Name: 세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 학습하세요 자율적 바이오루미네슨트 인간 세포를 이용한 지속적 실시간 세포독성 모니터링 방법을. 이 기술은 대사 활성을 측정하여 화합물의 독성을 평가하며, 고처리량 자동화 스크리닝에 효과적입니다.

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이러한 연구 노력은 화학, 생물, 환경, 보너스 번호 CBET-0853780 및 CBET-1159344 및 건강의 국립 연구소, 환경 건강 과학 국립 연구소 (NIEHS)에 따라 전송 (CBET) 시스템의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부문에 의해 지원되었다 보너스 번호 1R43ES022567-01, 그리고 국립 암 연구소, 보너스 번호 CA127745-01에 따라 암 이미징 프로그램에 따라. 이 연구에서 사용 된 IVIS 루미나 계기는 미국 육군 국방 대학 연​​구 계측 프로그램에서 얻은 것입니다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 액체 질소 냉동 재고 발광 HEK293 세포의 병을 복구하고 Dulbecco의 수정 이글의 10 % 태아 소 혈청과 보충 배지 (DMEM), 0.01 mM의 불필요한 아미노산, 1X 항생제 항진균 및 T 0.01 밀리미터 나트륨 피루브산에서 그들을 성장 37 75 조직 배양 플라스크 ° C와 5 % CO 2. 참고 : 미디어 및 보조 구성 요소는 세포 라인에 따라 달라질 수 있으므로 그에 따라 선택해야합니다. </li><li> 새로 고침 중간마다 도달 할 때까지 2~3일 ~ 80 % 합류. 참고 : 필요한 세포의 양이 실험 설계를 기반으로합니다. 필요한 경우, 더 많은 세포를 계대 배양하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 테스트를 위해 수확 세포. <ol><li> 매체를 제거하고 인산염 세포를 씻어 부드럽게 플라스크를 소용돌이 후 폐기 PBS를 소비하여 식염수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 2 분 동안 37 ° C에서 트립신과 부화를 추가또는 셀 때까지 플라스크에서 분리했다. </li><li> PBS에서 분리 된 세포를 수집하고 깨끗한 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 참고 : nonadherent 세포 라인을 원심 분리하여 별도의 셀을 사용하고 PBS로 한번 세척하는 경우. </li></ol></li><li> hemacytometer 또는 다른 세포 계수 시스템을 사용하여 전체 세포 수를 결정합니다. </li><li> 5 분 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 신선한 prewarmed 매체에 세포를 resuspend을. </li><li> 불투명 멀티 웰 플레이트의 각 우물에 세포의 씨앗 같은 수. 이 예에서는, 플레이트 5 × 10 블랙 24 - 웰 플레이트의 각 웰에 1 ML 볼륨에서 5 세포. 판 세중 우물에서 매체의 동일한 볼륨은 대조군 역할을합니다. 참고 : 각 우물에서 도금 세포의 수는 유연하고 개별 실험 최적화 할 수 있습니다. 각 발광 세포 라인에 대한 실험적 세포 수와 biolumi 사이의 관계를 결정nescent 출력뿐만 아니라, 최소 검출 셀은 이전의 모든 독성 시험을 계산합니다. 표준 이미징 조건에서 인구 크기의 넓은 범위 (예를 들어, 1 개의 10월 3일부터 1일까지 X 10 6 세포)에 걸쳐이, 측정 생물 발광을 할 수 있습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로 시험 화합물 (들)과 세포를 치료. </li></ol> 2. 화학 준비 <ol><li> 농축 원액으로 테스트되고있는 화학 물질을 준비합니다. 이 예에서는 100 ㎎ / 블레오 마이신 계열의 항생제의 ML 주식 솔루션을 사용합니다. 참고 : 유기 용매가 화학 물질 추가하기위한 수단으로 사용하는 경우 특히, 잠재적 인 차량 기반의 독성을 최소화하기 위해, 그것은 주식 농도가 적어도 1,000 배에서 원하는 포스트 응용 프로그램의 농도 것이 좋습니다. </li><li> 직접 세포에 준비된 화학 주식을 추가합니다. 이 예에서는, 복용량 최종 100 농도, 200, 300, 그리고 트라이에서 400 ㎍ / ㎖에서 관심 항생제우물 plicate. 컨트롤로 치료 세포의 세 개의 우물을 남겨주세요. 참고 : 대상 화학 물질의 최종 농도는 특정 실험 목표에 따라 선택해야합니다. 농도의 넓은 범위는 일반적으로 독성 효과의 전체 스펙트럼을 얻기 위하여 시험된다. </li></ol> 3. 이미징 및 데이터 분석 <ol><li> 즉시 화학 물질뿐만 아니라 다음, 이미지 수집 및 생물 발광 측정에 적합한 기기의 이미징 챔버에 접시를 놓습니다. </li><li> 각 읽기 10 분 통합 시간을 사용하여 24 시간 동안 측정 생물 발광은 매 15 분. 참고 :이 예제에 사용되는 적분 시간 당 플레이트 기준이며, 선택의 다른 luminometers를 사용하여 각도 단위로 측정 조정할 수 있습니다. 통합 시간은 선택한 발광 세포 라인에 따라도 조정할 수 있습니다. 생물 발광은 세포 파괴 나 외부 자극없이 자율적으로 제작되고 있기 때문에 읽기INGS는 특정 실험 목적을 달성하기 위해 원하는 시점에서 찍은 수 있습니다. </li><li> 호환 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 식별하여 각 우물에서 발광 강도를 정량화. 하나 광속 (광자 / 초) 또는 각 샘플의 평균 래디언스 (광자 / CM / 초 2 / steridian)와 같은 광 출력을 표시합니다. </li></ol>

<ol><li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+really+FDA+approved%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FDA+Consumer+Health+Information%22%5BJournal%5D)">Is it really FDA approved?</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicology+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+cell+culture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+human+ADME%2FTox+drug+properties+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li>
<li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li>
<li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
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<li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+%28lux%29+in+a+mammalian+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441(2010).</li>
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<li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li>
<li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+8371%2C+Sensing+Technologies+for+Global+Health%2C+Military+Medicine%2C+Disaster+Response%2C+and+Environmental+Monitoring+II%3B+and+Biometric+Technology+for+Human+Identification+IX%22%5BJournal%5D)">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li>
<li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase%2C+firefly+luciferase%2C+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).</li>
</ol>

DM 닫기, SA RIPP 및 GS Sayler 490 생명 공학, 주식 회사의 설립자 및 소유자이다

이 방법은 살아있는 세포가 지속적으로 자신의 일생을 통해 모니터링 할 수 있습니다 체외 독성 스크리닝 검사에서와 같은 자율적으로 발광 포유 동물 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 유연하고 필요에 따라 특정 실험 조건에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 실험은 급성 독성을 추적에 적합 여기서 제시하지만, 반복적으로 증가 시간 간격 (예 : 매 24 시간)에서의 영상 간의 표준 배양 조건에서 세포를 유지하여 천천히 연기 또는 장기 효과를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 독서. 또한, 통합 시간은 발광 세포 라인에 따라 조정할 수 있습니다. 다양한 통합 시간과 영상의 예비 실험은 최적의 읽기 창을 결정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 예제에 사용 된 10 분 통합은 모든 트리트 걸쳐 발광 생산의 동적 범위를 강조하기 위해 선택되었다T 조건은, 그러나 짧은 독서 프레임은 애플리케이션에 따라 적용 할 수 있습니다. 24 - 웰 플레이트이 예제에서는 데모에 사용...

그들은 식품 의약청 (Food and Drug Administration) 소비자의 사용이 승인되기 전에 미국에서, 인간의 소비를위한 의약품 및 기타 제품은 광범위한 평가를 필요로합니다. 이 테스트를 수행하기위한 재정 부담이 크게 소비자를위한 비용 증가로 새로운 화합물을 개발하기 때문에 번역의 비용을 증가 개발자 1에 배치됩니다. 이 검사 전통적으로 많은 인간의 호스트에 대한 프록시 역할을하는 동물의 과목을 활용했지만,이 (독극물 / ADME 흡착, 분배, 대사, 배설 및 독성에 연간 소요 추정 2,800,000,000달러로, 큰 재정 부담이 될 입증되었습니다 ) 단독 심사 2과 동물 모델을 안정적으로 인간 학적 반응에게 3 예측할 수없는 것을 제안 증거 확보. 따라서 체외 인간의 세포 배양 기반의 테스트 때문에 상대적으로 지난 20 년 동안 인기를 얻고있다비용, 높은 처리량, 그리고 인간의 생체 이용률 및 독성 4의 좋은 표현입니다. 현재 셀 문화 기반의 독성 스크리닝 방법은 세포 생존에게 5을 평가하기 위해, 세포막의 무결성을 프로빙, 또는 미토콘드리아 활동의 수준을 추적, 내생 가능한 세포질 효소의 활동을 심사, 이러한 ATP 수준의 측정 등 다양한 엔드 포인트를, 고용 6. 측정함으로써 단일 시점의 데이터를 생성, 촬영하기 전에 그러나,에 관계없이 선택된 엔드 포인트의이 방법은 모든 시료의 파괴​​를 필요로합니다. 결과적으로 많은 양의 샘플은 준비 및 기본 독성 동력학 연구를위한 병렬 처리, 다시 새로운 화합물 개발에 필요한 비용과 노동력에 추가해야합니다. 또한, 사용 분석은 Gaussia 루시 페라 제 7 Vargula 루시 페라 제 8 및 Metridia 루시 페라 제 9과 루시 페라 분비세포 용해에 대한 필요성을 제거하고 엔드 포인트 측정을위한 미디어의 일부만을 필요로하지만, 이들은 여전히​​ 일정 시간 지점에서 샘플링을 제한하고 또한 외생 빛을 활성화 기판의 추가를 필요로하는 개발되었습니다. 필요한 샘플 파괴의 손해뿐만 아니라 기판의 비용을 제거하기 위해를 방지하기 위해, 인간의 세포 라인은 비슷합니다 살아있는 세포를 지속적으로 모니터링 할 수 있도록 전체 세균의 생물 발광 (LUX) 유전자 카세트 (luxCDABEfrp) 표현하는 설계되었습니다 형광 염료 기반의 라이브 셀 이미징하지만, 추가 광자 활성화 및 현미경 조사 절차없이. 이 세포주 따라서 시료의 파괴​​를 방지, 구조적으로 외부 자극에 대한 필요없이 지속적 직접 검출을위한 광 신호를 생성 할 수 있습니다. 기작이 세포에서 생성되는 발광 신호가 발생의 luxAB 구성된 루시 페라 제 효소는 감소 리보플라빈 인산염의 존재 (FRP 유전자에 의해 FMN에서 재활용 FMNH 2의 긴 사슬 지방산 알데히드 (내생 기판을 사용하여 luxCDE 유전자 산물에 의해 합성 및 재생)의 산화를 촉진시 제품)와 산소 분자 10. 숙주 세포에있는 럭스 카세트의 발현 따라서 생산 세포의 파괴 또는 외인성 기판 추가하지 않고 감지 할 빛을 수 있습니다. 마찬가지로, 럭스 유전자와 내생 사용할 수 FMN, 및 O 2 cosubstrates 및 FMNH 2 FMN의 변환을 지원 할 수있는 환경의 정비에 대한 요구 사이의 상호 작용 결과 생물 발광 신호가 단지 생활에서 감지 할 수 있도록 , 대사 활성 셀. 이러한 요구 사항은 이전에 해당 럭스-BAS를 보여 악용되었습니다ED 발광 출력은 세포 인구 크기 11 그 독성 화합물에 노출 용량 - 반응 패션 12 autobioluminescent 생산을 저해와 강하게 연관시킵니다. 여기에서 우리는 독성 테스트를위한 autobioluminescent 포유 동물 세포의 응용 프로그램을 확인하는 대표적인 예로 알려진 DNA 손상 활동 블레오 마이신 계열의 항생제의 자동 독성 스크리닝을 보여 이전에 특징 autobioluminescent 인간의 배아 신장 (HEK293) 세포 라인 (11)을 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>IVIS Lumina</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>다른 IVIS 모델 및 PMT 기반 플레이트 리더도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Living Imaging 2.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>이 소프트웨어의 최신 업데이트를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>75 cm2 세포 배양 처리 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture treated plates</td><td>Costar</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>블랙 24웰 플레이트</td>: <td>Greiner Bio-One</td><td>662174</td><td>96 또는 384웰 플레이트는 처리량이 높은 응용 분야에 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Hyclone</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 페놀 레드가 없는</td><td>Hyclone</td><td>SH30284</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH3091003</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential 아미노산, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨, 100mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin, 100mg/ml</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, 0.05%</td> <td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

포유류 세포 기반 생체 분석에 널리 독성 연구를위한 동물 실험의 대안으로 채택되었지만 인해 반딧불 루시 페라 기반 검사 방법의 파괴 특성에 필요하게되는 병렬 샘플 준비의 높은 금융 및 시간 비용으로 인해 제한되어있다 . 이 비디오는 그 화합물의 세포 독성 효과를 모니터링하기위한 저렴하고 손쉬운 방법으로, 루시페린 기판의 파괴적인 추가를 필요로하지 않는 자율적으로 발광 포유 동물 세포의 활용을 설명합니다. 안정적 전체 세균의 생물 발광 (luxCDABEfrp) 유전자 카세트를 표현 포유 동물 세포는 자율적으로 광 신호를 생성하는 외부 에너지 원, 또는 전통적 시료의 파괴에 의한 비용과 가능한 간섭 루시페린 기판, 여기의 첨가없이 490 nm에서 피크 광학 이미징 절차 동안 수행의. 외부 자극으로부터이 독립 결과 신호 만 활성화 신진 대사 감지 될 것을 의미, 전적으로 셀 발광 반응을 유지하기위한 부담을 배치합니다. 발광 생산의 변화가 세포의 성장과 신진 대사에 악영향을 나타내는 때문에이 특성은 럭스 발현 세포주 세포 독성 효과에 대한 biosentinel로 사용하기위한 최상의 후보합니다. 마찬가지로, 필요한 샘플 파괴의 자율적 인 성격과 부족은 독성 물질 노출의 기간 동안 실시간으로 동일한 샘플의 반복 이미징을 허용하고 자동화 된 방식으로 기존 영상 장비를 사용하여 여러 샘플을 통해 수행 할 수 있습니다.

본 연구에서는 autobioluminescent HEK293 세포의 역학은 항생제 노출 (그림 1)에 대한 응답으로 24 시간 동안 지속적으로 감시 하였다. 에 바인딩하고 DNA 13 쪼개서 살아있는 세포를 죽이는 것으로 알려져 블레오 마이신 가족의 구성원이 항생제의 독성 효과는 사색 이미지를 직접 시각화 할 수있는 치료 세포에 비해 발광 생산 감소를 통해 입증되었다 (그림 2). 다양한 처리 조건 하에서 시료의 반복 병렬 검사를 허용 이러한 세포의 autobioluminescent 성격은 쉽게 용량 - 반응 분석을위한 어떤 주어진 시점에서 서로 다른 농도의 비교를 허용했다. 예를 들어, 생물 발광은 증가하고 항생제 치료 resul로 보여주는 그림 3에서 화학 물질의 농도에 대하여 플롯되고, 15 일 이후 세포에서 18 시간, 치료의 20 시간을 시간을 생산용량 - 반응 방식으로 발광 생산의 감소 테드. <p ...

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포 (<em&gt; 룩스</em&gt;) 자율적으로 빛을 생산하고 있습니다. 화학 물질에의 노출에 따라 결과 발광 역학은이 세포에게 쉽게 높은 처리량 자동화에 적용 할 수있는 저렴하고, 연속, 실시간 독성 검사 도구를 만드는 세포의 성장과 신진 대사에 치료 효과를 반영하기 위해 입증되었습니다.

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

본 절차의 전반적인 목적은 발광 인간 세포를 자율적으로 사용하여 지속적이고 실시간으로 세포독성을 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 활발하게 성장하는 자가 발광 세포를 충분한 수로 확보합니다. 두 번째 단계에서는 동일한 수의 세포를 멀티웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.다음으로, 다양한 농도 범위의 관심 화합물을 세포에 처리합니다. 마지막 단계에서는 호환 가능한 기기를 사용하여 생물 발광 신호를 측정합니다. 최종적으로, 생물 발광 출력 역학을 통해 테스트 화합물이 세포의 대사 활동에 미치는 영향을 입증할 수 있습니다.곤충이나 해양 생물에서 분리한 루시페라아제를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 샘플을 파괴하거나 기질을 추가할 필요가 없다는 점입니다. 시연자는 학부생인 James Webb입니다. 적절한 배양 배지에서 목적하는 생물 발광 세포를 80% 밀도(confluence)까지 배양한 후, PBS를 사용하여 부드럽게 흔들어 세포 배양물을 세척하고, 세포가 플라스크에서 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 트립신 처리하십시오. 그런 다음 PBS로 재현탁된 세포를 수집하여 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 세포 수를 계산하여 확인하십시오. 세포 현탁액을 상온에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하고 재현탁하십시오.펠렛을 미리 데워둔 신선한 배지에 부유시킨 후, 불투명한 멀티웰 플레이트의 각 웰에 동일한 수의 세포를 분주하며, 음성 대조군으로 하나의 3중 웰 세트에는 배지만을 동일한 부피로 넣습니다. 그다음 세 개의 웰에 있는 세포는 대조군으로 처리하지 않은まま로 두고, 관심 있는 실험 화합물을 적절한 실험 농도로 3중으로 세포에 직접 처리합니다. 실험적 처리를 마친 직후, 이미지 획득 및 생물 발광 측정을 위해 플레이트를 적절한 장비의 이미징 챔버에 넣습니다.그런 다음 각 측정값에 맞는 적절한 적분 시간을 설정하고, 24시간 동안 15분 간격으로 생물 발광을 측정합니다. 마지막으로, 적절한 호환 소프트웨어를 사용하여 각 웰에서 관심 영역을 지정합니다. 각 실험 샘플의 생물 발광 강도를 정량화하려면, 전체 플럭스를 나타내기 위해 초당 광자 수로 광출력을 표시하거나, 각 샘플의 평균 복사도를 나타내기 위해 Ceridian당 제곱센티미터당 초당 광자 수로 표시합니다.본 연구에서는 항생제 노출에 반응하는 자가 생물 발광 HEC 2 9 3 세포의 역동성을 24시간 동안 지속적으로 모니터링하였습니다. 두 개의 DNA에 결합하여 이를 절단함으로써 살아있는 세포를 사멸시키는 것으로 알려진 Blio Mycin 계열의 이 항생제가 나타내는 독성 효과는, 처리하지 않은 세포와 비교하여 생물 발광 생성량이 감소하는 것을 통해 입증되었으며, 이는 의사색(pseudocolor) 이미지를 통해 직접 시각화할 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, HEC 2 9 3 세포의 생물 발광 특성 덕분에 다양한 처리 조건 하에서 샘플의 반복적인 병렬 스크리닝이 가능하며, 임의의 시점에서 서로 다른 실험 처리 농도를 비교하여 용량 반응 분석을 용이하게 수행할 수 있습니다.예를 들어, 이 그래프에서는 15, 18 또는 20시간 처리 후 세포에서 생성된 생물 발광을 첨가된 실험 화합물의 농도에 따라 도식화하였으며, 이는 항생제 처리량을 늘리면 용량 의존적 방식으로 세포의 생물 발광 생성이 감소함을 보여줍니다. 이 비디오에서 제시된 기술은 급성 독성 효과를 추적하는 데 적합하지만, 측정 사이의 배양 상태를 표준 배양 조건으로 유지하면서 시간 간격을 늘려 세포를 반복적으로 이미징함으로써 서서히 나타나는 독성이나 장기 독성을 평가하는 데 응용할 수 있습니다.

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Biology

생물학

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

생물 발광 영상은 종양과 전이를 지역화 잘 알려진 도구이지만, 이러한 이미지의 정량화는 종종 복잡한 계산 및 특정 장비를 필요로한다. 우리는 더 계산을 요구하지 않으며, 종양 부담과 치료 반응이 마우스 모델에서 관찰 할 수 있도록 정확한 획득 상태에 기초하여, 사용하기 쉬운 luminoscore 방법을 설명한다.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

학습하세요 자율적 바이오루미네슨트 인간 세포를 이용한 지속적 실시간 세포독성 모니터링 방법을. 이 기술은 대사 활성을 측정하여 화합물의 독성을 평가하며, 고처리량 자동화 스크리닝에 효과적입니다.

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

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