레이트의 웰로 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 인서트 아래에 기포가 갇히지 않았는지 확인하고, 하단 플레이트 표면에 묻어 있는 배지는 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 상부 플레이트를 하부 플레이트 위에 다시 놓고 서로 연결합니다. 나사를 사용하여 고정한 즉시 연동 펌프를 가동하여 배지가 3D 장치를 통해 흐르게 합니다. 장치의 배출구 쪽을 들어 올리고 챔버를 이 상태로 유지하여 플레이트 사이의 공간에 기포가 형성되는 것을 방지합니다.

챔버와 가스 교환 장치를 연결하는 튜브에 배지를 계속 채워 배지가 가스 교환 장치에 도달하게 합니다. 다음으로, 가스 교환 장치에 배지 3 mL를 넣습니다. 펌프를 켜고 공기 방울이 장치를 통해 빠져나가게 합니다.

배지가 유닛에서 나오는 튜브를 채울 수 있도록 유닛을 높게 들어 올리고, 배지가 끝부분에서 2~3 cm 전까지 도달했을 때 펌프를 멈춥니다. 프라이밍이 완전히 끝나면, 작은 멸균 냅킨을 사용하여 입구 바늘을 출구 튜브에 연결합니다. 그 다음 펌프 방향을 반대로 전환하여 배지가 가스 교환 유닛을 향해 시계 방향으로 흐르게 하고, 남아 있는 기포가 모두 제거되었는지 확인합니다.

펌프를 다시 반시계 방향으로 작동시킵니다. 테스트 세포 현탁액 100 µL를 가스 교환 장치에 첨가합니다. 그런 다음 레스피레이터의 덮개를 닫습니다.

트레이를 다시 인큐베이터에 넣고 테스트 세포가 장치 내에서 37 °C로 순환하도록 합니다. 원하는 시간이 지나면, 작동 중인 시스템이 담긴 트레이를 인큐베이터에서 꺼내 후드 안에 놓습니다. 펌프를 정지시키고 입구와 출구를 분리한 후, 그 끝부분을 빈 멸균 15 mL 튜브에 넣습니다.

그 다음 펌프를 켜고 시스템에서 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액은 사용 전까지 얼음 위에 둡니다. 이어서 나사를 제거하고 상부 플레이트를 들어 올려 챔버를 분해합니다.

하단 플레이트에서 인서트를 제거하고, 염색 또는 세포 수집을 위해 페트리 접시로 옮깁니다. 마지막으로, 하단 웰에서 세포 현탁액을 제거하여 15 milliliter 튜브에 담습니다. 각 웰을 1.5 milliliters의 배지로 두 번 헹구고 이를 해당 튜브에 추가합니다.

그런 다음 튜브를 200 Gs에서 5분 동안 원심 분리하고, 제시된 텍스트 프로토콜에 나열된 것과 같이 구체적인 실험 목적에 따라 세포를 처리합니다. 다음은 이 시스템을 사용하여 수행할 수 있는 많은 테스트 중 하나의 예입니다. 설정은 5 µm 공극의 인서트에서 배양된 골수 유래 혈관 내피 세포의 미러링으로 구성되며, 인서트 아래에 0, 5 또는 50 ng/mL 농도의 stromal cell derived factor one 또는 SDF-1을 첨가하였습니다.

골수 세포가 3D 시스템 내에서 순환하도록 하였습니다. 인서트를 통해 이동한 세포를 수집한 후 Methylcellulose 배지가 담긴 플레이트에서 배양하였습니다. 조혈 성장 인자의 존재 하에 전구 세포가 콜로니를 형성하도록 하였으며, 14일 후 콜로니 수를 측정하여 각 웰 내의 전구 세포 수를 결정하고 sdf를 향한 이동 능력을 확인하였습니다.

하나는 생리적 흐름 조건 하에서 수행되었습니다. 정적 챔버의 하단 인서트에서 배양된 기질 섬유아세포를 추가했을 때, SDF-1 단독 처리 시보다 SDF-1을 50 nanograms per milliliter 농도로 추가했을 때 더 많은 조혈 세포가 혈류에서 챔버 내부로 이동했습니다. 이 기술의 개발 이후, 의료 및 생물 과학의 다양한 분야의 연구자들이 시험관 내(in vitro)에서 조직 특이적 혈관망을 모델링하고, 순환 세포가 정상 조직과 질환 조직으로 이동하게 하는 세포 및 분자적 기전을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.