효모에서 핵산 분리

오늘 우리는 또한 베이커의 효모로 알려진 사카로미세스 세레비시아에서 핵산을 정화하는 방법을 보여줄 것입니다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이 비디오는 상 분리 및 염색체에 의하여 효모 세포에서 이 분자의 격리를 토론할 것입니다.

효모에서 핵산을 정화하기 위해 많은 다른 방법이 존재하지만, 그들 대부분은 동일한 초기 단계를 공유합니다.

효모 세포는 플레이트에서 단일 식민지를 선택하고 YPD 미디어로 접종하여 먼저 전파됩니다. 혼합물은 흔들리거나 회전하는 인큐베이터에서 30°C에서 하룻밤 사이에 재배되어야 합니다.

효모 세포는 수율을 최적화하기 위해 성장의 중간 로그 단계에서 수확해야합니다. 성장의 로그 단계에서 효모는 일반적으로 600 nm의 파장에서 측정 할 때 0.5-1의 광학 밀도 또는 "OD"값을 가질 것이다. 세포가 적절한 광학 밀도에 도달하면 원심 분리되어 펠릿을 형성하고, 세포가 열리도록 리시스 버퍼에서 재장매됩니다.

효모에서 핵산을 분리하는 가장 어려운 측면 중 하나는 거친 세포벽을 방해하고 있습니다. 세포벽은 효소및 물리적 기술의 조합으로 파괴될 수 있다. 세포벽의 파괴는 효모가 표준 세포 리시스 기술을 통해 lysed될 수 있는 구엽세포에게 불린 스페로이드 세포를 형성하는 원인이 됩니다.

구형 세포는 일반적으로 세포 막을 lyse 나트륨 도데실 황산염 또는 SDS와 같은 화학 세제로 lysed. 세포는 또한 균질화될 수 있습니다. 예를 들어, 유리 구슬은 소용돌이에 의해 균질화 된 세포 및 세포에 추가 될 수있다. 또는 세포벽은 초음파 처리기를 사용하여 초고주파 사운드로 중단될 수 있으며, 용해 공정을 돕습니다.

효모에서 행해지는 모든 핵산 정제 절차는 효모 세포를 성장, 수확 및 용해하는 유사한 단계를 가지지만 세포가 용해되면 여러 가지 다른 방법이 핵산을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 핵산은 컬럼 결합 또는 위상 분리를 통해 정제될 수 있다.

DNA와 RNA는 실리카 컬럼 결합을 사용하여 가장 잘 격리된다. 핵산은 음이온 교환을 통해 컬럼에 결합하고 다른 세포 성분과 분리되면 컬럼에서 용출될 수 있다.

위상 분리는 서로 다른 특성을 가진 용액이 용해도에 기초하여 특정 단백질 또는 핵산을 정화하거나 농축하는 데 사용될 수 있다는 원리를 사용합니다. 클로로폼의 첨가는 세포 성분의 슬러리를 2개의 상이다른 단계, 수성 및 유기단계로 분화한다. 유기 상은 단백질을 포함하고 수료 상은 핵산을 포함합니다. DNA는 에탄올을 첨가하여 유기상으로부터 침전될 수 있다.

핵산은 컬럼 결합 프로토콜을 사용하여 효모로부터 분리될 수 있다. 첫째, 세포는 원심분리에 의해 자라서 수확됩니다.

셀 펠릿이 효소 함유 완충제에서 재주리중단되고, 소용돌이가 되고, 세포벽이 소화될 때까지 인큐베이션되는 동안 상피체가 제거되고 버려지도록 한다. 세포 벽 소화 및 구혈 구형 형성 효소 치료를 최적화 할 때 현미경 검사법으로 확인할 수 있습니다. 세포벽 소화 후, 리시스 버퍼가 세포에 첨가되고 혼합물은 소용돌이된다.

용액 세포는 상체에 DNA와 작은 미립자 및 수용성 단백질을 남기고 파편의 혼합물을 명확히하기 위해 원심 분리되어야합니다. 상피성은 실리카 컬에 로드되고 핵산은 다음 원심분리를 결합할 수 있으며, 이는 수용성 불순물의 대부분을 제거합니다.

세척 단계는 바운드 된 핵산에서 잔류 불순물을 제거하기 위해 에탄올 또는 높은 염분 완충제로 수행됩니다. 마지막으로, DNA 또는 RNA는 소금이 낮은 물 또는 완충제로 용출됩니다. 효소 DNAse 및 RNAe가 없는 완충제 또는 물을 사용해야 합니다.

효모에서 분리 된 핵산은 특정 실험 목표에 따라 다양한 용도를 가지고 있습니다. 효모로부터 분리 된 DNA는 PCR, 남부 블로팅 또는 제한 효소 소화를 포함하여 여러 가지 다른 분자 생물학 기술에 사용될 수 있습니다.

유전자 발현의 변화는 이것과 같은 유전자 어레이를 사용하는 마이크로어레이 분석으로 알려진 프로세스에 의해 확인될 수 있다.

우리가 2개의 효모 배양을 가지고 있는 경우에, 하나는 과산화수소에 노출되고 1개의 통제, mRNA는 이 배양에서 격리되고 마이크로어레이 슬라이드에 혼성화될 수 있습니다. 슬라이드를 분석하고 산화 스트레스에 의해 변형되는 유전자를 식별할 수 있습니다.

이 비디오에서, 연구원은 유전자 기능을 평가하기 위하여 이용되는 게놈 전체 효모 돌연변이의 라이브러리를 준비하기 위하여 로봇 시스템을 이용합니다. 돌연변이 균주로부터 유전자 게놈 DNA로, 유전자 바코드라고 불리는 삽입으로 인해 4,000명에서 6,000명의 개인을 동시에 추출하고 마이크로어레이 분석 또는 시퀀싱을 실시할 수 있다. 바코드 시퀀스의 상대적 풍부에 기초하여, 각 돌연변이의 피트니스는 다중 실험 조건하에서 결정될 수 있다.

당신은 효모에서 핵산을 분리에 조브의 비디오를 보았다. 이제 용해용을 위해 효모 세포를 준비하는 방법과 다른 추출 및 격리 절차를 수행하는 방법과 같은 핵산을 정화하는 기본 측면을 이해해야합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!