광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

다음 실험의 전반적인 목표는 서브 밀리초(sub millisecond) 시간 규모에서 칼슘 트랜스듀서(calcium transducers)의 리간드 결합과 관련된 구조적 변화를 특성화하는 것입니다. APO 단백질에서 칼슘 결합 단백질로의 구조적 전이는 케이지드 칼슘 화합물인 calcium DM nitro의 광분해에 의해 유도되며, 이는 유리 칼슘의 광방출로 이어집니다. 이에 따른 굴절률의 변화는 4분할 위치 민감 검출기(quadruple position sensitive detector)를 사용하여 프로브 빔의 변위로 측정됩니다.

다음으로, 시료와 참조물 모두에 대해 온도에 따른 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection) 추적선을 측정합니다. 광 빔 굴절 추적선의 복합 분석을 통해 반응 부피 및 엔탈피 변화 측면에서 칼슘으로 유도된 구조적 전환 메커니즘에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 기존의 top flow와 같은 방식에 비해 광열 빔 굴절법이 갖는 주요 장점은, 이 기술을 통해 밀리초 미만(sub millisecond)의 시간 척도에서 부피 및 엔트로피 변화를 동시에 검출할 수 있다는 점입니다.

계측기의 정밀한 정렬이 열역학적 파라미터 회복에 결정적이므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 필요합니다. 절차 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Walter Gonzalez가 진행하겠습니다. 원치 않는 언케이지징(uncaging)을 방지하기 위해 시료 준비 및 모든 시료 조작은 암실에서 수행하십시오. 본 영상에서는 촬영 목적으로 단계별 과정을 밝은 곳에서 시연합니다.

먼저 DM Nitro를 50 millimolar HEPES buffer, 100 millimolar potassium chloride (pH 7.0)에 용해하여 최종 농도를 400 micromolar로 맞춥니다. 0.1 molar stock solution에서 calcium chloride를 첨가하여 원하는 calcium 대비 DN nitro 농도 비율을 맞춥니다. 다음으로, 대조 화합물인 potassium cyanide 또는 sodium chromate를 동일한 buffer에 용해합니다.

시료의 경우, 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection)의 기본 실험 구성 도식은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 실험을 설정할 때, 온도 조절 셀 홀더에 장착된 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파시키십시오. 그런 다음 핀홀을 사용하여 프로브 빔의 직경을 1 mm로 조정하고, 시료 뒤에 두 번째 거울을 배치하여 프로브 빔이 위치 민감 검출기(position sensitive detector)의 중심에 오도록 맞추십시오.

상단 다이오드 2개와 하단 다이오드 2개 사이의 전압 차이, 그리고 검출기 좌우측 다이오드 2개 사이의 전압 차이가 0이 되도록 프로 빔을 검출기 중앙에 맞춥니다. 이어서 ND YAG 레이저의 355 nanometer 출력이 나오는 펌프 빔의 직경을 조절합니다. 2개의 355 nanometer 레이저 미러 사이에 배치된 3 millimeter 핀홀을 사용하여 펌프 빔이 vete의 중앙을 통해 공전파되도록 합니다.

두 레이저 빔이 광학 셀의 중심을 통해 거의 공선(colinear) 방식으로 전파되는 것이 중요합니다. 측정 가능한 굴절각을 얻어 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection, PBD) 신호의 진폭을 높이려면, 표준 화합물을 사용하여 프로브 빔과 펌프 빔을 정렬함으로써 신호 대 잡음비가 우수하고 장기적으로 안정적인 PBD 진폭을 갖는 만족스러운 PBD 신호를 확보하십시오. 그 후 355 nanometer 레이저 미러를 점진적으로 조정하여 프로브 빔에 대해 펌프 빔의 위치를 설정하십시오.

위치 민감 검출기(position sensitive detector)의 상단과 하단에 있는 두 개의 포토다이오드 간의 차이로 PBD 참조 신호의 진폭을 측정합니다. PBD 신호는 빠른 시간 척도에서 진폭이 급격히 증가해야 하며, 100 millisecond 시간 척도에서는 안정적으로 유지되어야 합니다. 여기 레이저 출력과 흡수된 Einstein 수에 따른 PBD 신호의 선형 의존성을 측정하여, 방출된 열에너지에 대한 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인합니다.

다광자 흡수를 방지하기 위해 레이저 출력을 약 1000 µJ 미만으로 유지하십시오. 또한, 펌프 빔 출력의 감소를 막기 위해 들뜸 파장에서 시료 또는 표준 물질의 흡광도를 0.5 미만으로 유지하십시오. 이러한 단계들을 통해 PBD 신호의 선형성을 보장할 수 있습니다.

PBD 트레이스 측정부터 시작하십시오. 대조군을 위해 대조 화합물 용액을 석영 셀에 넣고, 해당 셀을 온도 조절 홀더에 배치합니다. 16°C에서 35°C까지의 온도 범위에서 3°C의 온도 간격으로 온도에 따른 대조 PBD 신호를 검출하십시오.

온도가 변경될 때마다 위치 민감 검출기(position sensitive detector) 상의 프로브 빔 위치를 확인하고, 검출기의 중앙으로 위치를 재조정하십시오. 필요한 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBD 신호의 선형성을 확인하십시오.

그런 다음, 기준 화합물 측정 시와 동일한 방향을 유지하며 샘플 용액을 동일한 광학 셀에 넣습니다. 기준 측정과 동일한 온도 범위에서 샘플 PBD 트레이스를 검출하고, 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인합니다. 프리 트리거(pret trigger)와 포스트 트리거(post trigger) PBD 신호의 차이를 기준 PBD 신호의 진폭으로 취합니다.

유사한 방식으로 샘플 PBD 신호의 빠른 단계와 느린 단계의 진폭을 결정합니다. 기기 응답 파라미터를 제거하기 위해, 샘플 PBD 신호의 진폭을 PBD 신호의 진폭으로 스케일링합니다. 표준 시료의 경우, 표준 신호 대비 샘플 신호의 비율은 방정식을 제공하며, 이 방정식의 진폭 비율에 에너지를 곱한 값과 온도 의존 항을 플롯한 그래프의 기울기와 절편으로부터 광개시 반응과 관련된 용액으로의 열 방출 및 비열적 부피 변화를 결정할 수 있습니다. 빠른 과정과 느린 과정의 반응 부피 및 엔탈피 변화를 결정하기 위해, 관찰된 부피 및 엔탈피 변화를 적절한 양자 수율로 스케일링하십시오.

텍스트 프로토콜에 제시된 방정식에 따라, 개별 단계의 진폭과 수명은 부피 및 엔탈피 변화를 설명하는 시간 의존적 함수에 데이터를 피팅하여 분석합니다. 빠른 단계의 진폭은 시료 PBD 신호의 즉각적인 위상(prompt phase)의 진폭에 해당하며, 이후 단계의 진폭은 시료 PBD 신호의 느린 위상(slow phase)의 진폭에 해당합니다. 개별 공정의 속도 상수에 대한 온도 의존성으로부터 각 개별 공정의 활성화 엔탈피 및 엔트로피 파라미터를 IR 플롯을 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다.

calcium DM nitro로부터의 칼슘 광해리(photo release)에 대한 PBD 추적 곡선의 대표적인 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 빠른 단계는 calcium DM nitro의 광분해 및 칼슘 해리에 해당하며, 느린 단계는 광분해되지 않은 케이지(cage)에 칼슘이 결합하는 것을 반영합니다. 칼슘 광해리 시 신경세포 칼슘 센서인 downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream의 C-말단 도메인에 칼슘이 결합하는 PBD 추적 곡선이 여기에 제시되어 있습니다.

관찰된 속도 상수의 온도 의존성으로부터, 20 °C에서 광방출 리간드는 1.3 ± 0.3 ms의 시상수로 dream의 C 말단 도메인과 결합합니다. dream의 C 말단 도메인에 칼슘이 결합하기 위한 활성화 장벽은 9.2 ± 0.4 kcal/mol로 결정되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플 PBD 트레이스를 기준 시료와 동일한 조건에서 측정하는 것이 중요함을 유의하십시오.

이 영상을 시청하고 나면, 재현 가능한 열역학적 파라미터를 얻기 위한 시료 준비 방법, 기기 정렬 방법 및 데이터 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.