Name: 자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 약하게 전기 생선의 자발적 공간 탐색 행동을 동기화된 전기 신호와 비디오로 기록하는 방법을. 비침습적 기법으로 자유롭게 수영하는 물고기의 자연스러운 행동을 장기간 관찰할 수 있습니다.

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이 작품은 넉넉한 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 및 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에 의해 지원되었다.

이 절차는 오타와의 동물 관리위원회의 대학의 요구 사항을 충족한다. 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 장비 아래에 나열된 물질의 차종과 모델에 대한 재료 및 시약의 표를 참조하십시오. 사용자 정의 서면 Spike2 및 MATLAB 스크립트, 샘플 데이터는 보조 파일에 제공됩니다. 1. 수족관 탱크와 분리 실 설치 <ol><li> 안티-V ibration 층. 바닥에서 상부 (도 1a)에 고무 패드, 탄성 발포 스티롤, 선박용 합판 패널, 및 폴리 우레탄 발포 패드를 적층하여 진동 방지 표면 (2.1 MX 2.1 m)을 구축. 수족관 탱크의 가장자리를 지원하기 위해 합판 패널에 네 개의 나무 스터드 (5cm X 10cm)를 놓습니다. </li><li> 마루. (그림 1D 하단 참조) 열 등급 거품 패딩에 전기적으로 차폐 가열 요소를 놓습니다. 금속과 발열체 커버LIC 전기 차폐 메쉬. </li><li> 공간 탱크. 두꺼운 유리 패널, L 모양의 알루미늄 프레임과 수족관 급 실리콘 (그림 1A 참조) 강화 1.3 cm를 사용하여 넓고 얕은 수족관 탱크 (1.8 MX 1.8 MX 30cm)를 구축합니다. (프로토콜 3 참조) 높은 촬상 콘트라스트를 제공하기 위해 흰색 배경의 큰 시트로 탱크의 밑면을 커버. </li><li> (0.64 cm 두께의 흰색 매트) 아크릴 시트로 만든 (22.5 ㎝ 높이) 설치 벽으로 중앙 무대 (1.5 m 직경)과 네 개의 코너 구획 (그림 1B 참조)에 수족관 탱크를 나눈다. <ol><li> 네 개의 곡선 벽 부분을 만들고 4 개의 코너 구획에서 중앙 무대를 분리하는 실리콘 코킹을 사용하여 탱크 바닥에 이러한 사항을 추가하는 열을 적용하여 벤드 개의 아크릴 시트 (22.5 cm X 102.7 cm). 게이트 설치를 위해 굴곡 부분 사이에 20cm의 공간을 두십시오. </li><li> 네 두 배 벽 위스콘신을 설치하여 별도의 이웃 코너 구획이러한 수중 청음기로 수중 센서에 대한 별도의 전기 절연 및 장소를 제공하는 일 15cm 간격. </li></ol></li><li> 네 자동화 게이트를 조립하고, 코너 구획과 중앙 무대 사이에 설치합니다. <ol><li> 도 1C에 도시 된 바와 같이 네 개의 도어 프레임을 조립한다. 각 도어 프레임에 6 우물 (0.64 cm 깊이)를 작성, 나일론 도토리 너트 (0.64 cm 직경 스레드)를 포함하고 에폭시로 고정합니다. </li><li> 아크릴 고무 시트에서 4 도어 패널을 절단하고, 잠금 장치의 아크릴 고무 패널에 6 홀 (0.64 cm 직경)를 만듭니다. 실리콘 코킹을 사용하여 아크릴 및 고무 패널에 가입하세요. </li><li> 설치 아크릴 도어 프레임과 도어 패널 가입 힌지. </li><li> 마운트는 서보 모터에 팔을 스윙, (그림 1C 참조) 도어 프레임의 상단에 설치합니다. 도어 패널에 스윙 암을 연결하는 케이블 타이로 루프를 확인합니다. </li><li> 조지아의 게이트 어셈블리의 위치를PS는 곡선 벽 부분 사이에 생성 및 실리콘 코킹을 사용하여 고정합니다. </li><li> 서보 컨트롤러에 모든 서보 모터를 연결하고, 활성 USB 확장 케이블을 통해 전원과 컴퓨터에 연결합니다. 서보 제어기가 공급 제어 소프트웨어를 이용하여 게이트를 테스트한다. </li><li> 실리콘 경화 후, 나일론 나사 모든 문을 잠그고 한 번에 하나의 구획을 작성하여 수밀성을 확인합니다. </li></ol></li><li> 격리 실. 수족관을 둘러싸고 (그림 1D 참조) 빛, 소리와 전기 외부 소스의 잡음을 차단하는 분리 챔버를 구축합니다. <ol><li> 세 벽 패널 (2 MX 2 MX 5cm)와 4 도어 패널 (1.9 MX 0.95 MX 5cm)를 확인합니다. 각 패널의 경우, 사각형 프레임을 만드는 알루미늄 몰딩 (5cm X 2.5 센티미터)에 가입하고, 알루미늄 프레임에 흰색 플라스틱 골판지 패널을 리벳을 박는 다. 음향 유리 섬유 패널에서 배트, 검은 플라스틱 골판지 패널과의 긴밀한를 입력합니다.</li><li> 진동 방지 바닥에 세 개의 벽 패널을 설치하고 설치 피아노 벽 패널에있는 네 개의 도어 패널에 가입 경첩. </li><li> 알루미늄 메쉬와 분리 챔버를 둘러싸고, 지상은 패러데이 케이지 (Faraday cage)를 만드는 모든 측면에 메쉬. </li></ol></li><li> 습도 조절. 난방에서 과잉 습도 형성을 제거하기 위해 저소음 배기 팬 (그림 1 층 탑)을 설치합니다. 적어도 2m 떨어져 기록 사이트에서 배기 팬을 배치하고, 분리 챔버 및 배기 팬 사이의 에어 덕트를 설치한다. </li><li> 정기적으로 모니터링하고 수조의 물과 동물의 상태를 유지한다. <ol><li> 10cm 깊이, 100 μS / cm의 전도도 및 물이나 소금 원액 (제조법 크 누드 센 (33) 참조)에 추가하여 pH를 7.0로 일정하게 물 상태를 유지합니다. pH가 6.5 이하 인하의 경우 분쇄 된 산호의 가방을 추가합니다. </li><li> 청소를 위해 얕은 물에서 동작 할 수 있습니다 수직 수족관 필터 설치레이팅 목적으로 (그림 1 층 바닥). 필터를 분리하고 녹음 세션 동안 중앙 무대에서 그들을 가지고. </li><li> 고무줄로 흡입 컵을 부착하여 탱크의 바닥에 살아있는 밀웜을 제공합니다. 녹화 중에 부유 먹어 치우지의 제어되지 않은 먹이를 방지하기 위해 같은 blackworms 무료로 부동 먹어 치우지 않도록하십시오. </li></ol></li></ol> 2. EOD 추적 <ol><li> 전극의 설치. 중앙 무대의 곡선 벽에 여덟 흑연 전극과 동일하게 공간을 조립합니다. <ol><li> (길이 15cm, 화성 탄소 2mm 타입 HB) 리드를 그리기 입수 리드의 외부 코팅을 면도. </li><li> , 동축 케이블 (RG-174)의 8 ~ 10 센티미터 세그먼트를 잘라 흑연 막대의 한쪽 끝의 주위에 케이블 코어를 감싸 적용 열수축 강력하고 안정적​​인 전기적 연결을위한 그들에 튜브를. 양단 (그림 2A 왼쪽)에 BNC 잭 커넥터를 연결합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 테이핑에 의해 벽에 전극을 배치하고, 실리콘으로 보호하기 위해 전극 표면에 마스킹 테이프의 얇은 스트립을 적용합니다. 영구적으로 전극을 보유하고 실리콘이 굳어 (그림 2A 오른쪽)하기 전에 모든 테이프를 제거하기 위해 실리콘 코킹을 적용합니다. </li></ol></li><li> 증폭 부에 각 전극으로부터의 거리를 측정하고, 길이의 동축 케이블 (RG-54)을 절단함으로써 팔 케이블 어셈블리 빌드. 케이블의 양 끝에 BNC 플러그 커넥터를 연결합니다. </li><li> 앰프 유닛에 모든 전극을 와이어 케이블 어셈블리를 사용합니다. 차동 패러데이 케이지에 연결하여 모든 동축 차폐 선 (그림 2B 참조) 2 개의 90 ° 중심 전극을 페어링하여 증폭하고, 지상. </li><li> 신호 포화 한계 이하 증폭기 이득을 설정하고, 노이즈를 제거하는 대역 통과 필터 (200 Hz에서 -5 kHz에서)을 적용한다. (40) KS / 초에있는 4 개의 기록 전극 쌍을 디지털화. </li><li> 온라인으로신호 처리. 지침은 Spike2 소프트웨어 용으로 작성하고 매개 변수 설정은 Gymnotus의 SP에 최적화되어 있습니다. (대한 요약도 2c 참조). <ol><li> 추가 DC는 모든 녹화 채널 프로세스 (τ = 0.1 초)를 제거합니다. </li><li> 모든 녹화 채널을 조정한다 프로세스를 추가합니다. </li><li> 네 개의 기록 채널을 합산하여 가상 채널을 만듭니다. </li><li> RMS를 추가하여 EOD 펄스 당 단일 형태 봉투를 추출 (제곱 평균 제곱, <img alt="" fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50962/50962_clip_image002.gif" width="70px" /> 명백하게 펄스의 타이밍을 결정하기 위해 EOD 사이클 당 단일 피크를 생성하는 가상 채널에) 프로세스 (τ = 0.25 밀리 초). </li><li> 가상 채널로부터 realmark 채널을 생성하고 모든 EOD 펄스 WI를 캡처하는 적절한 임계 값을 설정 한 후, 시간 및 피크 진폭의 값을 기록오 탐지를 피하면서 thout는 펄스를 누락. </li><li> 순시 주파수 모드로 realmark 채널의 채널 디스플레이 옵션을 설정하여 실시간 EOD 순시 속도를 모니터한다. </li><li> realmark 채널을 복제하여 실시간 물고기 이동을 모니터링하고, 파형 모드로 디스플레이 옵션을 설정. </li><li> realmark 채널 (0.01 초 샘플링주기)에서 가상 채널을 만들어 EOD 진폭 경사의 RMS에서 활동 수준을 정량화하고, 경사 (τ = 0.25 밀리 초) 및 RMS (τ = 0.5 밀리 초) 프로세스를 추가합니다. </li><li> MATLAB 형식으로 Spike2 소프트웨어의 realmark 채널을 보냅니다. </li></ol></li></ol> 3. 동기화 된 비디오 추적 <ol><li> 배경 장면을 만듭니다. <ol><li> 매트 화이트 싱크대 필름으로 커버하여 물 표면에 반사를 캐스트 개체를 숨 깁니다. </li><li> 매트 화이트 설치카메라와 에어 벤트를 숨길 15cm 천정에서 골판지 플라스틱 패널. </li><li> 카메라를 교정하기위한 흰색 큰 종이에 인쇄 격자 패턴을, 높은 콘트라스트 배경을 제공하기 위해 탱크 아래로 놓는다. </li></ol></li><li> 광원을 설치합니다. <ol><li> 확보 IR LED 빛과 소음을 줄이기 위해 내장 된 팬을 제거합니다. 패러데이 케이지의 외부에 배치 전류 조절 DC 전원으로 LED를 구동한다. </li><li> IR은 어둠 속에서 이미징을위한 빛, 시험 물고기 낮의 빛을주기를 구동하는 백색 LED 조명을 LED 설치합니다. 간접와 균일 한 조명 (그림 3A)를 달성하기 위해 천장을 향해 직접 모든 광원. </li><li> 화이트를 구동하여 낮의 빛을주기를 조절하는 타이머 제어 스위치 (예를 들어 12 시간의 on/12이 시간 오프)와 LED 조명. </li></ol></li><li> 직접 수족관 위에 카메라를 설치합니다. <ol><li> NIR 민감한 카메라를 얻을, 또는 IR 차단 filte를 제거렌즈 조립체의 후면에 착 유리의 얇은 시트를 끊어서 R. 시야각은 이미지 전체를 중앙 무대에 충분히 넓은 있는지 확인합니다. </li><li> 천장 패널의 중간에있는 작은 시청 구멍을 확인하고 직접 구멍 위에 카메라를 배치합니다. </li><li> 광원 눈총을 생성하는 경우, 렌즈 주변에 흰색 링 가드를 설치합니다. </li></ol></li><li> 시간 동기화 비디오 녹화를합니다. <ol><li> IR은 시간 동기화 펄스 (1 밀리 초 지속 시간 10 초 동안)를 생성하기 위해 4 개의 탱크 모서리 중 하나에 LED를 배치합니다. 시리즈의 부하 제한 저항 (1 kΩ의)를 추가하고, 디지타이저 하드웨어의 디지털 출력 포트에서 IR LED를 구동한다. </li><li> 카메라를 사용할 수있는 경우와 함께 번들로 비디오 레코딩 소프트웨어를 사용합니다. 최고 기록 품질 (예 : 무손실 압축) 및 지원하는 가장 높은 해상도를 선택합니다. </li><li> 즉시 EOD 녹화 시작 전에 녹화를 시작하고 녹화를 중지 imme거립니다 EOD 녹화 후. </li><li> 녹음 후, 선형 제 신호 디지타이저 및 녹화 의해 캡쳐 최신 광 펄스 사이에 보간함으로써 디지타이저 시간 단위로 이미지 프레임 번호로 변환. </li></ol></li><li> 이미지 자동 추적 지침은 MATLAB 이미지 처리 도구 상자에 대한 기록, 그 기능을 사용하게됩니다. 사용자 정의 MATLAB 스크립트가 자동으로 이미지 추적이 제출과 함께 제공됩니다. <ol><li> 비디오를 가져옵니다. 직접 사용하여 MATLAB 작업 공간에 녹화 파일을 가져옵니다 &quot;Videoreader을. 읽기&quot;기능을. </li><li> 두 개의 영상 프레임을 결합하여 복합 배경 이미지를 만듭니다. 다른 프레임에서 같은 지역의 빈 이미지 (그림 (b) 참조) 동물에 의해 점유 된 이미지 영역을 교체합니다. </li><li> 을 제외하는 중앙 무대 주변에 원형 마스크를 그림으로써 추적 할 이미지 영역을 지정합니다REA 외부 (그림 3B 바닥), 및 강도 차이에 대한 최소 임계 값을 설정하는 상수 (R의 INT)에 의해 곱합니다. 배경 아래 - (R의 INT 1) 예를 들어, RINT을 설정하면 0.85가 강도의 변동 15 % =가 표시되지 않습니다 =. </li><li> 이미지 빼기. (= IM 0) 이미지 차이 (= ΔIM의 k)를 얻기 위해 배경 이미지에서 이미지 프레임 (= IM의 k)를 뺍니다. 음이 아닌 정수로서 이미지 세기 값을 저장하는 부호없는 정수에게 수치 정밀도를 사용한다. </li><li> graythresh 함수로부터 결정 강도 임계치를 적용하여 세그먼트 차분 영상. bwmorph 기능을 이용하여 바이너리 이미지를 닦고 regionprops 함수를 사용하는 모든 블롭 영역을 계산 한 후 동물에 대응하는 큰 블롭을 선택한다. </li><li> 중심 및 주요 방향을 결정regionprops 함수를 적용하고, x-축과 장축을 맞출 이미지를 회전함에 따라 큰 블롭의 XIS. 중심 (그림 3D 탑)의 머리와 꼬리 부분에 이미지를 나눈다. </li><li> 헤드 부분의 장축을 결정하고, x-축 (도 3d 왼쪽 아래)에 맞도록 전체 이미지를 회전한다. 머리 주위에 경계 박스를 장착하고 꼬리 부분은 regionprops 기능을 사용하여 자신의 주요 축에 평행. </li><li> 왼쪽, 중앙 및 경계 상자 (그림 3D 바닥에 녹색 점)의 오른쪽 수직 가장자리에서 덩어리의 중간 y 좌표를 결정하고, 다섯 특징점 (머리 끝, 중간 머리, 중간 몸에 할당 중간 꼬리, 꼬리 끝). </li><li> 이전 프레임에서 결정되는 동물의 중심을 중심으로 이미지 프레임을 자르기 후 연속적인 프레임을 처리합니다. </li><li> 수동 첫번째 프레임 헤드 방향을 지정하고, 내적의 betwe를 사용두 개의 연속 프레임에서 방향 벡터 도중 자동으로 헤드의 방향을 결정합니다. 결과를 점검하고 잘못 지정된 경우 수동으로 머리 방향을 플립. </li></ol></li><li> 머리 끝을 연결하여 동물의 궤도를 플롯하고, 중간, 평균 필터를 사용하여 부드럽게 (N = 3)이 흔들리는 모양이있는 경우. 배경 이미지와 궤적을 중첩하고, 오 특징점 (도 2E 참조)을 사용하여 생선 midlines 보간. </li><li> EOD 순시 레이트 (100 Hz 샘플링 레이트) 및 리샘플링 (0.0625 초 시간 창)를 평균하여 각 촬상시에 EOD 평균 속도를 계산한다. 시간이 일치 EOD 속도 결정 의사 색상의 궤도를 플롯하고, 배경 이미지 (그림 2 층 참조) 중첩. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리의 기술의 중요성. 요약하면, 우리는 먼저 대형 수족관 탱크의 건설 및 세계 경제 포럼 (WEF)에 의해 생성 된 자연 탐구 행동을 관찰하는 분리 챔버를 설명했다. 다음으로, EOD 레이트 복수의 전극 쌍을 사용하여 실시간으로 무제한 물고기에서 이동 상태를 기록하고 트래킹 기술을 보여 주었다. 마지막으로, 우리는 시간 - 동기화 된 방식으로 물을 통해 적외선 비디오 녹화 기술과 상체 위치 자세를 측정하는 이미지 추적 알고리즘을 설명했다. 실험 준비로, 세계 경제 포럼 (WEF)은 활성 electrosensory 샘플링 속도에 해당합니다 쉽게 정량화 EOD 속도를 보여줌으로써 활성 감각 유도 행동을 조사하는 중요한 이점을 제공합니다. 이러한 기술의 조합은 무제한 WEF에서 자발적 행동의 정확하고 신뢰할 수있는 장기적인 관찰 8을 사용할 수 있습니다. 더욱이, 우리 셋업 대다수 FR을 구성 할 수있다톰 건축 자재 및 쉽게 얻을 전자 부품이 널리 사용. 여기에 설명 된 기술을 개발하고 최근 몇...

배경입니다. 동물의 행동에 대한 정량 실험 (예를 들어 강제로 선택, 충격 방지, T-미로 등은.) 일반적으로, 감각 - 운동 능력에 관한 학습과 기억 형성 특정 가설을 조사하기 위해 사용된다. 그러나 이러한 제한적인 실험은 자연의 동물 행동의 풍요 로움을 많이 그리워하고 행동의 기본이되는 신경 기초의 과도하게 단순화 된 모델을 초래할 가능성이있다. 자연주의 조건에서 실험 그러므로 우리가 더욱 완벽 종의 행동 레퍼토리를 탐구 할 수있는 중요한 보완. 자유롭게 이동하는 동물을 포함하는 실험은, 그러나, 이러한 운동에 의한 기록 유물 등의 고유 한 기술적 과제를 해결해야합니다. 자극 유발 된 반응과는 달리, 저절로 발생하는 탐색 동작은 예측 될 수 없으며, 따라서 피험자는 끊임없이 모니터링하고 장기간에 걸쳐 추적한다. 특정 연구 질문은 캘리포니아N 가장 엄선 된 생물 및 사용 가능한 기술 도구에 의해 해결 될 수있다. 예를 들어, 유전자 인코딩 칼슘 센서 1 optogenetics 2와 같은 광 기록 및 자극 기술이 성공적으로 자유롭게 유전자 모델 생물 3-5를 이동하기 위해 적용되었습니다. 또한, 소형화 신경 원격 측정 시스템은 기록 할 수 및 작은 동물에게 6,7를 이동 자유롭게 자극한다. 전기 물고기. 세계 경제 포럼 (WEF)의 종은 그들의 즉각적인 환경을 감지하거나 더 먼 거리를 통해 통신 할 수 있도록 전자 오르간 방전 (EODs)를 생성합니다. EODs의 시간적 패턴은 자기 운동 8,9, 감각 자극 10, 11, 12, 13 및 사회적 상호 작용 등 다양한 조건에 따라 다릅니다. 연속 준 사인 파형을 생성하는 웨이브 형태의 종을 반대 펄스 형 WEF 종, 개별 펄스의 열차를 생산하고 있습니다. 일반적으로, 펄스 형 종 전시 MORE 변수 EOD 속도는 웨이브 형 종에 비해, 그리고 동물의 EOD 요금은 밀접하게 자신의 감각 주변 10,14의 새로운 내용을 반영합니다. 펄스 형 종은 바로 새로운 감각의 섭동 (새로운 응답 10,11,14)에 응답으로 단일 펄스주기 내 펄스 간 간격 (IPI)을 단축 할 수 있습니다. 이 물고기의 지속적인 전기 동작은 외부 소스에서 제어되지 않는 감각 자극에 의​​해 교란 될 수 있고, 진동, 소리, 전기, 빛 등의 자극의 종류는 트리거 참신 응답 알려져있다. 따라서 특별한주의는 자유 수영 세계 경제 포럼 (WEF)의 장기 관찰하는 동안 외부 감각 자극을 차단하거나 약화주의해야합니다. 이러한 방식으로, EOD 속도와 이동 궤적의 변화는 특별히 실험자 제시 자극에 기인 할 수있다. 수족관 탱크와 분리 실. 따라서 우리는 진동 흡수 재료의 여러 레이어를 배치 U개 nder 큰 수족관 탱크 (2.1 MX 2.1 MX 0.3 m), 그리고 빛, 전기 노이즈, 소리와 열 플럭스의 외부 소스를 차단하는 절연 케이스와 탱크를 포위. EOD 속도는 주위 온도 (15, 16)에 따라, 따라서 물 온도는 단단히 남미 WEF 종의 열대 범위 (25 ± 1 ℃)로 조정했다. 우리는 주로 두 가지 차원 (그림 1A)에 제한 WEF의 공간 답사의 행동을 관찰하기 위해 크고 얕은 (10cm 수심) 탱크를 건설했다. 탱크는 별도로 개별 물고기 (그림 1B)를 수용 할 수있는 중앙 공간 행동을 관찰하는 분야, 4 개의 코너 구획으로 분할했다. 각 구획은 개인 간의 전기 통신을 방지하기 위해 방수 지어졌다. 중앙 무대에 동물의 접근은 네 개의 모터 게이트에 의해 외부에서 제어되었다. 게이트는 구획 사이에 배치하고, 고정 할 때 수밀 된되었습니다나일론 윙 너트로. 세계 경제 포럼 (WEF)은 금속에 민감하게 반응하기 때문에 어떤 금속 부품은 수중 사용되지 않았다. EOD 기록. EODs은 (Mormyrids에서) 하나의 활성화 또는 17, 18 (Gymnotiforms에서) 여러 공간적으로 분산 된 전기 기관에 박힌 방식으로 생성된다. 수질 페이스 메이커는 다시 전뇌 19에서 축삭 돌기를받는 diencephalic prepacemaker의 핵으로 높은 뇌 영역에서 직접 신경 입력을 수신하기 때문에 EOD 속도의 시간적 변조는 높은 수준의 신경 활동을 공개 할 수 있습니다. 그러나, EOD 타이밍은 신중 원시 파형 기록에서 추출하여 동물의 이동에 의한 왜곡에 의해 바이어스되지해야합니다. WEF에 의해 생성 된 전계는 다이폴로서 근사화 될 수 있으며, 따라서, 기록 전극의 EOD 펄스 진폭은 동물 및 8,20 전극 사이의 상대 거리 및 방향에 의존한다. 동물의 자기 movem엔트 따라서 운동이 다른 전극의 EOD의 진폭 (6 월 등. 8도 2b 참조) 휘발성 방식으로 시간이 지남에 따라 달라질 수, 동물과 전극 사이의 상대 형상을 변경합니다. 전기 기관의 다른 세트에서 상대적 기여도가 꼬리 굽힘에 의해 도입 된 몸 길이와 그 지역의 굴곡을 따라 자신의 위치에 달려 있기 때문에 또한, 자기의 움직임도 기록 EOD 파형의 모양을 변경합니다. EOD의 진폭과 모양의 운동에 의한 왜곡이 정확하고 신뢰할 수없는 EOD 타이밍 측정을 초래할 수 있습니다. 우리는 공간적으로 상이한 위치에 기록 체류 EOD 파형을 평균화함으로써 이러한 문제를 극복하고, 정확하게 자유 수영 WEF에서 EOD 타이밍을 결정하는 포락선 추출 필터를 추가하여. 또한, 우리의 기술은 동물이 EOD의 변화에​​ 따라 휴식 또는 적극적으로 이동할지 여부를 나타내는 EOD의 진폭을 측정한다시간이 지남에 따라 진폭 (그림 2E와 2F 참조). 우리는 공통 모드 노이즈를 저감하기 위해, 기록 전극 쌍에서 차동 증폭 된 신호를 기록했다. EOD 펄스가 불규칙한 시간 간격으로 생성되기 때문에, EOD 이벤트 시계열는 가변 샘플링 레이트가있다. 선택의 분석 도구를 사용하여 필요한 경우 EOD 시간 시리즈는 보간에 의해 일정한 샘플링 레이트로 변환 할 수 있습니다. 비디오 녹화. EOD 녹화 동물의 총 운동 활동을 모니터링 할 수 있지만, 비디오 기록은 동물의 몸 위치 자세의 직접적인 측정을 허용한다. 근적외선 (NIR) 조명 (λ = 800 ~ 900 nm의)는 WEFs 어둠 속에서 가장 활성화되고 그들의 눈 NIR 스펙트럼 (23, 24)에 민감하지 않기 때문에 자유롭게, 생선 (21, 22) 수영의 교란 육안 관찰을 허용합니다. 대부분의 디지털 이미징 센서 (예를 들면 CMOS 또는 CCD)는 wavelengt과 NIR 스펙트럼을 캡처 할필터 (25)를 차단하는 적외선 (IR)를 제거한 후 800 ~ 900 나노 미터 사이의 시간 범위. 일부 하이 엔드 소비자 급 웹캠을 사용할 수 전문가 수준의 IR 카메라에 훨씬 더 큰 비용 화질을 비교, 또는 뛰어난 생산할 수있는 고화질, 넓은 시야각과 좋은 낮은 조명 감도를 제공합니다. 또한, 특정 소비자 급 웹캠이없는 품질의 손실없이 비디오를 압축하여 확장 된 녹화 시간을 허용 기록 소프트웨어와 함께 번들로 제공됩니다. 대부분의 전문가 수준의 카메라는 디지털 신호와 비디오 사이의 타이밍을 정렬하기위한 26 시간 동기화 TTL 펄스 출력 또는 트리거 TTL 펄스 입력을 제공하지만,이 기능은 소비자 급 웹캠에 일반적으로 존재합니다. 그러나, 비디오 녹화 및 디지타이저 신호 간의 타이밍을 정확하게 동시에 카메라와 신호 디지타이저 LED 주기적 점멸 IR 캡처에 의해 일치 될 수있다. 초기 및 최종 IR 펄스 타이밍이 사용될 수있다반대로 신호 디지타이저 시간 단위로 비디오 프레임 번호를위한 S 변환하고이 시간 보정 표식. 조명 및 배경. 물을 통해 캡처 이미지로 인해 물 표면에서 빛의 반사에 기술적으로 어려울 수 있습니다. 물 표면 수중 물 위의 시각적 장면, 모호한 시각적 특성을 반영하는 거울의 역할을 할 수 있습니다, 따라서 물 위의 장면은 시각적 간섭을 방지하기 위해 특색 렌더링해야합니다. 이미지 순서 전체를 수족관에서 카메라를 직접 물 위에 위치해야하고, 그것은 물 표면에 자사의 반사를 방지하기 위해 작은 구멍을 통해보기 천장 뒤에 숨겨진해야합니다. 광원이 잘못 예측 된 경우 또한, 수면은 글레어 및 불균일 한 조명을 생산할 수있다. 간접 조명은, 천정을 향해 광원을 목표로함에 따라 전체 수족관 걸쳐 균일 한 휘도를 달성 할 수 있도록 천장과 주변 WALLS 반영 물 표면에 도달하기 전에 광선을 확산 할 수 있습니다. 카메라 (예를 들어, 850 nm의 피크 파장)의 스펙트럼 반응과 일치하는 IR 조명기를 선택합니다. 광원에서 전기 노이즈가 LED 조명을 사용하고 패러데이 케이지의 외부에 자신의 DC 전원 공급 장치를 배치하여 최소화 할 수있다. 물고기는 근적외선 파장에서 흰색 배경에 잘 대비하기 때문에, 탱크 아래에 흰색 배경을 놓습니다. 마찬가지로, 분리 챔버의 내부 표면에 무광택 화이트 칼라의 사용은 균일하고 밝은 배경 조명을 제공한다. 비디오 추적. 녹화 후, 자동 화상 추적 알고리즘은 시간에 동물의 몸 위치 및 자세를 측정 할 수있다. 비디오 추적이 자동으로 하나를 바로 사용할 수있는 소프트웨어 (관점 또는 모니터 Ethovision), 또는 사용자가 프로그래밍 할 수있는 소프트웨어 (OpenCV의 또는 MATLAB 이미지 처리 도구 상자)에 의해 수행 될 수있다. 화상 트랙킹의 첫 단계로,유효한 추적 영역 (작업을 마스킹) 외부 영역을 제외 기하학적 모양을 그리기에 의해 정의 될 필요가있다. 다음, 동물의 콘텐츠를 포함하는 동물 화상으로부터 배경 화상을 감산하여 배경으로부터 분리 될 필요가있다. 감산 이미지 중심 및 배향 축이 이진 형태 학적 연산에서 계산 될 수있는 강도 임계치를 적용하여 이진 포맷으로 변환된다. Gymnotiforms 27-29 및 30-32 Mormyrids에서 electroreceptor 밀도는 헤드 영역 근처 최고이며, 따라서 임의의 순간에 헤드 위치는 높은 감각 기관의 위치를 나타낸다. 헤드와 꼬리 명소 자동 이미지 회전 및 바운딩 박스 연산을 적용함으로써 결정될 수있다. 헤드와 꼬리 단부 수동 첫번째 프레임들을 정의하고,이 연속적인 프레임을 비교에서 그 위치를 추적하는 순서에 의해 서로 구별 될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>Aquarium Construction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrically shielded floor heater</td><td>ThermoSoft Corp., IL, USA</td><td>ThermoTile</td><td>www.thermosoft.com</td></tr><tr><td>강화 유리 패널</td><td>일반</td><td></td><td>0.5 인치 두께, 수족관 건설에 사용</td></tr><tr><td>수족관 등급 실리콘</td><td>일반</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아크릴 시트</td><td>일반</td><td></td><td>0.25인치 두께, 무광택 흰색</td></tr><tr><td>천연 고무 시트</td><td>일반</td><td></td><td>0.25인치 두께</td></tr><tr><td>서보 모터</td><td>HTECHRCD Inc., 한국</td><td>HS-325HB, 180도 회전</td><td>www.servocity.com</td></tr><tr><td>서보 모터 암 마운트</td><td>HITECHRCD Inc., 한국</td><td>56362 대형 스플라인</td><td>www.servocity.com</td></tr><tr><td>서보 모터 컨트롤러(6채널)</td><td>Sparkfun</td><td>ROB-09664</td><td>Micro Maestro 6-채널 USB 서보 컨트롤러</td></tr><tr><td>액티브 USB 연장 케이블</td><td>C2G</td><td>38990</td><td>12 m USB 2.0 A 남성에서 여성 4-포트 액티브 연장 케이블</td></tr><tr><td>배기 팬</td><td>Nutone</td><td>ILFK120</td><td>www.homedepot.com</td></tr><tr><td>수직 수족관 필터</td><td>Tetra, Germany</td><td>Whisper 내부 전원 필터 - 40i</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>탱크의 pH를 증가시키는 데 사용되는 분쇄</td>된 <td>산호</td><td></td><td></td> 물</tr><tr><td><강한>EOD 녹화 설정</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>그래파이트 전극</td><td>Staedtler, 독일</td><td>화성 탄소 2-mm 타입 HB</td><td>외부 코팅 면도</td></tr> 생<tr><td>리학적 증폭기/필터</td><td>Intronix, 캐나다</td><td>2015F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>동축 케이블</td><td>일반</td><td>RG174</td><td>전극 어셈블리용</td></tr><tr><td>동축 케이블</td><td>일반</td><td>RG54</td><td>배선용</td></tr><tr><td>BNC 잭 커넥터 RG-174</td><td>Amphenol Connex</td><td>112160</td><td>전극 어셈블리용</td></tr><tr><td>BNC 플러그 커넥터 RG-54</td><td>Amphenol Connex</td><td>112116</td><td>배선용</td></tr><tr><td>신호 디지타이저 하드웨어</td><td>Cambridge Electronic Design, UK</td><td>파워 MKII 1401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>신호 디지타이저 소프트웨어</td><td>Cambridge Electronic Design, 영국</td><td>Spike 2. ver 7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Visual Tracking Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White LED light</td><td>IKEA, Sweden</td><td>DIODER 201.194.18</td><td>www.ikea.com</td></tr><tr><td>적외선 LED 조명 (850 nm)</td><td>Scene Electronics, China</td><td>S8100-60-B/C-IR</td><td>내장 팬 USB</td></tr><tr><td>웹캠</td><td>제거 Logitech Inc., CA, USA</td><td>C910</td><td>적외선 차단 필터 제거</td></tr><tr><td>전동 카메라</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Quickcam Orbit</td><td>적외선 차단 필터 제거</td></tr><tr><td>비디오 녹화 소프트웨어</td><td>Logitech Inc., CA, USA</td><td>Logitech Quickcam 소프트웨어</td><td>www.logitech.com 에서 다운로드</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks, MA, USA</td><td>2012a</td><td>이미지 처리 도구 상자</td></tr></tbody></table>

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

장기 행동 추적이 자주 발생하는 등의 천연 동물의 동작을 캡처하고 수치화 할 수 있습니다. 이러한 탐사 및 사회적 상호 작용 등의 행동은 가장 억제되지 않은, 자유롭게 행동하는 동물을 관찰하여 공부하실 수 있습니다. 약한 전기 물고기 (WEF) 디스플레이 전자 오르간 방전 (EOD)을 방출하여 쉽게 관찰 탐구와 사회적 행동. 여기서는 동기 EOD, 상체 위치 및 시간의 장기간 동안 자유 수영 WEF의 자세를 측정하는 세 효과적인 기술을 설명한다. 첫째, 우리는 빛, 소리, 진동과 같은 감각 자극의 외부 소스를 차단하도록 설계 분리 챔버의 내부 실험 탱크의 구성을 설명한다. 수족관은 네 개의 시험편을 수용하기 위해 분할 및 자동 게이트 원격으로 중앙 무대에 동물의 접근을 통제했다. 둘째, 우리는 자유롭게 WEF 수영에서 정확하고 안정적​​인 리얼 타임 EOD 타이밍 측정 방법을 설명. 동물의 신체의 움직임에 의한 신호 왜곡은 공간 및 시간 평균 처리 단계에 의해 수정된다. 셋째, 우리는 교란 야행성 동물의 행동을 관찰 할 수있는 수중 근적외선 영상 설정에 대해 설명합니다. 적외선 광 펄스는 긴 기간 동안 녹화 영상 및 생체 신호 간의 타이밍을 동기화하기 위해 사용되었다. 자동화 된 추적 소프트웨어 수생 씬 안정적 동물의 상체 위치 자세를 측정한다. 조합에서는 이러한 기술을 자유롭게 안정적이고 정확한 방식으로 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동의 장기 관찰을 가능하게합니다. 우리는 우리의 방법이 유사하게 탐색 또는 사회적 행동과 생리 신호를 관련하여 다른 수생 동물의 연구에 적용 할 수 있다고 믿는다.

EOD 추적 결과 자신의 독특한 위치와 방향 (그림 2C 상단)에서 예상대로 다른 전극 ​​쌍에서 기록 EOD 파형은 진폭과 모양에 변화. 여러 전극 쌍의 사용은 탱크 내에서 가능한 모든 위치와 세계 경제 포럼 (WEF)의 방향에 강한 신호 수신을 보장. 봉투 파형 (그림 2C 바닥, 녹색 추적)는 항상 정확하게 (= IPI -1) 펄스 간 간격과 순간 EOD 속도를 결정하기위한 신뢰할 수있는 타임 마커로 제공 EOD 사이클 당 하나의 피크를 포함. 연속 EOD의 피크에 가입 선형 보간 일정한 시간 간격 (그림 2D 탑, 블랙 추적)에서, 그리고 순간 EOD의 환율을 유사하게 일정한 시간 간격 (그림 2D 바닥, 핑크 추적)에 삽입 된 하였다. 일정 시간의 리샘플링 절차는 시간 동기화 될 용이모션 궤도 및 EOD 신호를 트위닝, 지속적으로 샘...

우리는 자유롭게 기적 감각 내부 특별히 설계된 수조의 모두 정확하고 안정적​​으로 동물의 전기 기관 방전 타이밍, 상체 위치 자세를 측정함으로써, 장기간에 걸쳐 약하게 전기 물고기 수영의 자발적 행동을 연구하기위한 기술의 집합을 설명 격리 실.

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 자유롭게 유영하는 물고기에서 생리적 신호와 영상을 동기화하여 기록함으로써 자발적인 공간 탐색을 기록하는 것입니다. 이는 감각 차단 챔버로 둘러싸인 대형 실험 수조를 구축함으로써 달성됩니다. 이어서, 전기기관 방전을 정밀하고 신뢰성 있게 측정하기 위해 다채널 전기 기록 장치를 구축합니다.적외선 비디오 카메라를 사용하여 동물의 신체 자세와 이동 경로를 동기식으로 추적합니다. 이를 통해 동물의 신체 움직임과 능동적 전기 감각 샘플링 속도 사이의 상호작용을 보여주는 결과를 얻습니다. 이 기술이 동물 구속 후 외부 자극을 통해 유발 반응을 이끌어내는 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 자유롭게 행동하는 동물의 자발적이고 자연스러운 행동을 비침습적으로 관찰할 수 있다는 점입니다.이 방법은 자기 주도적 탐색 행동 중 능동적 감지의 역할과 같은 신경병리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 자기 주도적 탐색 및 공간 학습 중에 펄스형 약전어(weekly electric fish)의 능동적 전기 감각 샘플링 역할을 조사하기 시작했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 움직임으로 인한 기록 아티팩트의 어려움과 물을 통한 조명 및 이미징과 관련된 복잡성 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.챔버는 열 구배 폼 패딩 위에 전기적으로 차폐된 가열 요소가 포함된 진동 방지 표면 위에 놓여 있습니다. 수조 탱크는 중앙 아레나와 네 개의 모서리 구획으로 구성됩니다. 각 구획은 전기 기관 방출을 추적하기 위해 모터 구동 게이트로 분리되어 있습니다.중앙 아레나의 곡면 벽에 8개의 흑연 전극을 동일한 간격으로 설치하십시오. 케이블 어셈블리를 사용하여 모든 전극을 증폭기 유닛에 연결하십시오. 서로 90도 각도로 배치된 두 전극을 짝지어 차동 증폭하십시오.모든 동축 차폐선을 패러데이 케이지(Faraday cage)에 연결하여 접지하십시오. Spike2 소프트웨어를 사용하여 신호 처리를 조정하고, 모든 기록 채널에 DC 제거(DC remove) 프로세스를 추가하십시오. 다음으로, 모든 기록 채널에 정류(rectify) 프로세스를 추가하십시오.4개의 모든 기록 채널을 합산하여 가상 채널을 생성합니다. 가상 채널에 제곱평균제곱근(root mean squared) 프로세스를 추가하여 EOD 펄스당 단봉형 엔벨로프(unimodal envelope)를 추출합니다. 다음으로, 가상

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마비된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호를 측선 신경절 근처에 마이크로피펫을 배치하고 신호 캡처를 위해 느슨한 밀봉을 형성하여 기록하는 방법을 보여줍니다. 세포외 용액은 이 과정에서 신경 세포의 생존력을 유지합니다.

고정된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호 모니터링

제브라피쉬의 개별 및 그룹을 추적할 수 있는 3D 자동 비디오 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 응용 사례로, NMDA 수용체 길항제 MK-801이 제브라피시 떼에 미치는 영향을 조사합니다.

기록 개인과 성인 Zebrafish의 떼에 자동 3D 추적 시스템을 사용하여

여기 우리는 개별적으로 시간의 긴 기간 동안 동물을 추적 하는 프로토콜을 제시. 컴퓨터 비전 사례 연구, 집, 하는 방법에 정보를 제공 하는 동시에로 랍 스타의 그룹을 사용 하 여 수동으로 생성 된 태그의 집합을 식별 하는 방법을 조작 및 표시는 랍 스타를 사용 합니다.

Cohoused 수 중 동물의 장기 비디오 추적: 노르웨이 가재 (Nephrops norvegicus)의 매일 운동 활동의 사례 연구

여기서, 우리는 DEPDC5 유전자의 일시적인 억제로 인한 간질의 제브라피시 모델의 개발 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시한다.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

여기, 선물이 멕시코 cavefish의 일련의 높은 처리량 연구 방법 행동 및 mechanosensory 시스템의 중요 한 얼룩. 이러한 방법 사용 무료 소프트웨어 및 맞춤 스크립트, 행동의 연구에 대 한 실용적이 고 비용 효율적인 방법을 제공 하.

행동 추적 및 멕시코 Cavefish의 Neuromast 이미징

이 프로토콜 운동 동작 및 멕시코 cavefish 수 면 측정 방법을 자세히 설명 합니다. 이전 분석은 사회적으로 지 내게 물고기에 이러한 행동을 측정 하기 위해 확장 됩니다. 이 시스템은 수 면과 다른 물고기 종에 있는 활동 연구에 널리 적용할 수 있습니다.

수 면과 운동 활동 멕시코 Cavefish에서의 자동화 된 측정

자유롭게 수영하는 금붕어의 뇌에서 세포 외 신경 신호를 기록하기위한 새로운 무선 기술이 제시됩니다. 기록 장치는 두 개의 테트로데스, 마이크로 드라이브, 신경 데이터 로거 및 방수 케이스로 구성됩니다. 데이터 로거와 커넥터를 제외한 모든 부품은 맞춤 제작됩니다.

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

척수 손상 후 기능적 회복이 가능한 성인 제브라피쉬는 신경 재생의 선천적 메커니즘을 밝히는 최고의 모델 시스템입니다. 여기에서는 수영 지구력과 수영 행동 분석을 척수 재생의 기능적 판독으로 설명합니다.

성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

설치류에서 제브라피시까지 다방 사회적 선호 과제가 적용되어 모델 생물의 사회적 행동 연구를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 웹캠과 오픈소스 소프트웨어를 활용한 저비용 3챔버 오픈 탱크 작업을 검증하여 제브라피시의 사회적 선호도를 측정하여 학부 연구와 교육에 접근성을 높입니다.

3개 방 개방형 수조 자유수영 과제를 이용한 제브라피시(Danio rerio)의 사회적 선호를 조사하는 저비용 대안

학습하세요 약하게 전기 생선의 자발적 공간 탐색 행동을 동기화된 전기 신호와 비디오로 기록하는 방법을. 비침습적 기법으로 자유롭게 수영하는 물고기의 자연스러운 행동을 장기간 관찰할 수 있습니다.

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

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