Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

이 절차의 전반적인 목표는 내경이 20-100미크론인 미러링 폐 내 동맥의 저산소성 폐 혈관 수축을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 폐의 기도를 낮은 융점 아스로 채워서 수행됩니다. 두 번째 단계는 바이브레이터를 사용하여 고립된 폐를 200미크론 두께의 조각으로 자르는 것입니다.

다음으로, aros는 섭씨 37도의 따뜻한 매체에서 배양하여 폐 부분에서 제거되며, 이는 정상 산소 가스로 거품을 일으킵니다. 따라서 섹션은 유체에서 천천히 움직입니다. 그런 다음 개별 폐 절편을 초융합 챔버를 통한 흐름으로 이동한 다음 단면 동맥의 혈관 반응성에 대한 비디오 형태 측정 분석이 수행됩니다.

궁극적으로, 다양한 처리에 대한 반응으로 혈관의 내강 면적의 변화가 평가됩니다. 흉막하 미세혈관의 생체 내 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 고립된 근위 폐동맥의 혈관 장력을 측정하는 데 있어 직경이 20에서 100마이크로미터 사이인 폐동맥의 VA 반응성을 정량적으로 분석할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Anna Goldenberg와 이 실험실의 두 명의 기술자가 맡을 것입니다.

경추 탈구로 생쥐를 죽인 직후, 복강을 열고 장 루프를 옆으로 옮기고 큰 복부 혈관을 절단하여 출혈을 유발합니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 횡격막을 관통합니다. 이로 인해 공기가 흉강으로 유입되어 폐가 붕괴됩니다.

하부 흉곽 구멍에서 횡격막을 분리하기 위해 계속 절단하십시오. 이제 갈비뼈와 쇄골을 옆으로 자릅니다. 흉곽의 복부 부분을 제거하려면 흉선을 제거하십시오.

주사기에 따뜻한 관류 완충액을 채웁니다. 그런 다음 심장의 좌심실에 작은 구멍을 뚫습니다. 관류 완충액의 유출을 조정하고 폐가 하얗게 보일 때까지 우심실을 통해 폐혈관 구조를 천천히 관류합니다.

다음으로 기관에서 타액선, 소근육 및 결합 조직을 제거합니다. 주변 결합 조직에서 기관을 분리하고 나중에 결찰을 위해 식도와 기관 사이에 재봉 솜 조각을 삽입합니다. 그런 다음 마이크로 가위를 사용하여 인접한 두 개의 기관 연골 사이의 기관 상부에 작은 구멍을 자릅니다.

주사기에 섭씨 37도의 따뜻하고 낮은 융점 아그로를 채운 후 유연한 플라스틱 캐뉼라에 연결하고 캐뉼라에서 공기가 제거될 때까지 플런저를 천천히 밀어 넣습니다. 캐뉼라를 기관의 작은 구멍에 삽입하고 재봉 솜으로 조심스럽게 제자리에 고정합니다. 다음으로, 기도를 아로스로 천천히 채우고 폐를 관찰합니다.

처음에는 오른쪽 폐가 확장되기 시작하고 왼쪽 폐가 확장됩니다. 30-40초 후에 충전이 완료되고 양쪽 폐가 생체 내 상황과 유사한 부피(약 1.2-2.0밀리리터)로 팽창됩니다. 성별, 연령, 체중에 따라 난장미를 충분히 빨리 주입하여 시술 중에 굳지 않도록 하는 것이 중요하지만 폐를 손상시킬 정도로 빠르지 않도록 하는 것이 중요합니다.

폐가 동시에 채워진 후 플라스틱 캐뉼라를 꺼내고 재봉솜으로 기관을 결찰하여 아로스의 누출을 방지합니다. 그런 다음 합자 위의 기관을 절단하고 흉부에서 폐와 심장을 분리하고 장기를 얼음처럼 차가운 더미 링거 버퍼로 옮겨 아그로를 응고시키며, 이는 기다리는 동안 몇 분 이내에 발생합니다. 슈퍼 접착제를 사용하여 샴페인 코르크 조각을 바이브레이터의 표본 홀더에 부착하여 폐 조직의 비뚤어진 백 역할을 합니다.아그로스가 응고된 후 개별 폐엽을 분리합니다.

다음 슈퍼 접착제, 표본 홀더에 하나의 로브. 작은 아스너 내 동맥의 단면을 얻으려면 오른쪽 폐의 두개엽을 채취하여 주변에서 잘라낸 새 면도날이 장착된 비브라토를 사용하여 폐엽을 200미크론 두께의 조각으로 자릅니다. 더 큰 pre aser 동맥의 단면을 얻으려면 왼쪽 폐의 hilum을 샴페인 코르크에 정렬하고 이 방향으로 엽을 홀더에 붙인 다음 aros를 제거하기 위해 주변에서 잘라냅니다.

장기 절편을 섭씨 37도의 약 200밀리리터로 채워진 유리 비커로 옮깁니다. MEM은 비커를 가열 캐비닛에 넣고 정상 산소 가스로 거품을 일으켜 폐 부분이 매체에서 천천히 움직이도록 합니다. 약 2시간 후, 공기를 채우고 있는 아로스 플라크가 폐 조직에서 제거되고 절편이 비커 바닥에 가라앉을 것입니다.

폐 내 동맥의 비디오 형태 분석을 위해 현미경에 장착되고 1.2ml의 정상 산소 가스로 채워진 초융합 챔버를 통해 하나의 폐 절편을 흐름으로 옮깁니다. 메모리. 챔버 바닥의 폐 부분을 백금 고리에 연결된 나일론 끈으로 고정합니다. normoxic gassed medium으로 챔버를 관류하기 시작합니다.

10 x 대물렌즈가 있는 위상차 현미경을 사용하여 내경이 20 - 100미크론인 횡단면 동맥의 폐 단면을 스캔합니다. 합리적인 후보 혈관을 찾으면 20 x 대물렌즈를 사용하여 아스너 전 혈관의 사진을 찍거나 여기에 표시된 것처럼 40 x 대물렌즈를 사용하여 혈관의 내경을 측정하기 위해 아스너 내 동맥의 사진을 찍습니다. 실험을 시작하기 전에 전체 실험 동안 1분마다 단면 동맥의 사진을 찍도록 소프트웨어를 설정합니다.

사진 촬영을 트리거한 후 10분 동안 정상 산소 가스 매체로 챔버의 관류를 계속합니다. 그런 다음 U 466 19의 폐 부분을 흐름없이 10 분 동안 목욕시켜 내강 면적이 30 % 이상 감소 된 혈관만을 사용하여 동맥의 수축성을 분석합니다 U 466 19. 10분 동안 normoxic gast 매체로 약물을 씻어냅니다.

그런 다음 흐름이 낮지 않은 상태에서 10분 동안 res를 적용하여 동맥을 확장하십시오. 다시 말하지만, 분당 6 밀리리터의 유속으로 정상 산소 가스 매체로 10 분 세척 한 다음 분당 0.7 밀리리터의 유속으로 10 분 동안 약물을 제거합니다. 다음으로, 폐 절편을 고저산소 가스 배지로 40분 동안 배양합니다.

또한 저산소 가스 혼합물을 추가 튜브 세트를 통해 관류 챔버의 공역으로 흐르게 합니다. 정상 산소 가스 매체로 20분 세척하여 저산소 매체를 제거하고 저산소 기체에서 정상 산소 기체 흐름으로 챔버의 공역으로 전환하여 용기의 생존 가능성을 확인합니다. 실험이 끝나면 U 466 19를 관류 챔버에 적용하고 혈관 수축을 유도하기 위해 흐름없이 20 분 동안 배양합니다.

새로운 폐 절편으로 이 단계를 반복하여 다른 혈관의 혈관 반응도를 측정합니다. 단면 동맥의 이미지를 이미지 분석 프로그램에 로드하여 분석을 시작합니다. 그런 다음 커서를 사용하여 용기의 광도 영역을 윤곽을 그립니다.

손 건조는 예를 들어 혈관 벽에 부착된 혈액 세포로 인한 인공물을 피하기 때문에 필요합니다. 비슷한 방식으로 횡단면 이미지를 계속 분석합니다. 유동 배양 챔버의 한 조건이 다른 조건으로 변경될 때 모든 이미지를 분석해야 하지만 조건이 변경되지 않는 경우 다른 모든 이미지를 분석하는 것으로 충분합니다.

저산소성 폐 혈관 수축은 단면 기관지에 매우 근접하게 달리는 단면 ASIN 전 동맥의 위상차 이미지에서 관찰할 수 있습니다. 사진은 U 466 19를 사용한 측정 시작 시 측정 종료 시 그래프에 원으로 표시된 시점에서, 저산소 가스 매체에서 30분 또는 40분 후 RA에 노출된 종료 후, 정상 산소 가스 매체로 세척한 후, U 466 19 혈관 반응성의 최종 적용 후 반응성은 단면의 내강 면적의 상대적 변화로 기록됩니다 시간에 대한 동맥. 실험 시작 부분의 면적은 100%로 정의되고 혈관 수축은 초기 면적에 상대적인 값으로 제공됩니다.

이 경우, 저산소증에 노출되면 저산소 반응이 더 명확하게 나타나기 위해 내강 면적이 60% 감소합니다. 혈관 반응성을 테스트한 실험의 초기 단계는 여기에 표시되지 않았으며 감소된 산소에 노출되기 직전에 얻은 값은 100%로 설정되어 있습니다.이 연구에서 조사된 다른 유형의 혈관은 폐포 중격의 거싯에 위치한 ASIN 내 동맥입니다. 이 일련의 실험에서는 미토콘드리아 A TP 민감성 칼륨 채널의 비선택적 개방제인 시달(sidal)이 작은 아스너 내 동맥의 저산소성 폐 혈관 수축에 미치는 영향을 분석합니다.

슬라이스는 저산소 배지에서 배양됩니다. 50마이크로몰이 없거나 없는 경우, 시달 제어 배양은 정상 산소 또는 저산소증 또는 저산소증과 시달에 대한 반응을 보다 명확하게 나타내기 위해 정상 산소 가스 배지에서 수행됩니다. 정상 산소 또는 저산소 가스 매체에 노출되기 직전에 얻은 값은 100%로 설정됩니다.송과체에 노출된 동맥은 첨가제 없이 저산소 배지에서 배양된 동맥과 마찬가지로 면적 감소를 나타내지 않습니다.

정상 산소 매질에서는 발광 영역의 변화를 감지할 수 없습니다. 50마이크로몰 시달이 있거나 없는 저산소성 가스 매체에 노출된 작은 ASIN 내 동맥의 기록은 SEM을 더하거나 뺀 값으로 표시됩니다. 이 그래프에서는 저산소 배양 시작 부분의 값과 관련된 상대 데이터가 표시됩니다.

혈관 반응성은 검출할 수 없습니다. 저산소성 가스에 노출된 폐 절편에서, U 466 19에 의해 유도된 송과체 혈관 수축을 포함하는 배지는 약물의 영향을 받지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 거울 정밀도를 준비하고, 폐 절편을 절단하고, 폐포 격막 가스에 위치한 직경이 20-40마이크로미터 사이인 작은 아시나 내 동맥과 직경이 40-100마이크로미터 사이인 더 큰 아테나 이전 동맥의 VA 반응성을 정량적으로 측정하는 데 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. Bronchi와 Bronchioli에 인접 해 있습니다.