잠재적 인 토양 세포 외 효소 활동의 높은 처리량 형광 측정 측정

이 절차의 전반적인 목표는 토양 내 세포 외 효소가 표적 기질을 분해하는 최대 잠재 속도를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 현장 습윤 토양과 완충액을 블렌더로 혼합한 다음, 혼합된 시료를 딥웰 시료 플레이트와 딥웰 표준 플레이트에 피펫팅하여 옮김으로써 수행됩니다. 딥웰 플레이트를 배양하고 원심 분리한 후, 각 딥웰의 250 µL를 검정색 평바닥 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.

96 웰 플레이트입니다. 이후 세 개의 플레이트를 형광 광도계로 읽고 결과 데이터를 분석합니다. 최종적으로, 잠재적 토양 세포외 효소 활성은 효소 촉매 반응에 의해 기질로부터 형광 염료가 방출되는 속도로 결정되며, 형광 수치가 높을수록 기질 분해가 더 많이 일어났음을 나타냅니다.

기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 딥 96웰 마이크로플레이트 형식을 활용하여 많은 수의 시료에서 효소 활성을 측정할 수 있다는 점입니다. 저희는 다른 프로토콜을 딥웰 플레이트 형식에 맞게 조정함으로써 표준 마이크로플레이트보다 시료 부피를 늘릴 수 있는 가능성을 발견했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이 기술의 적용을 통해 미생물 생리 작용과 생태계 규모의 프로세스를 더 효과적으로 연결할 수 있게 되었습니다.

이 기술은 서면 절차만으로는 따라 하기 어려운 많은 세부 사항과 시료 취급 과정이 포함되어 있어 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 토양 미생물이 환경 변화에 어떻게 반응하는지, 그리고 이러한 생리적 반응이 분해 및 영양분 순환과 같은 중요한 생태계 프로세스에 어떤 영향을 미치는지와 같이 미생물 생태학 및 토양 생지화학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법은 토양 유기물 분해, 영양분 순환 및 육상 생태계에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 해양 및 담수 시스템에도 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 피펫팅 기술과 본 프로토콜의 시간 민감성 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 이 과정에서 생성되는 방대한 양의 데이터는 처음 사용하는 사용자에게 때때로 부담이 될 수 있습니다. 분석 설정을 시작하려면, 3개의 딥웰 플레이트에 각각 4-methylumbelliferone(4-MU) 표준물질을 위한 sample MUB standard, 그리고 7-amino-4-methylcoumarin을 위한 MUC standard라고 라벨을 붙이십시오.

각 표준물질과 기질을 행 방향으로 배열된 별도의 깨끗하고 라벨이 부착된 리저버에 붓습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 기재된 대로 적절한 MUB 표준물질을 MUB 표준 플레이트의 해당 웰에 피펫팅합니다. 토양 슬러리를 준비하기 위해 MUC 표준물질에 대해서도 MUC 표준 플레이트의 해당 웰에 동일한 과정을 반복합니다.

각 토양 샘플에 대해 현장 습윤 토양 2.75 grams를 측정하여 블렌더에 넣습니다. 50 millimolar 완충액 91 milliliters를 추가하고, 고속으로 1분 동안 블렌딩합니다. 블렌더의 내용물을 교반자가 포함된, 8채널 피펫의 너비보다 넓은 깨끗한 유리 볼에 붓습니다.

토양 슬러리를 보울에 붓기 전 약 1mm 체로 걸러낼 수 있습니다. 보울을 교반 플레이트에 올리고 토양 슬러리를 혼합합니다. 그런 다음 800 µL의 토양 슬러리를 샘플 플레이트의 첫 번째 컬럼에 피펫으로 분주합니다.

MUB 표준 플레이트와 MUC 표준 플레이트의 첫 번째 열에 대해서도 동일하게 수행하십시오. 토양 샘플 사이에 블렌더, 교반 플레이트 및 교반 바를 탈이온수 또는 완충액으로 헹구십시오. 각 토양 샘플에 대해 이 과정을 반복하십시오.

각 후속 샘플을 다음 열로 옮겨 가며 분주합니다. 다음으로, 샘플 플레이트의 해당 웰에 적절한 기질을 피펫으로 분주합니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 대로, 테스트할 각 배양 온도별로 샘플 플레이트를 준비하십시오.

플레이트 매트로 딥웰 플레이트를 밀봉합니다. 용액이 충분히 섞일 때까지 밀봉된 각 플레이트를 손으로 반전시킵니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 필요한 배양 시간 동안 플레이트를 적절한 배양기에 넣고, 초기 시간을 0시로 기록하며, 각 배양 기간이 끝날 때마다 해당 배양 시간을 기록합니다.

밀봉된 플레이트를 약 2,900 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 배양된 딥웰 플레이트의 각 웰에서 250 µL를 추출하여 이에 대응하는 검은색 평저 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 배양된 딥웰 플레이트 하나당 검은색 플레이트 하나를 사용합니다.

사용하는 형광 마이크로플레이트 리더기의 제조사 지침에 따라, 배양된 딥웰 플레이트의 샘플을 검은색 평저 96웰 플레이트의 해당 웰로 옮기는 것이 중요합니다. 들뜸 파장은 365 nanometers로, 방출 파장은 450 nanometers로 설정하십시오.

표준 플레이트 중 하나를 로딩하고, 형광 광도계를 자동 게인(automatic gain)으로 설정하여 플레이트를 판독합니다. 그다음 게인을 수동으로 설정하고, 최적값에서 5 단위로 내림 하여 다음으로 낮은 수치로 값을 감소시킵니다. 각 표준 플레이트에 대해, 플레이트당 측정을 두 번씩 반복합니다.

다음으로, 샘플 플레이트를 로드합니다. 게인을 자동(automatic)으로 설정하고 샘플 플레이트를 실행합니다. 각 표준 플레이트의 최고 게인과 일치하도록 샘플 플레이트를 수동으로 다시 실행합니다.

MUB 및 MUC 표준물질의 표준 곡선 형광 데이터를 스프레드시트에 입력하여 데이터 분석을 시작하십시오. 각 샘플의 micromolar 농도를 micromole로 변환하십시오. 표준 곡선 형광 데이터를 바탕으로 MUB 및 MUC 표준 농도에 대한 기울기, y 절편 및 R squared 값을 계산하십시오.

각 샘플의 결정계수(r squared) 값은 0.98을 초과해야 합니다. 표준 곡선은 형광 측정값을 종속 변수로, 표준 농도를 독립 변수로 하여 산점도로 시각화할 수 있습니다. 샘플과 기질의 가공 전 형광 데이터를 새로운 스프레드시트에 입력하십시오.

또한 각 샘플의 배양 시간과 토양 건조 중량을 포함하고, 해당 샘플의 형광 값에서 표준 곡선의 절편 값을 뺀 후, 이를 해당 표준 곡선의 기울기로 나눕니다. 표준 직선 방정식을 사용하여 샘플의 마이크로몰 값에 토양 슬러리에 사용된 완충액 부피인 91 milliliters를 곱합니다. 얻은 값을 샘플별 배양 시간과 토양 건조 질량으로 나눕니다.

마지막으로 얻은 값에 1000을 곱하여 원하는 단위를 산출합니다. 결과는 주변 기후 조건에 노출된 토양과 이산화탄소 농도 증가 및 가열 처리에 노출된 토양을 비교한 실험적 기후 연구에서 나타납니다. 여기에 표시된 내용은 초원 가열 및 이산화탄소 농도 증가 강화 부지의 대조구와 처리구에서 측정된 잠재적 세포외 효소 활성 또는 EEA입니다. 본 예시에서 0~5 cm 토양 깊이에서 분석한 잠재적 탄소, 질소 및 인 효소 획득 활성은 실험 처리군 간에 차이가 없었습니다.

하지만 5~15 cm 토양 깊이에서는 몇 가지 잠재적 EEA가 유의미하게 다르게 나타났습니다. 예를 들어, 탄소 분해 효소인 beta one four glucoside와 beta D cello biolace는 주변 기후 조건 구역과 비교했을 때 이산화탄소 농도 증가 및 가열 처리 구역에서 더 낮게 나타났습니다. 질소 및 인 무기화 효소 또한 5~15 cm 토양 깊이에서 주변 기후 조건과 비교했을 때 처리 구역에서 더 낮게 나타났습니다.

모든 탄소, 질소 또는 인 순환 잠재적 EEA(효소 활성)의 합계를 계산하고 도식화하는 것은 토양의 잠재적 탄소, 질소 및/또는 인 순환과 관련된 더 광범위한 패턴을 관찰하는 데 유용한 접근 방식이 될 수 있습니다. 본 예시에서는 잠재적인 탄소 순환 활동을 나타내기 위해 beta 1,4-glucanase, beta-D-cellobiohydrolase, beta-xylosidase 및 alpha 1,4-glucanase의 잠재적 EEA 합계를 계산하였습니다. 잠재적인 질소 순환 활동을 나타내기 위해 beta 1,4-N-acetylglucosaminidase 및 L-leucine aminopeptidase의 합계를 계산하였습니다.

인산분해효소(Phosphatase)는 잠재적인 인 순환 활동을 나타내는 지표로 사용되었습니다. 5~15 cm 토양 깊이에서 총 탄소, 질소 및 인 순환에 대한 잠재적 EEA(효소 활성)는 대조군(주변 기후 조건) 구획에 비해 이산화탄소 농도 증가 및 가열 처리 구획에서 더 낮은 경향을 보였습니다. 그러나 이러한 경향은 총 질소 및 인 순환 활동에서만 유의미하게 나타났으며, 토양 EEA는 처리 구획 간에 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.

토양 깊이 0~5cm에서 측정하였습니다. 결과에 따르면, 토양 깊이에 따른 처리구 간의 효소 활성 및 기능적 그룹에서 상반된 경향이 나타났으며, 잠재적 EEA 비율은 미생물의 영양 요구도를 평가하는 한 가지 방법입니다. 본 연구에서 토양 효소, 토양 기하학적 구조, 탄소 대비 질소, 탄소 대비 인 또는 질소 대비 인 활성은 0~5cm 토양 깊이의 처리구 간에 유의미한 차이를 보였습니다.

하지만 잠재적 효소 탄소 대 인 및 질소 대 인 비율은 이산화탄소 농도 증가 및 가열 처리구에서 더 높게 나타났습니다. 5~15 cm 토양 깊이의 주변 기후 조건과 비교했을 때, 온도는 토양 EEAs에 강력한 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 일반적인 실험실 분석에서 토양 효소는 단일 온도에서 측정되는데, 이는 실제 온도 조건과 일치하지 않을 수 있습니다.

Aran 도표는 활성화 에너지를 시각화하는 데 사용되며, x축에 켈빈 온도로 변환된 온도의 역함수를, y축에 효소 활성도의 로그 값을 표시하여 작성합니다. 활성화 에너지는 일반적으로 화학 반응을 촉매하는 데 필요한 최소 에너지로 정의되며, 여기서는 효소 촉매 반응의 온도 민감도를 나타내는 지표로 사용됩니다. 활성화 에너지가 높을수록 효소의 온도 민감도가 높음을 나타냅니다.

마찬가지로, 활성화 에너지는 Q10 온도 계수 값과 직접적으로 대응합니다. 탄소, 질소 및 인 EEA의 잠재적 효소 반응 속도론을 두 가지 토양 깊이의 두 처리구 모두에서 평가했으며, 그 결과 EEA의 온도 민감도는 두 토양 깊이 모두에서 처리구 간에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다. 숙련될 경우, 30분 이내에 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 12개의 시료를 접종할 수 있습니다.

또한, 규정된 배양 시간이 지난 후에는 일반적으로 30분 이내에 플레이트를 다시 원심 분리하고 옮겨 urometer로 읽을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 피펫팅을 일관되게 하는 것이 중요합니다. 피펫팅 시 공기가 유입되면 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

토양 발달 이후 토양 기능에서 토양 미생물 군집 조성의 역할과 관련된 추가적인 의문을 해결하기 위해 DNA 추출 및 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 미생물 생태학 분야의 연구자들이 육상 생태계의 영양분 순환 및 생지화학적 과정을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 잠재적 효소 활성을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

또한, 다양한 생태계 내의 기후 및 서로 다른 토양 유형과 같은 요인에 대한 잠재적인 미생물 반응을 반영하도록 데이터를 해석할 수 있어야 합니다. 형광 물질을 다룰 때는 형광 작용기의 빛 민감성으로 인해 빛 노출을 최소화하기 위한 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.