세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포
2013년 10월 28일
세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포 ( 룩스) 자율적으로 빛을 생산하고 있습니다. 화학 물질에의 노출에 따라 결과 발광 역학은이 세포에게 쉽게 높은 처리량 자동화에 적용 할 수있는 저렴하고, 연속, 실시간 독성 검사 도구를 만드는 세포의 성장과 신진 대사에 치료 효과를 반영하기 위해 입증되었습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 지속적인 실시간 세포 독성 모니터링을 위해 발광 인간 세포를 자율적으로 사용하는 것입니다. 이는 먼저 활발하게 성장하는 충분한 수의 자동 생물 발광 세포를 확보함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 동일한 수의 세포가 다중 웰 플레이트의 개별 웰에 파종됩니다.
다음으로, 세포는 다양한 농도에 걸쳐 관심 화합물로 처리됩니다. 마지막 단계에서는 호환 가능한 기기를 사용하여 생물 발광 신호를 측정합니다. 궁극적으로, 생물 발광 출력 역학은 세포의 대사 활성에 대한 테스트 화합물의 효과를 입증하는 데 사용할 수 있습니다.
곤충이나 해저 종에서 분리한 루시페라아제를 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 샘플 파괴나 기질 추가가 필요하지 않다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 학부생인 James Webb이 될 것입니다.관심 생물 발광 세포를 적절한 배양 배지에서 80% 합류점으로 성장시킨 후 세포가 플라스크에서 분리될 때까지 섭씨 37도에서 세포를 부드럽게 소용돌이치는 다음 트립신 눈으로 PBS에서 세포 배양액을 세척합니다. 그런 다음 PBS에 재현탁 세포를 수집하여 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 실온 및 소생에서 300Gs에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 후 세포 수를 측정합니다.
펠릿을 신선한 예열 배지에 현탁시킨 다음 동일한 수의 세포를 불투명한 다중 웰 플레이트 플레이트의 개별 웰에 파종한 다음 음성 대조군으로 한 세트의 삼중 웰에서 동일한 부피의 배지를 단독으로 파종합니다. 그런 다음 3 개의 세포 웰을 관심있는 실험 화합물에서 대조군으로 처리하지 않고 적절한 실험 농도의 세포에 직접 3 배로 남겨 둡니다. 실험적 처리 직후, 이미지 획득 및 생물 발광 측정을 위해 적절한 기기의 이미징 챔버에 플레이트를 놓습니다.
그런 다음 각 판독값에 대해 적절한 통합 시간을 설정하고 24시간 동안 15분마다 생물 발광을 측정합니다. 마지막으로, 적절한 호환 소프트웨어를 사용하여 각 웰에서 관심 영역을 식별합니다. 각 실험 샘플의 생물 발광 강도를 정량화하려면 광 출력을 초당 광자로 표시하여 총 플럭스를 설명하거나 Ceridian당 제곱센티미터당 초당 광자로 표시하여 각 샘플의 평균 광도를 보여줍니다.
이 연구에서는 항생제 노출에 대한 반응으로 24시간 동안 자동 생물 발광 HEC 2 9 3 세포의 역학을 지속적으로 모니터링했습니다. DNA를 두 개씩 결합하고 쪼개서 살아있는 세포를 죽이는 것으로 알려진 Blio Mycin 계열의 구성원인 이 항생제의 독성 효과는 처리되지 않은 세포에 비해 생물 발광 생산이 감소하여 입증되었으며, 이는 의사 색상 이미지를 통해 직접 시각화할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 HEC 2 9 3 세포의 생물 발광 특성으로 인해 다양한 처리 조건에서 샘플의 반복적인 병렬 스크리닝이 가능하여 주어진 시점에서 다양한 실험 처리 농도를 비교하여 쉽게 용량 반응 분석을 수행할 수 있습니다.
예를 들어, 이 그래프에서, 15, 18 또는 20시간의 처리 후 세포가 생성한 생물 발광을 첨가된 실험 화합물의 농도에 대해 그래프로 표시했으며, 이는 항생제 처리를 증가시키면 용량 의존적 방식으로 세포에 의한 생물 발광 생산이 감소한다는 것을 보여줍니다. 이 비디오에 제시된 기술은 급성 독성 효과를 추적하는 데 적합하지만, 판독 사이의 표준 배양 조건에서 배양을 유지하면서 증가된 시간 간격으로 세포를 반복적으로 이미징하여 느리게 작용하거나 장기적인 독성을 평가하도록 조정할 수 있습니다.
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개요
이 연구는 세포독성의 지속적이고 실시간 모니터링을 위해 생물발광 인간 세포의 사용을 시연합니다. 생물발광 신호를 측정함으로써 연구자들은 다양한 화합물에 대한 세포의 대사 활동을 평가할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 생물발광
- 독성 스크리닝
배경
- 포유류 세포는 세균 생물발광 유전자를 발현할 수 있습니다.
- 이러한 세포는 대사 상태를 반영하는 자율적인 광을 생성합니다.
- 실시간 모니터링은 전통적인 방법에 비해 이점을 제공합니다.
- 이 접근법으로 고처리량 자동화가 가능합니다.
연구 목적
- 실시간 세포독성 모니터링 방법을 개발합니다.
- 생물발광 출력을 세포 건강의 지표로 활용합니다.
- 화합물의 고처리량 스크리닝을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 활발하게 성장하는 생물발광 인간 세포를 얻습니다.
- 동등한 수의 세포를 다공판 플레이트에 뿌립니다.
- 다양한 농도의 화합물로 세포를 처리합니다.
- 호환 가능한 기기를 사용하여 생물발광 신호를 측정합니다.
주요 결과
- 생물발광 동태는 처리 효과와 상관관계가 있습니다.
- 세포 성장과 대사를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.
- 이 방법은 비용 효율적이며 자동화에 적합합니다.
- 결과는 고처리량 응용 가능성을 보여줍니다.
결론
- 생물발광 인간 세포는 독성 스크리닝에 효과적입니다.
- 이 방법은 세포 반응의 지속적인 모니터링을 제공합니다.
- 이는 독성학 연구자들에게 유망한 도구를 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Autonomously bioluminescent mammalian cells enable continuous, non-destructive monitoring of cytotoxicity, addressing the high cost and time burden of traditional destructive assays. This approach supports real-time metabolic readouts that improve predictive confidence in early target validation and lead identification by linking compound exposure to cellular health dynamics. The method’s compatibility with existing imaging infrastructure and automation potential enhances scalability for enterprise R&D workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time correlation of bioluminescent output with cellular metabolism and growth.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing a biosentinel readout that reflects adverse effects on cell viability without sample destruction.
- Predictive Value: Facilitates dose-response analysis and mechanistic de-risking by allowing repeated measurements across concentrations and time points.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing stable, autonomous light-producing cell lines.
- Reproducibility: Ensures consistent quantitative outputs through normalized seeding and controlled environmental conditions.
- Scalability: Enables parallel sample processing across multiwell plates using standard imaging equipment, supporting high-throughput compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant monitoring from discovery through preclinical stages by tracking metabolic adaptation to toxicant exposure.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by linking bioluminescent dynamics to cellular health thresholds observed in dose-response curves.
- Biomarker Alignment: Uses light emission as a functional biomarker of metabolic state, enabling correlation with phenotypic outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification, where real-time cytotoxicity monitoring informs compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking bioluminescent signal changes to compound-induced metabolic disruption.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible signal measurement over time, enabling reliable comparison of treatment conditions.
- Analytics: Provides quantitative flux and radiance readouts that allow teams to assess cytotoxicity kinetics and potency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining viable cells for longitudinal monitoring, reflecting in vivo-like metabolic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform adaptable to multiple targets and compound classes across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through continuous, label-free metabolic tracking.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility by eliminating reagent addition and sample destruction steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling reuse of samples and reducing consumable costs in cytotoxicity screening.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering early metabolic liability data that supports go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and stable transfection to maintain lux-expressing lines.
- Depends on access to low-light imaging equipment capable of photon-counting bioluminescence detection.
- Necessitates standardization of seeding density, incubation conditions, and measurement intervals across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to primary or non-human cell lines with varying transfection efficiency.
- Limited by the metabolic dependence of the signal, which may not capture non-metabolic cytotoxic mechanisms.
