2014년 2월 18일
여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .
다음 실험의 전반적인 목표는 밀리초 미만의 시간 척도에서 칼슘 트랜스듀서에 대한 리간드 결합과 관련된 확인 변화를 특성화하는 것입니다. APO 단백질에서 칼슘 결합 단백질로의 확인 전이는 유리 칼슘의 광 방출로 이어지는 케이지 칼슘 화합물 칼슘 DM 니트로의 광 절단에 의해 촉발됩니다. 반사 지수의 관련 변화는 4중 위치 감지 검출기를 사용하여 프로브 빔의 변위로 측정됩니다.
다음으로, 광열 빔 편향 트레이스는 샘플과 기준 물질 모두에 대한 온도의 함수로 측정됩니다. 포토 빔 편향 트레이스의 화합물 분석은 반응 부피 및 엔탈피 변화 측면에서 칼슘 유도 확인 스위치의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 상단 흐름과 같은 기존 마스트에 대한 광열 빔 편향의 주요 장점은 이 기술을 통해 밀리초 미만의 시간 척도에서 부피 및 엔트로피 변화를 동시에 감지할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 시각적 시연은 기기의 정확한 정렬이 열역학 매개변수의 복구에 중요하기 때문에 필요합니다. 제 연구실의 대학원생인 Walter Gonzalez가 절차를 시연할 예정이며, 원치 않는 언케이징을 방지하기 위해 어두운 방에서 샘플 준비 및 모든 샘플 조작을 수행합니다. 이 비디오에서는 촬영 목적으로 조명 아래에서 단계를 보여줍니다.
시작하려면 DM 니트로를 50 밀리 몰 힙 버퍼 100 밀리 몰 염화칼륨, pH 7.0에서 최종 농도 400 마이크로 몰로 가용화합니다. 0.1 몰 스톡 용액에서 염화칼슘을 추가하여 원하는 칼슘 대 DN 니트로 농도 비율을 달성합니다. 다음으로, 기준 화합물인 시안화칼륨 또는 크롬산나트륨을 동일한 완충액에 가용화합니다.
샘플에 관해서는, 광열빔 편향에 대한 기본 실험 구성의 개략도에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 실험을 설정할 때 온도 제어 셀 홀더에 배치된 셀 중심을 통해 prob 빔을 전파합니다. 그런 다음 핀홀을 사용하여 프로브 빔의 직경을 1mm로 조정하고 샘플 뒤에 두 번째 미러를 사용하여 프로브 빔을 위치 감지 검출기의 중앙에 배치합니다.
프로빔을 검출기 중앙에 집중시켜 볼륨의 차이가tage 상단 두 다이오드와 하단 두 다이오드 사이, vol의 차이tage 검출기의 왼쪽과 오른쪽에 있는 두 다이오드 사이의 차이는 0입니다. 그런 다음 ND YAG 레이저의 355나노미터 출력인 펌프 빔의 직경을 형성합니다. 2,355 나노미터 레이저 미러 사이에 배치된 3mm 핀홀을 사용하여 펌프 빔을 VETE 중앙을 통해 공동으로 전파합니다.
두 레이저 빔 모두 거의 같은 양의 방식으로 광학 셀의 중심을 통해 전파되는 것이 중요합니다. 측정 가능한 편향 각도를 얻어 광열 빔 편향 또는 PBD 신호의 높은 진폭을 얻으려면 참조 화합물을 사용하여 프로브와 펌프 빔을 정렬하여 더 긴 시간 척도에서 우수한 신호 대 잡음비와 안정적인 PBD 진폭을 특징으로 하는 만족스러운 PBD 신호를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 355 나노미터 레이저 미러의 증분 조정을 통해 프로브 빔을 기준으로 펌프 빔을 배치합니다.
PBD 참조 신호의 진폭을 위치 감지 검출기에서 두 개의 상단 및 하단 포토 다이오드 사이의 차이로 측정합니다. PBD 신호는 빠른 시간 스케일에서 진폭의 급격한 증가를 보여야 하며 100밀리초 시간 스케일에서 안정적으로 유지되어야 합니다. 여기 레이저 출력에 대한 PBD 신호의 선형 의존성과 아인슈타인의 흡수 수에 대한 선형 의존성을 측정하여 방출된 열 에너지에 대한 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인합니다.
다중 광자 흡수를 방지하기 위해 레이저 출력을 약 1000마이크로 줄 미만으로 유지하십시오. 또한 여기 파장에서 샘플 또는 참조 화합물의 흡수도를 0.5 미만으로 유지하여 펌프 빔 출력의 감소를 방지하십시오. 이러한 단계는 PBD 신호의 선형성을 보장합니다.
PBD 트레이스 측정부터 시작합니다. 참고로, 기준 화합물의 용액을 석영 셀에 놓고 셀을 온도 제어 홀더에 배치합니다. 섭씨 3도의 온도 증가와 함께 섭씨 16도에서 35도 사이의 온도 범위에서 온도의 함수로 기준 PBD 신호를 검출합니다.
각 온도 변화에 따라. 위치 감지 검출기에서 프로브 빔의 위치를 확인하고 검출기 중앙으로 위치를 다시 조정하십시오. 필요한 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBD 신호의 선형성을 확인합니다.
그런 다음 샘플 용액을 참조 화합물에 사용된 것과 동일한 광학 셀에 배치하고 참조 측정을 위해 광학 셀의 동일한 방향을 유지합니다. 기준과 동일한 온도 범위에서 샘플 PBD 트레이스를 감지하고 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인합니다. 기준 PBD 신호의 진폭을 pret trigger와 post trigger PBD 신호의 차이로 간주합니다.
비슷한 방법으로 샘플 PBD 신호의 고속 위상과 저속 위상의 진폭을 확인합니다. 계측기 응답 파라미터를 제거하려면 PBD 신호의 진폭으로 샘플 PBD 신호의 진폭을 스케일링합니다. 참고로, 참조 신호에 대한 샘플 신호의 비율은 용액에 대한 열 방출 및 사진 시작 반응과 관련된 비열 부피 변화를 진폭 비율 플롯의 기울기 및 절편에 에너지를 곱한 값 대 온도 의존 항에서 결정할 수 있는 방정식을 제공하여 빠른 공정 규모와 느린 공정 규모에 대한 반응 부피 및 엔탈피 변화를 결정할 수 있습니다. 관찰된 부피와 엔탈피는 적절한 양자 수율로 변합니다.
텍스트 프로토콜에 있는 방정식에 따르면, 개별 단계의 진폭과 수명은 부피 및 엔탈피 변화를 설명하는 시간 종속 함수에 데이터를 피팅하여 분석됩니다. 빠른 단계의 진폭은 샘플 PBD 신호의 프롬프트 위상의 진폭에 해당하고, 후속 단계의 진폭은 샘플 PBD 신호의 느린 위상의 진폭에 해당합니다. 개별 공정에 대한 속도 상수의 온도 의존성에서 각 개별 공정에 대해 활성화 엔탈피 및 엔트로피 매개변수는 IR 플롯을 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다.
칼슘 DM 니트로에서 칼슘 광 방출에 대한 PBD 미량의 대표적인 예가 여기에 나와 있습니다. 빠른 단계는 칼슘 DM 니트로 및 칼슘 방출의 광 절단에 해당하는 반면, 느린 단계는 광이 없는 케이지에 대한 칼슘 결합을 반영합니다. 칼슘 광해리 시 뉴런 칼슘 센서 다운스트림 조절 요소 길항제, 조절자 또는 꿈의 C 말단 도메인에 대한 칼슘 연관성에 대한 PBD 추적이 여기에 표시됩니다.
사진 방출 리간드는 관찰된 속도 상수의 온도 의존성으로부터 섭씨 20도에서 1.3 플러스 또는 마이너스 0.3 밀리초의 시간 상수로 꿈의 C 말단 영역에 연결됩니다. 꿈의 C 말단 영역에 대한 칼슘 결합의 활성화 장벽은 몰당 9.2 플러스 또는 마이너스 0.4 킬로 결정되었다. 이 절차를 시도하는 동안 참조용과 동일한 조건에서 샘플 PBD 추적을 측정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
이 동영상을 시청한 후에는 시료를 준비하고, 기기를 정렬하고, 데이터를 분석하여 재현 가능한 열역학 파라미터를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 감금된 칼슘 화합물인 DM-nitrophen과 함께 광열 빔 편향 기법을 이용하여 신경 칼슘 센서의 구조적 변화 역학을 조사합니다. 주요 초점은 칼슘 결합 사건의 마이크로초 및 밀리초 규모에 놓여 있습니다.
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.