Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

이 실험 과정의 전체적인 목적은 내경 20~100 µm의 폐동맥을 모사하여 저산소성 폐혈관 수축을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 폐의 기도를 저융점 agarose로 채웁니다. 두 번째 단계로 진동 절편기를 사용하여 분리된 폐를 200 µm 두께의 절편으로 자릅니다.

다음으로, 정상 산소 가스를 버블링한 37 °C의 따뜻한 배지에서 배양하여 폐 절편에서 aros를 제거합니다. 이렇게 하면 절편이 액체 내에서 천천히 이동하게 됩니다. 그런 다음 개별 폐 절편을 흐름 관통 초여과 챔버(flow through superfusion chamber)로 옮긴 후, 횡단면 동맥의 혈관 반응성에 대한 비디오 형태 측정 분석을 수행합니다.

최종적으로, 다양한 처리법에 따른 혈관 내강 면적의 변화를 평가합니다. 흉막 하 미세 혈관의 생체 내 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 분리된 근위 폐동맥의 혈관 장력을 측정함으로써 직경 20에서 100 µm 사이의 폐내 동맥의 VA 반응성을 정량적으로 분석할 수 있다는 점입니다. 실험 절차 시연은 Anna Goldenberg와 본 실험실의 기술자 두 명이 진행하겠습니다.

경추 탈구로 마우스를 안락사시킨 직후, 복강을 열고 장관 루프를 옆으로 밀어낸 다음 복부의 큰 혈관들을 절단하여 출혈을 유도합니다. 다음으로, 미세 가위를 사용하여 횡격막을 관통합니다. 이렇게 하면 흉막강으로 공기가 유입되어 폐가 허탈됩니다.

절개를 계속하여 횡격막을 하흉강구(inferior thoracic aperture)에서 분리하십시오. 이제 갈비뼈와 쇄골을 가측으로 절단하십시오. 흉곽의 복측 부분을 제거하려면 흉선을 제거하십시오.

따뜻한 관류 버퍼를 시린지에 채웁니다. 다음으로, 심장의 좌심실에 작은 구멍을 냅니다. 관류 버퍼의 유출량을 조절하고, 폐가 하얗게 보일 때까지 우심실을 통해 폐 혈관계를 천천히 관류합니다.

다음으로, 기관에서 타액선, 소근육 및 결합 조직을 제거합니다. 기관을 주변 결합 조직으로부터 분리하고, 나중에 결찰할 수 있도록 식도와 기관 사이에 바느질용 면사를 끼워 넣습니다. 그 후 마이크로 가위를 사용하여 인접한 두 기관 연골 사이의 기관 상부에 작은 구멍을 뚫습니다.

37 °C로 가온된 저융점 agarose를 시린지에 채운 후, 유연한 플라스틱 캐뉼라에 연결하고 캐뉼라 내의 공기가 제거될 때까지 플런저를 천천히 밉니다. 캐뉼라를 기관의 작은 구멍에 삽입하고 봉제용 면사로 조심스럽게 고정합니다. 그다음, 기도에 agarose를 천천히 채우며 폐를 관찰합니다.

처음에는 우폐가 팽창하기 시작하고, 이어서 좌폐가 팽창합니다. 30~40초 후면 충전이 완료되어 양측 폐가 생체 내 상황과 유사한 부피인 약 1.2~2.0 milliliters까지 팽창합니다. 성별, 연령 및 체중에 따라 다르지만, 시술 중에 응고되지 않도록 충분히 빠르게 주입하되, 폐에 손상을 줄 정도로 너무 빠르게 주입하지 않는 것이 중요합니다.

양쪽 폐가 동시에 채워지면, 플라스틱 캐뉼라를 뽑아내고 봉합사를 이용하여 기관을 결찰함으로써 고정액의 누출을 방지합니다. 이어서 결찰 부위 위쪽의 기관을 절단하고, 흉부에서 폐와 심장을 덩어리째 분리합니다. 그 후 장기들을 얼음처럼 차가운 Heap's Ringer 완충액으로 옮겨 고정액을 응고시키며, 이는 대기하는 동안 몇 분 이내에 이루어집니다. 진동 장치의 표본 홀더에 샴페인 코르크 조각을 순간접착제로 부착하여 폐 조직을 고정하는 지지대로 사용합니다. 고정액이 응고되면 각각의 폐엽을 분리합니다.

다음으로, 순간접착제를 사용하여 폐엽 하나를 시료 홀더에 고정합니다. 작은 intra asner 동맥의 횡단면을 얻으려면, 오른쪽 폐의 두정엽(cranial lobe)을 가져와 폐문(hilum) 표면이 홀더 쪽으로 향하게 하여 순간접착제로 고정합니다. 그런 다음 새 면도날이 장착된 바이브라톰(vibratome)을 사용하여 폐엽의 주변부부터 200 micron 두께의 조각으로 절단합니다. 더 큰 pre aser 동맥의 횡단면을 얻으려면, 왼쪽 폐의 폐문을 샴페인 코르크 방향과 일치시킨 후 이 방향으로 폐엽을 홀더에 접착하고, aros 제거를 위해 주변부부터 절단합니다.

장기 절편을 약 200 milliliters의 37 degrees Celsius MEM이 채워진 유리 비커로 옮깁니다. 비커를 가열 캐비닛에 넣고 정상 산소 가스를 버블링하여 폐 절편이 배지 내에서 천천히 움직이게 합니다. 약 2시간이 지나면 폐 조직에서 공기를 채우고 있던 통기성 플라크가 제거되고 절편이 비커 바닥에 가라앉게 됩니다.

폐동맥의 비디오 형태계측 분석을 위해, 현미경에 장착되어 있고 1.2 milliliters의 정상 산소 가스가 주입된 MEM으로 채워진 흐름 관통 초여과 챔버(flow through superfusion chamber)로 폐 절편 하나를 옮깁니다. 백금 링에 연결된 나일론 실을 사용하여 챔버 바닥에 폐 절편을 고정합니다. 정상 산소 가스가 주입된 배지로 챔버의 관류를 시작합니다.

10배율 대립렌즈가 장착된 위상차 현미경을 사용하여 폐 절편을 스캔하고, 내경이 20에서 100 µm 사이인 횡단면 동맥을 찾습니다. 적절한 후보 혈관이 확인되면, 20배율 대립렌즈를 사용하여 전-asner 혈관의 사진을 찍거나, 여기에서 보여주는 것처럼 40배율 대립렌즈를 사용하여 혈관 내경 측정을 위한 intra asner 동맥의 사진을 찍습니다. 실험을 시작하기 전, 전체 실험 기간 동안 1분마다 횡단면 동맥의 사진을 촬영하도록 소프트웨어를 설정하십시오.

사진 촬영을 시작한 후, 10분 동안 상온의 산소 농도(normoxic) 가스트 배지(gast medium)로 챔버의 관류를 계속합니다. 그 다음, 흐름 없이 10분 동안 폐 절편을 U 466 19에 담근 후, U 466 19에 의해 내강 면적이 최소 30% 이상 감소한 혈관만을 사용하여 동맥의 수축성을 분석합니다. 상온의 산소 농도(normoxic) 가스트 배지로 10분 동안 약물을 세척합니다.

그 다음, 10분 동안 res를 처리하여 동맥을 확장시키되 유량은 낮게 유지합니다. 다시 6 mL/min의 유량으로 정상 산소 농도의 가스 처리 배지를 사용하여 10분간 세척하여 약물을 제거한 후, 0.7 mL/min의 유량으로 10분간 더 세척합니다. 이어서, 폐 절편을 고농도 저산소 가스 처리 배지에서 40분 동안 배양합니다.

또한, 별도의 튜브 세트를 통해 저산소성 가스 혼합물을 관류 챔버의 공기층으로 흘려보냅니다. 정상 산소 가스가 포화된 배지로 20분 동안 세척하여 저산소성 배지를 제거하고, 챔버 공기층으로 유입되는 가스를 저산소성에서 정상 산소성으로 전환하여 혈관의 생존력을 확인합니다. 실험 종료 시, U 466 19를 관류 챔버에 투입하고 혈관 수축을 유도하기 위해 흐름 없이 20분 동안 배양합니다.

다른 혈관의 혈관 반응성을 측정하기 위해 새로운 폐 절편으로 이 단계들을 반복하십시오. 횡단면 처리된 동맥 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 불러와 분석을 시작합니다. 그런 다음 커서를 사용하여 혈관의 내강 면적의 외곽선을 그립니다.

혈관 벽에 부착된 혈구 등으로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 손 건조 과정이 필요합니다. 이와 유사한 방식으로 단면 영상을 계속 분석하십시오. 유동 배양 챔버(flow through incubation chamber) 내의 조건이 다른 조건으로 변경될 때마다 모든 영상을 분석해야 하지만, 조건이 변경되지 않을 때는 한 장 건너 하나씩 분석하는 것으로 충분합니다.

단면화된 기관지 근처에 위치한 단면화된 pre ASIN 동맥의 위상차 이미지에서 저산소성 폐혈관 수축을 관찰할 수 있습니다. 사진은 측정 시작 시점, 측정 종료 시점, U 466 19 처리 종료 시점, RA 노출 종료 시점, 저산소 가스 배지 내 30분 또는 40분 경과 시점, 정상 산소 가스 배지로 세척 후, 그리고 마지막으로 U 466 19를 처리한 후의 시점으로, 이는 그래프의 원형 표시로 나타나 있습니다. 혈관 반응성은 시간에 따른 단면 동맥 내강 면적의 상대적 변화로 기록되었습니다. 실험 시작 시점의 면적을 100%로 정의하며, 혈관 수축은 초기 면적에 대한 상대적 값으로 표시하였습니다.

이 사례에서는 저산소 반응을 더 명확하게 보여주기 위해 저산소증 노출 시 내강 면적이 60% 감소하도록 유도합니다. 혈관 반응성을 테스트한 실험의 초기 단계는 여기에서 생략되었으며, 산소 농도를 낮추기 직전에 얻은 값을 100%로 설정합니다. 본 연구에서 조사한 또 다른 유형의 혈관은 폐포 중격의 접합부에 위치한 ASIN 내 동맥입니다. 이러한 일련의 실험에서는 소형 ASIN 내 동맥의 저산소성 폐혈관 수축에 미치는 미토콘드리아 ATP 민감성 칼륨 채널의 비선택적 개방제인 sidal의 영향이 분석됩니다.

절편들을 저산소 배지에서 배양합니다. 50 micromolar sidal의 유무에 따라, 정상산소 gast 배지에서 대조군 배양을 수행하여 정상산소, 저산소 또는 저산소 및 sidal 처리 시의 반응을 더 명확하게 제시합니다. 정상산소 또는 저산소 gast 배지에 노출되기 직전에 얻은 값을 100%로 설정합니다. pineal에 노출된 동맥은 첨가제 없이 저산소 배지에서 배양된 동맥과 마찬가지로 면적 감소를 보이지 않습니다.

정상 산소 배지에서는 내강 면적의 변화가 감지되지 않았습니다. 50 µM sidal 처리 여부에 따른 저산소 가스트 배지에 노출된 작은 ASIN 내 arteries의 기록은 평균 ± SEM으로 표시되었습니다. 이 그래프에서는 저산소 배양 시작 시점의 값에 대한 상대적 데이터가 나타나 있습니다.

혈관 반응성이 검출되지 않습니다. 저산소 가스에 노출된 폐 슬라이스에서 U 466 19에 의해 유도된 송과체 혈관 수축을 포함하는 배지는 해당 약물에 의해 영향을 받지 않습니다. 이 영상을 시청한 후, 미러 정밀 기기를 준비하고 폐 슬라이스를 절단하는 방법과, 폐포 중격의 기저부에 위치하며 직경이 20에서 40 µm 사이인 소형 폐포 내 동맥 및 기관지와 세기관지 인근을 따라 주행하며 직경이 40에서 100 µm 사이인 더 큰 폐포 전 동맥의 혈관 반응성을 정량적으로 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.