Name: 광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 배우세요 광열 편향 빔 기법을 이용하여 DM-nitrophen으로 칼슘을 방출하고 신경 칼슘 센서의 밀리초 이하 구조적 변화를 측정하는 방법을. 이 기법은 반응 부피와 엔탈피 변화를 동시에 검출하여 칼슘 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,831, JM)와 J. &amp; E. 바이오 메디컬 연구 프로그램 (건강의 플로리다학과, JM)에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 샘플 준비하고 원하지 않는 uncaging을 방지하기 위해 어두운 방에있는 모든 샘플 조작을 수행하십시오. </li><li> 50 mM의 HEPES에 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 [(옥시 카르 보닐) 메틸] -1,2 - 에탄 디아민) - (2 - 니트로 -4,5 - 디메 톡시 페닐) - DM-nitrophen ((1 가용화 버퍼, 100 ㎜의 KCl, 400 μM의 최종 농도로 pH를 7.0 (= 350 ㎚ ε 4,330 M -1 cm -1 9). </li><li> [DM-nitrophen] : [칼슘 2 +]의 바람직한 비율을 달성하기 위해 0.1 M 주식 솔루션에서 염화칼슘을 추가합니다. 10 μM보다 큰 칼슘 2 + 협회 K d의 단백질, [칼슘 2 +]의 비율 : 1:1 [DM-nitrophen는] uncaged DM-nitrophen에 사진 출시 칼슘 2 +의 바인딩을 방지하는 것이 바람직하다 . 사실, 칼슘의 90 %는 결합 단백질 ~ 10 ㎚ 및 400 ㎜로 DM-nitrophen 및 CA 2 +의 총 농도로 DM-nitrophen의 K의 D 값을 고려K d (으)로 = 10 μM은 apoform에있을 것입니다. 한편, K의 D &lt;10 μM과 단백질에 결합하는 칼슘 2 +의 연구를 위해, 그것은 [칼슘 2 +] 감소하는 것이 바람직의 :과 칼슘 2 + 착물을 방지하기 위해 0.95 [DM-nitrophen] 비를 APO- 단백질 케이지 사진 해리 사전. </li><li> 기준 화합물 K 3 가용화 [철 (III) (CN)를 6] 또는 샘플과 동일한 버퍼 나 2 CRO 4. </li></ol> 2. 실험 설정하기 <ol><li> 기본적인 실험 구성은도 2에 도시된다. </li><li> 1mm로 프로브 빔의 직경 (HE-Ne 레이저의 632 nm의 출력, ~ 5 mW의 레이저 파워)를 조정하고 온도에 배치 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파하는 핀홀 (P 2)를 사용 M 1 거울을 사용하여 셀 홀더를 통제했다. </li><li> 프로브 빔의 중심을 샘플 뒤에 거울 (M 2)를 사용하여위치에 민감한 검출기의 중심에. </li><li> 베스트 개의 다이오드와 바닥이 다이오드뿐만 아니라 감지기의 좌측 및 우측에서 두 개의 다이오드 사이의 전압 차 사이의 전압의 차이가 있음을 이러한 방식으로, 검출기의 중심에서 프로브 빔을 초점 제로. </li><li> YAG 레이저, FWHM 5 NSEC)이 355 nm의 레이저 거울 사이에 3mm의 핀홀 (P 1)를 사용 :이어서, 펌프 빔의 직경, Q-스위치의 Nd 355 nm의 출력을 형성. </li><li> 도 2에서와 같이 큐벳의 중심을 통해 펌프 빔 Copropagate. 그것은 두 개의 레이저 빔이 측정 가능한 편향 각 및 PBD 신호 따라서 높은 진폭을 구하는 것이 거의 동일 직선 방식으로 광학 셀의 중심을 통해 전파되는 것이 중요하다. 실험 조건 하에서, 프로브 및 펌프 빔의 교차 각도가 15 ° 미만이다. </li><li> 프로브 및 펌프를 정렬 기준 화합물을 사용하여더 긴 시간 척도 (~ 100 밀리 초)에서 양호한 S / N 비와 안정 PBD 진폭, 즉 만족 PBD 신호를 달성하기 위해 빔. </li><li> 355 nm의 레이저 미러의 증분 조정하여 프로브 빔에 대하여 펌프 빔의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 위치 검출기에 민감한이 상하 포토 다이오드 사이의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 측정한다. PBD 신호는 빠른 시간 규모 (&lt;10 마이크로 초)에 진폭의 급격한 증가를 나타내고 그림 3에서와 같이 100 밀리 초 척도에서 안정적으로 유지해야합니다. PDB 진폭의 총 변동성에 슛은 신호 진폭의 5 % 내에서하고 신호 재현성는 주로 진동에 의해 영향을받습니다. </li><li> 흡수 된 여기 레이저 파워 온 아인슈타인의 개수에 PBD 신호의 선형 의존성, E의 측정에 의해 방출 열 에너지에 대하여 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인= A는 여기 파장에서의 흡광도 기준에 대응한다 (1-10-A). </li><li> 레이저 아래 전력 약 1,000 μJ 및 다 광자 흡수와 각각 펌프 빔 전력의 감소를 방지하기 위해 여기 파장 0.5 미만에서 샘플 / 기준 화합물의 흡광도를 유지하고, PBD 신호의 선형성을 보장한다. </li></ol> 3. PBD 측정 <ol><li> 참조를 위해 PBD 추적의 측정으로 시작합니다. × 1.0 cm 1.0 cm 또는 1.0 cm × 0.5 cm 석영 셀에 참조 화합물의 솔루션을 배치하고 온도 조절 홀더에 셀을 배치합니다. 두 경로의 길이는 비교 PBD의 진폭을 제공한다. </li><li> 3 ° C.의 온도 증가와 함께 16-35 ° C의 온도 범위에서 온도의 함수로서 상기 기준 PBD 신호를 검출 </li><li> 각 온도 변화에 따라, 위치에 민감한 검출기에 프로브 빔의 위치를​​ 확인하고 다시필요한 경우, 검출기의 중심 위치를 조정한다. </li><li> 식 2에 따른 함수로 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어를 PBD 신호의 선형성을 확인합니다. </li><li> 참고 측량 등의 광학 셀의 동일한 방향을 유지하는 기준 화합물과 동일한 광학 셀에 시료 용액을 배치. </li><li> 참고 용으로 동일한 온도 범위 내에서 샘플 PBD 트레이스를 감지하고 [(DN / DT) / C의 P의 ρ] 용어에 대하여 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인. </li></ol> 4. 데이터 분석 편향의 크기 때문에 수학 식 1에 따라 샘플 가열 (ΔV 번째) 및 비열 적 부피 변화 (ΔV의 nonth)에 체적 변화에 정비례한다 : <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="식 (1)" /> 샘플 (S의 진폭) 및 기준 (r)로 PBD 신호는 각각 수학 식 2 및 3을 사용하여 설명 될 수있다. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="식 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="식 3" /> PBD 신호 장비 응답 매개 변수 (K)에 비례하고 아인슈타인의 수는 흡수 된 (E). 식 2의 첫 번째 항은, (DN / DT) (1/ρC의 P) Q 인해 용매에 공개 열에 신호 변화에 해당한다. DN / DT 용어 굴절률의 온도 의존성의 변화를 나타내고, ρ는 용매의 밀도이며, C는 P의 열용량이다. 모든 파라미터 증류수 알려져있다 증류수 및 적절한 버퍼 기준 화합물에 대한 PBD 신호를 비교하여 완충액에 대해 결정될 수있다. Q 열 returne의 양용매 D. ρ (DN / D ρ) 기간은 10 ~ 40 °의 C (10)로부터의 온도 범위에서 온도에 독립적 인 단위가없는 상수이다. Δn ABS 용어 인해 용액의 흡수 종의 존재에 굴절율의 변화에 대응하고, 프로브 광의 파장이 용액 중의 어떤 종의 흡수 스펙트럼에 상대적으로 시프트 된 경우에는 무시할 수이다. 기준 화합물 (R)에서 발생하는 신호는 E H는 ν는 여기 파장에서 광자 에너지 식 3으로 표현된다 E H는 ν = 80.5 만 kcal / 몰 355 nm의 여기를위한. <ol><li> 도 3에서와 같이 사전 트리거 및 포스트 트리거 PBD 신호 간의 차이로서 PBD 기준 신호의 진폭을 가지고 간다. 유사한 방식으로, 고속 (A 발 빠르게)의 진폭을 결정하고 느린 단계 (A 발 느린) 샘플 PBD 신호. </li><li> 악기 응답 매개 변수, K를 제거 기준에 대한 PBD 신호의 진폭에 의해 샘플 PBD 신호의 진폭을 확장하십시오. 기준 신호에 대한 샘플 신호의 비율은 수학 식 4를 부여하고 같이 쓸 수있다 : <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="식 4" /> </li><li> 이 방정식을 사용하여 솔루션 (Q)과 비열 부피 변화 [의 플롯의 각각 기울기와 절편,에서 사진 개시 반응과 관련된 (ΔV의 nonth) (S / R) E에 출시 된 열을 결정 H의 ν] 온도에 따라 기간 [(DN / DT) (1/ρCp)] 대 용어. </li><li> 반응 볼륨과 빠르고 느린 과정에 대한 엔탈피의 변화를 결정하는 식 5-7에 따라 적절한 양자 수율에 관찰 된 볼륨과 엔탈피 변화를 확장하려면. <img sRC = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot;고도 = &quot;식 5&quot;/&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="식 (6)" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="식 (7)" /> 동력학은 10 마이크로 초 ~ 200 밀리 초 사이의 시간 스케일로 발생으로 다단계 공정의 경우, 양 및 반응의 각 단계와 관련된 엔탈피 변화가 결정될 수있다. 각 단계에 대한 진폭 및 수명은 볼륨 및 엔탈피 변화의 시간 프로파일을 설명하는 함수 F (t)에 데이터를 피팅에 의해 분석된다. <img alt="식 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> α 0의 빠른에 해당하고 난의 느린 각각의 프로세스에 해당하는 α와 τ는 어디에서 각 반응 단계의 수명입니다. FO 속도 상수의 온도 의존성 가입일R 개별 프로세스가 활성화 엔탈피 및 엔트로피 매개 변수를 쉽게 아 이어링 플롯을 사용하여 측정 할 수있다 (내가 = 1 / τ K). </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

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광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV 번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 nonth) 발생 광화학 프로세스를 거칠 수있다 발스 양)뿐만 아니라, 전왜 효과의 결과로 분자 (들)의 전하 분포를 바꾼다. 이는 광학 다양한 방법에 의해 탐색 할 수있는 굴절율 변화가 발생하는 조명 된 부피의 급속한 확장 초래한다. PBD는 굴절률 구배는 샘플 D에 설립한다는 사실을 활용UE 가우스 모양의 레이저 펄스를, 그림 2에서와 같이 샘플을 통해 전파 프로브 빔의 편향이 발생합니다. 광열 빔...

이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 &quot;침묵&quot;처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL 5, 6 산화 효소 전자와 헴 - 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 7 크립토 8 구조적 역학의 광 이성화. 내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 2 + DM-nitrophen, 사진 - 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 2 +는 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 2 + DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한​​다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-디메톡시-2-니트로페닐)-1,2-디아미노에탄-N,N,N&#039;,N&#039; -Tetraacetic Acid</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-니트로펜, 케이지 칼슘 화합물, 광해리를 방지하기 위해 재고 용액을 어두운 곳에 보관</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime; -(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES buffer</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>PBD 측정을 위한 reference compound</td></tr><tr><td>크롬산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>PBD 측정을 위한 reference compound</td></tr><tr><td>He-Ne Laser Diode 5 mW, 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>PBD 측정을 위한 probe beam으로 사용</td></tr><tr><td>오실로스코프,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400MHz 대역</td></tr><tr><td>Nd:YAG 레이저</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>펌프 빔 PBD 측정용</td></tr><tr><td>M355; Nd:YAG 레이저 미러</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>355nm 레이저 라인</td></tr><tr><td>M1 및 M2용 레이저 미러; 레이저 다이오드 미러</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe 레이저 평면 미러, 파장 범위 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 및 P2; Iris Diaphragm</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>프로브 및 펌 빔을 형성하는 핀 구멍</td></tr><tr><td>L1; 이중 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>검출기에서 프로브 빔의 초점을 맞추기 위한 렌즈, EFL 50mm, 파장 범위 350-2,000nm</td></tr><tr><td>DM, 이색성 거울</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>차단 파장이 505nm</td></tr><tr><td>F1인 장역 통과 이색성 거울; 가장자리 필터</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>500 nm의 차단 파장을 가진 긴 패스 필터</td></tr><tr><td>온도 제어 큐벳 홀더</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. 칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 + 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ &lt;20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.

PBD의 대표적인 예는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen에서 칼슘 2 + 사진 방출에 대한 추적은 그림 3에서 볼 수 있습니다. 느린 단계는 칼슘 2 + nonphotolysed 케이지에 바인딩을 반영하는 반면, 빠른 단계는 칼슘 2 +의 DM-nitrophen 및 CA 2 + 해방의 사진 - 분열에 해당합니다. 온도 의존 인자 [C의 P의 ρ / (DN / DT)]의 함수로서 기준 화합물의 진폭을 확장 빠르고 느린 위상 샘플 PBD 진폭의 플롯 계수 수학 식 4에 따라 그리고 관찰 된 양을 스케일링 - DM-nitrophen 사진 해리의 양자 수율에 대한 해결책과 비열 부피 변화로 방출 열을 (Φ = 0.18) (11)는 식 5-7에 따라 (ΔV 빨리 = 빠른 단계에 반응 엔탈...

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 서브 밀리초(sub millisecond) 시간 규모에서 칼슘 트랜스듀서(calcium transducers)의 리간드 결합과 관련된 구조적 변화를 특성화하는 것입니다. APO 단백질에서 칼슘 결합 단백질로의 구조적 전이는 케이지드 칼슘 화합물인 calcium DM nitro의 광분해에 의해 유도되며, 이는 유리 칼슘의 광방출로 이어집니다. 이에 따른 굴절률의 변화는 4분할 위치 민감 검출기(quadruple position sensitive detector)를 사용하여 프로브 빔의 변위로 측정됩니다.다음으로, 시료와 참조물 모두에 대해 온도에 따른 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection) 추적선을 측정합니다. 광 빔 굴절 추적선의 복합 분석을 통해 반응 부피 및 엔탈피 변화 측면에서 칼슘으로 유도된 구조적 전환 메커니즘에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 기존의 top flow와 같은 방식에 비해 광열 빔 굴절법이 갖는 주요 장점은, 이 기술을 통해 밀리초 미만(sub millisecond)의 시간 척도에서 부피 및 엔트로피 변화를 동시에 검출할 수 있다는 점입니다.계측기의 정밀한 정렬이 열역학적 파라미터 회복에 결정적이므로, 이 기술에 대한 시각적 시연이 필요합니다. 절차 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Walter Gonzalez가 진행하겠습니다. 원치 않는 언케이지징(uncaging)을 방지하기 위해 시료 준비 및 모든 시료 조작은 암실에서 수행하십시오. 본 영상에서는 촬영 목적으로 단계별 과정을 밝은 곳에서 시연합니다.먼저 DM Nitro를 50 millimolar HEPES buffer, 100 millimolar potassium chloride (pH 7.0)에 용해하여 최종 농도를 400 micromolar로 맞춥니다. 0.1 molar stock solution에서 calcium chloride를 첨가하여 원하는 calcium 대비 DN nitro 농도 비율을 맞춥니다. 다음으로, 대조 화합물인 potassium cyanide 또는 sodium chromate를 동일한 buffer에 용해합니다.시료의 경우, 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection)의 기본 실험 구성 도식은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 실험을 설정할 때, 온도 조절 셀 홀더에 장착된 셀의 중심을 통해 프로브 빔을 전파시키십시오. 그런 다음 핀홀을 사용하여 프로브 빔의 직경을 1 mm로 조정하고, 시료 뒤에 두 번째 거울을 배치하여 프로브 빔이 위치 민감 검출기(position sensitive detector)의 중심에 오도록 맞추십시오.상단 다이오드 2개와 하단 다이오드 2개 사이의 전압 차이, 그리고 검출기 좌우측 다이오드 2개 사이의 전압 차이가 0이 되도록 프로 빔을 검출기 중앙에 맞춥니다. 이어서 ND YAG 레이저의 355 nanometer 출력이 나오는 펌프 빔의 직경을 조절합니다. 2개의 355 nanometer 레이저 미러 사이에 배치된 3 millimeter 핀홀을 사용하여 펌프 빔이 vete의 중앙을 통해 공전파되도록 합니다.두 레이저 빔이 광학 셀의 중심을 통해 거의 공선(colinear) 방식으로 전파되는 것이 중요합니다. 측정 가능한 굴절각을 얻어 광열 빔 굴절(photothermal beam deflection, PBD) 신호의 진폭을 높이려면, 표준 화합물을 사용하여 프로브 빔과 펌프 빔을 정렬함으로써 신호 대 잡음비가 우수하고 장기적으로 안정적인 PBD 진폭을 갖는 만족스러운 PBD 신호를 확보하십시오. 그 후 355 nanometer 레이저 미러를 점진적으로 조정하여 프로브 빔에 대해 펌프 빔의 위치를 설정하십시오.위치 민감 검출기(position sensitive detector)의 상단과 하단에 있는 두 개의 포토다이오드 간의 차이로 PBD 참조 신호의 진폭을 측정합니다. PBD 신호는 빠른 시간 척도에서 진폭이 급격히 증가해야 하며, 100 millisecond 시간 척도에서는 안정적으로 유지되어야 합니다. 여기 레이저 출력과 흡수된 Einstein 수에 따른 PBD 신호의 선형 의존성을 측정하여, 방출된 열에너지에 대한 PBD 신호 진폭의 선형성을 확인합니다.다광자 흡수를 방지하기 위해 레이저 출력을 약 1000 µJ 미만으로 유지하십시오. 또한, 펌프 빔 출력의 감소를 막기 위해 들뜸 파장에서 시료 또는 표준 물질의 흡광도를 0.5 미만으로 유지하십시오. 이러한 단계들을 통해 PBD 신호의 선형성을 보장할 수 있습니다.PBD 트레이스 측정부터 시작하십시오. 대조군을 위해 대조 화합물 용액을 석영 셀에 넣고, 해당 셀을 온도 조절 홀더에 배치합니다. 16°C에서 35°C까지의 온도 범위에서 3°C의 온도 간격으로 온도에 따른 대조 PBD 신호를 검출하십시오.온도가 변경될 때마다 위치 민감 검출기(position sensitive detector) 상의 프로브 빔 위치를 확인하고, 검출기의 중앙으로 위치를 재조정하십시오. 필요한 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBD 신호의 선형성을 확인하십시오.그런 다음, 기준 화합물 측정 시와 동일한 방향을 유지하며 샘플 용액을 동일한 광학 셀에 넣습니다. 기준 측정과 동일한 온도 범위에서 샘플 PBD 트레이스를 검출하고, 샘플 PBD 진폭의 선형성을 확인합니다. 프리 트리거(pret trigger)와 포스트 트리거(post trigger) PBD 신호의 차이를 기준 PBD 신호의 진폭으로 취합니다.유사한 방식으로 샘플 PBD 신호의 빠른 단계와 느린 단계의 진폭을 결정합니다. 기기 응답 파라미터를 제거하기 위해, 샘플 PBD 신호의 진폭을 PBD 신호의 진폭으로 스케일링합니다. 표준 시료의 경우, 표준 신호 대비 샘플 신호의 비율은 방정식을 제공하며, 이 방정식의 진폭 비율에 에너지를 곱한 값과 온도 의존 항을 플롯한 그래프의 기울기와 절편으로부터 광개시 반응과 관련된 용액으로의 열 방출 및 비열적 부피 변화를 결정할 수 있습니다. 빠른 과정과 느린 과정의 반응 부피 및 엔탈피 변화를 결정하기 위해, 관찰된 부피 및 엔탈피 변화를 적절한 양자 수율로 스케일링하십시오.텍스트 프로토콜에 제시된 방정식에 따라, 개별 단계의 진폭과 수명은 부피 및 엔탈피 변화를 설명하는 시간 의존적 함수에 데이터를 피팅하여 분석합니다. 빠른 단계의 진폭은 시료 PBD 신호의 즉각적인 위상(prompt phase)의 진폭에 해당하며, 이후 단계의 진폭은 시료 PBD 신호의 느린 위상(slow phase)의 진폭에 해당합니다. 개별 공정의 속도 상수에 대한 온도 의존성으로부터 각 개별 공정의 활성화 엔탈피 및 엔트로피 파라미터를 IR 플롯을 사용하여 쉽게 결정할 수 있습니다.calcium DM nitro로부터의 칼슘 광해리(photo release)에 대한 PBD 추적 곡선의 대표적인 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 빠른 단계는 calcium DM nitro의 광분해 및 칼슘 해리에 해당하며, 느린 단계는 광분해되지 않은 케이지(cage)에 칼슘이 결합하는 것을 반영합니다. 칼슘 광해리 시 신경세포 칼슘 센서인 downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream의 C-말단 도메인에 칼슘이 결합하는 PBD 추적 곡선이 여기에 제시되어 있습니다.관찰된 속도 상수의 온도 의존성으로부터, 20 °C에서 광방출 리간드는 1.3 ± 0.3 ms의 시상수로 dream의 C 말단 도메인과 결합합니다. dream의 C 말단 도메인에 칼슘이 결합하기 위한 활성화 장벽은 9.2 ± 0.4 kcal/mol로 결정되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플 PBD 트레이스를 기준 시료와 동일한 조건에서 측정하는 것이 중요함을 유의하십시오.이 영상을 시청하고 나면, 재현 가능한 열역학적 파라미터를 얻기 위한 시료 준비 방법, 기기 정렬 방법 및 데이터 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

고해상도 쿨롱 폭발 이미징 설정을 사용하여 분자 회전파 패킷의 실시간 동영상을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다.

레이저 기반 초고속 분자 회전의 직접 이미징

여기, 우리는 photoexcited 분자는 열에서 주위 지역 구조의 변형의 관측 시간 해결 적외선 진동 분광학 및 전자 회절의 차동 감지 분석 프로토콜 제시 액체 크리스탈, 구조와이 광 물질의 역학 관계에 원자 관점 주는.

Photoresponsive 액정의 구조 역학을 관찰을 위한 새로운 기술

시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

우리는 미세 유체 장치에서 단일 거대 분자를 고정시키고 전단 흐름하에서 적합성의 변화를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유동 환경에서 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자의 생체 역학 적 및 기능적 특성을 특성화하는 데 유용합니다.

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

다이아몬드 빔라인 I24에서 직렬 싱크로트론 결정예촬영을 위한 고정 대상 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 포괄적인 가이드를 제시합니다.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

플라즈몬 나노핀셋은 금 나노 구조에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 나노미터 규모의 광학 필드 내에서 단백질을 포함한 단일 나노 입자를 가둡니다. 산란 신호의 변화는 단백질의 존재와 구조적 역학을 드러내므로 형광단 변형이나 표면 테더링 없이 모니터링할 수 있습니다.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

배우세요 광열 편향 빔 기법을 이용하여 DM-nitrophen으로 칼슘을 방출하고 신경 칼슘 센서의 밀리초 이하 구조적 변화를 측정하는 방법을. 이 기법은 반응 부피와 엔탈피 변화를 동시에 검출하여 칼슘 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

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