Name: 생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 생분해성 폴리머 입자를 쥐의 사타구니 림프절에 직접 주사하는 방법을. 이 기술은 백신 효능을 향상시키고 림프절 미세환경에서 면역 반응을 정밀하게 제어할 수 있습니다.

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이 작품은 PhRMA 재단과 메릴랜드 대학, 대학 공원에서 연구 및 학자 상에 의해 부분적으로 투자되었다. 대럴 어바인 교수님은 "보조 방출 폴리머 입자의 내막 주입을 통해 림프절 미세 환경의시투 엔지니어링"의 완료에 수행된 초기 작업을 지원해 준 것에 대해 감사드립니다. 5

이 프로토콜의 모든 동물 연구는 연방, 주 및 지역 지침에 따라 완료되었으며 메릴랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)가 검토하고 승인 한 프로토콜을 사용했습니다.
1. 지질 안정화 마이크로 및 나노 입자의 합성
<ol><li>7ml 유리 바이알(s)에서 DOPC, DSPE-PEG 및 DOTAP 지질을 60:20:20 의 어금니 비율로 결합하여 마스터 지질 믹스를 준비합니다.<ol>
<li>단일 샘플을 합성하기 위해: 242.9 μl, 287.4 μl 및 71.9 μl, DOPC, DSPE-PEG 및 DOTAP의 71.9 μl을 각각 2ml 유리 세로지컬 파이펫을 사용하여 바이알로 옮김합니다.</li>
		<li>여러 샘플을 합성하기 위해: 위의 각 지질 부피를 샘플 수로 곱하고 단일 유리병으로 결합한 다음 이 지질 혼합물의 동일한 알리쿼트를 각 샘플에 대응하는 바이알로 전달하여 제조합니다.</li>
		<li>10 분 동안 질소 가스의 부드러운 스트림에서 건조 지질, 또는 하룻밤 진공 오븐에 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일, 빈 20 ml 유리 유리병에서, 16 mg /ml 폴리머 스톡 솔루션을 생성하기 위해 각 입자 샘플에 대한 디클로로 메탄의 5 ml에 PLGA의 80 mg을 용해.</li>
	<li>30초 동안 말린 지질, 캡 및 소용돌이를 포함하는 바이알(s)에 5 ml의 폴리머 용액을 넣습니다.</li>
	<li>미세 입자를 합성하려면 다음을 수행합니다.<ol>
<li>초음파 처리를 사용하여 12 W에서 폴리머, 지질 및 기타 용해화물을 포함하는 유기 상을 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 500 μl의 증류된 H2O 또는 펩타이드, 단백질 또는 기타 수용성 화물1 mg을 함유한 H2O를 추가하여 물 오일(w/o) 에멀젼을 생성합니다.</li>
		<li>얼음에 12 W에서 30 초 동안 초음파 를 계속, 부드럽게 완전한 유화를 보장하기 위해 초음파 처리기 팁 주위에 위아래로 나란히 유리병을 흔들.</li>
		<li>150ml 비커에 40ml의 H2O에 w/o 에멀젼을 부어 물-인-오일 인 워터(w/o/w) 에멀젼을 만듭니다.</li>
		<li>디지털 균질화제를 사용하여 16,000 rpm에서 3 분 동안 균질화하십시오.</li>
		<li>마그네틱 스터드 바를 추가하고 비커를 교반 판에 옮기고, w/o/w 에멀젼을 사용하여 밤새 저어서 과도한 용매를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나노 입자를 합성하려면 다음을 수행하십시오.<ol>
<li>14W에서 고분자, 지질 및 기타 용해가 얼음 위에 불용성화물을 함유하는 유기 상을 초음파 처리하기 시작합니다.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 증류된 H2O의 500 μl 또는 펩타이드, 단백질 또는 기타 수용성 화물 1 mg을 함유한 H2O를 추가하여 w/o 에멀젼을 생성합니다.</li>
		<li>얼음 에 14 W에서 30 초 동안 초음파 를 계속.</li>
		<li>150ml 비커에 40mlH2O로 w/o 에멀젼을 붓고 얼음 위 16W에서 5분 동안 초음파 처리하여 w/o/w 에멀젼을 만듭니다. 유리병을 초음파 처리기 끝 주위로 위아래로 흔들어 완전한 유화를 보장합니다.</li>
		<li>마그네틱 스터드 바를 추가하고 플라스크를 교반 판에 옮기고 w/o/w 에멀젼을 사용하여 밤새 저어서 과도한 용매를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 주 아침, 입자를 씻고 수집합니다.<ol>
<li>40 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 50ml 원문 튜브에 에멀젼을 붓습니다.</li>
		<li>원심분리기 입자는 5,000 x g에서 5분 동안 또는 나노 입자의 경우 24,000 x g에서 5 분 동안.</li>
		<li>C2O 1 ml에서 다시 중단하여 입자를 세척하여 열수 체상 및 세척 입자.</li>
		<li>중단된 입자를 1.5ml 마이크로센심심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
		<li>원심분리기는 5,000 x g에서 5분 동안 또는 나노입자의 경우 24,500xg에서 5분 동안 입니다.</li>
		<li>1ml H2O로재차폐하고 1.6.5단계에서와 같이 원심분리를 하여 입자를 두 번 더 세척합니다. 세척 후, 즉시 사용하기 위해 1 ml H2O로입자를 일시 중단하거나, 확장 된 저장을 위해 lyophilize.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 합성 수율 측정
<ol><li>빈 20ml 유리 유리 바이알을 미리 무게. 마이크로파이프를 혼합한 후 100μl의 파티클 서스펜션을 미리 계량된 바이알에 추가합니다.</li>
	<li>입자를 lyophilize하거나 질소의 부드러운 스트림에서 건조.</li>
	<li>말린 폴리머를 함유하는 바이알의 무게를 측정합니다. 말린 입자를 포함하는 유리병의 질량으로부터 유리병의 원래 중량을 빼서 유리병의 입자 수율을 결정한다.</li>
	<li>유리병에 있는 입자 질량을 희석 계수에 곱하여 전체 입자 수율을 결정합니다. 백분율 수율을 확인하려면 파티클 질량을 최대 이론적 입력 질량으로 나누고 100%씩 곱합니다.</li>
</ol>3. 입자 크기의 결정
<ol><li>제공된 큐벳 스타일의 유리 분획 셀을 탈온화 된 물로 채우고 면에 기울인 면봉으로 닦아 서 청소하십시오. 증류된H2O 10ml를 세척된 진영 셀로 옮기고, 마그네틱 마이크로 스터디 바를 추가하고, 분획 셀을 입자 크기 분석기의 셀 마운트에 로드합니다.</li>
	<li>입자 분석기의 자기 교반 속도를 조정하여 분획 셀에서 완전한 혼합을 달성하고 구획 도어를 닫습니다.</li>
	<li>기기 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 레이저를 분수 셀에 정렬합니다.</li>
	<li>계측기 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 증류된 H2O만 포함하는 분수 셀로 기준선 판독값을 기록합니다.</li>
	<li>원래 파티클 서스펜션을 마이크로피펫으로 위아래로 피펫하여 혼합합니다.</li>
	<li>분획 셀내입자 서스펜션(일반적으로 약 0.5 mg)의 파이펫 10 μl. 셀에 추가된 입자 샘플의 부피가 계측기 소프트웨어 인터페이스에 표시된 대로 적절한 범위에서 신호 강도를 생성하기에 충분함을 보장합니다. 필요한 입자의 실제 질량은 백분율 수율과 입자 샘플의 광학 특성에 따라 달라집니다.</li>
	<li>PLGA의 굴절률 1.60을 사용하여 입자 크기 분석기 구획 도어를 닫고 입자 크기를 측정합니다.</li>
	<li>소프트웨어 인터페이스를 사용하여 숫자 기준을 사용하여 파티클 직경을 계산합니다.</li>
</ol>4. 파티클의 시각화
<ol><li>파이펫 입자 서스펜션을 마이크로피펫으로 위아래로 섞어 섞습니다. 입자 현탁액을 탈온화 물에 1 mg/ml로 희석합니다.</li>
	<li>희석된 입자 현탁액의 3μl을 추가하고 거품 형성을 피하기 위해 45° 각도로 커버슬립을 장착하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 각 형광화물에 적합한 필터 세트를 사용하여 현미경 단계와 이미지에 슬라이드를 배치합니다.</li>
</ol>5. i.LN용 마우스 준비. 주사
<ol><li>트레이서 염료 솔루션 준비:<ol>
<li>증류된 H2O 10ml로 10 mg의 염료 분말을 용해하여 트레이서 염료의 0.1%(w/v) 용액을 준비합니다.</li>
		<li>0.2 μm 주사기 필터를 사용하여 염료 용액을 유리 바이알로 살균합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사 하루 전에 IACUC 승인 된 동물 프로토콜에 따라 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 마취의 깊이를 평가하기 위해 발가락 핀치 반사 테스트를 수행하고 호흡 속도를 모니터링하여 분당 약 100-140 호흡의 호흡 속도를 보장하십시오.</li>
	<li>마우스가 마취되는 동안 클리퍼를 사용하여 꼬리와 뒷분기의 기지에서 머리를 면도합니다. 동물의 복부 측에서 머리카락을 제거하고 뒷다리(엉덩이)의 관절 바로 위에 있는 등쪽으로 모발을 제거합니다.</li>
	<li>트레이서 염료를 주입합니다.<ol>
<li>각 염료 주입에 대해 마이크로 파이펫을 사용하여 10 μl의 염료 용액을 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 전체 10 μl을 1ml 주사기에 부착된 31G 바늘로 흡인합니다.</li>
		<li>모발이 잘린 꼬리 베이스의 양쪽에 10 μl의 염료 용액을 피하하여 주사 사이에 재장전하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면 봉면을 통해 순한 탈모 크림을 발라 남은 모발을 제거합니다. 뒷허벅지와 복부 사이에 부위를 코팅하십시오.</li>
	<li>3 분 동안 피부에 배양 하는 데 필기 크림을 허용 합니다. 인큐베이션 후, 젖은 장갑을 낀 손을 따뜻한 H2O로 부드럽게 피부에 문질러 주세요.</li>
	<li>따뜻한 H2O로 장갑을 낀 손을 적시고 꼬리 베이스와 뒷분기를 문지르면 즉시 디필 크림을 제거하십시오. 과도한 탈모가 제거될 때까지 반복하여 자극을 피하기 위해 손을 젖게 하십시오.</li>
	<li>부드러운 천이나 종이 타월을 따뜻한 H2O로 적시고 마우스의 하부를 닦아 마우스에서 잔류 증실을 제거합니다. 마우스의 마모 나 피부 손상을 방지하기 위해 마찰 운동을 피하십시오.</li>
	<li>마우스가 열램프 아래에서 회복되어 들고 있는 상태로 돌아갈 수 있도록 합니다.</li>
</ol>6. i.LN. 입자 의 주입
<ol><li>다음 날, IACUC 승인 된 동물 프로토콜에 따라 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취.</li>
	<li>각 잉구인 림프절에 트레이서 염료의 배수를 확인하기 위해 마우스를 검사합니다. 림프절은 뒷허벅지와 복부 근처의 어두운 반점으로 볼 수 있어야합니다.</li>
	<li>입자 사출 솔루션 준비:<ol>
<li>원하는 사출 농도에서 증류된 H2O의 입자를 재중단합니다. 각 주입에 대해 마이크로 파이프를 사용하여 입자 용액 10 μl을 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.</li>
		<li>전체 10 μl을 1ml 주사기에 부착된 31G 인슐린 바늘로 흡입합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입자 용량 주입:<ol>
<li>LN을 시각화한 후 엄지 손가락, 검지 손가락 및 가운데 손가락을 사용하여 LN 주변의 피부를 조여 피부 도발을 당기고 사출 볼륨의 조절 된 배치를 허용합니다.</li>
		<li>피부에 90° 각도로 바늘로 LN에 접근하고 염색된 LN을 통해 피부를 1mm 깊이로 침투합니다.</li>
		<li>전체 볼륨을 천천히 주입합니다. 주사 하는 동안, 눈에 보이는 LN 확대에 의해 주사를 확인 하는 피부를 통해 LN 볼륨을 관찰.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스가 열램프 아래에서 복구하고 보류로 돌아가거나 추가 테스트를 수행하도록 허용합니다.</li>
</ol>관련 분석기술(예를 들어, 히스토로지, 유동 세포측정)의 경우, 조브 항 265, 1743 및 3054 및 현재 의정서를 면역학,장 5 및 2115-22를참조하십시오.

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</ol>

이 기사의 생산 비용과 액세스 비용은 HORIBA, 주식 회사가 부분적으로 후원했습니다.

이 프로토콜에 기술된 기술은 LNs와 LN 상주 항원 제시 세포에 백신의 통제된 납품을 허용합니다. 생체 재료 캡슐화화물은 LN 내에서 국소화될 수 있으므로 LN 마이크로 환경에 전달되는 하나 이상의 화물의 용량을 조작할 수 있습니다. 중합체 입자로부터의 국소화 및 제어 방출은 기존의 접근법보다 훨씬 낮은 용량으로 강력한 세포 및 유머 면역 반응을 생성하는 것으로 나타났다. 또한, 생체 물질 캐리어 크기의 조작을 통해, 세포 처리의 1차 모드는 더 큰 미세입자5로부터나노입자 또는 세포외 화물 방출의 직접 통풍구 사이에서 변조될 수 있다. 이러한 결과는 치료 백신 전달을 위한 플랫폼으로서 i.LN. 생체 재료 전달의 타당성을 확립한다.
에멀젼/용매 증발에 의한 PLGA 입자의 합성은 약물 전달 응용분야(23,24)에널리 사용되고 있다. 따라서 이 기술과 관련된 잠재적인 과제는 주로 LN 표적 사이트에서 백신의 성공적인 식별 및 증착과 관련이 있습니다. 트레이서 염료를 사용하면 표적 잉구인 LN의 시각화를 용이하게 하지만 피부 아래의 표적 크기와 깊이는 작습니다. 따라서, 저자는 쥐의 준비 및 주사를 연습하기 위한 시간과 마우스를 할당하는 것이 좋습니다. 동물제제(즉, 면도 및 탈취의 적용) 복부와 다리의 각도가 클리퍼로 인한 부상을 입기 쉬운 동물의 복부 측에 마우스를 자르지 않도록 주의해야 한다. 또한, 모든 증조물은 동물이 정상적인 그루밍 동작 중에 크림을 섭취하지 못하도록 따뜻한 물로 제거해야합니다. LN 주사를 연습하기 위해, 더 높은 트레이서 염료 농도를 투여하고 동물을 안락사시킬 수 있으며, 그 후 여러 번 주입할 수 있다. 다음 주사 마우스는 부검될 수 있고 주입된 동물로부터의 LNs의 크기는 주입되지 않은 대조군 LN과 비교될 수 있다. 이 기술의 한 가지 제한은 LN 구조에 로드할 수 있는 사출 부피의 물리적 한계입니다. 우리의 프로토콜은 마우스에 있는 10 μl의 주사 부피를 건의합니다, 그밖 연구 결과는 적어도 20 μl만큼 더 큰 주입 볼륨을 보고했더라도.13, i.LN을 통해 백신의 직접 납품은 극적인 복용량 을 절약할 수 있도록 극적인 복용량-스파링을 허용하므로 이러한 백신의 기능은 일반적으로 부피 제약에 의해 제한되어서는 안됩니다.
언급했듯이, 입자의 물리적특성(즉, 크기)을 변경하는 것은 LN 조직에서 생체 재료 및 캡슐화 된 화물에 의해 유도 된 경로 또는 결과를 변경하는 효과적인 메커니즘입니다. 에멀젼/용매 증발 프로토콜은 표면 전하 또는 기능, 생분해/화물 방출률(23,24)과같은 물리적 또는 화학적 특성을 변경하도록 쉽게 수정할 수 있다. 예를 들어, 방출 운동학은 대체 폴리머 조성물을 통해 튜닝될 수 있으며, 표면 기능은 수정된 지질 조성물 또는 폴리(비닐 알코올)를 사용하여 변경될 수 있다. 입자에 적재된 화물은 표적 병원균에 대해 다른 항원 또는 보조제를 포함하도록 쉽게 조작될 수 있다. 이 접근법의 장점은 i.LN. 납품과 생물 재료의 화물의 로컬 제어 방출을 통해 달성됩니다. 이 시너지 효과는 분 복용량을 사용하여 감소 비특이적 / 전신 부작용으로 적응 면역 반응을 효율적으로 생성하기 위해 악용 할 수있는 플랫폼을 설정합니다.

림프절(LNs)은 면역 계통의 명령 센터입니다. 이 면역학적 부위에서, 항원 제시 세포는 세포 및 유머 면역 반응을 활성화하기 위해 특정 외국 항원에 대한 naïve 림프구를 주요 제시한다. 따라서 LN은 백신 및 면역 요법의 납품을 위한 매력적인 표적이 되었습니다. 불행히도, 대부분의 백신 전략은 림프조직1에항원 및 보조제의 비효율적이고 일시적인 전달을 초래한다. 따라서 LN에서 백신 성분의 표적화 및 보존을 개선하는 접근법은 새로운 백신의 효능과 효율성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
새로운 임상 시험에 큰 관심을 보인 LN 표적화의 도전을 우회하기 위한 하나의 전략은 직접,LN(i.LN.)주입2-4이다. 이 예심은 간단한 외래 환자 절차로 LNs에 백신을 전달하기 위하여 초음파 지도를 채택했습니다. 전통적인 말초 사출 경로에 비해, 이 접근은 알레르기와 암을 포함하는 치료 문맥에서 상당한 복용량 절약 및 향상된 효능을 초래2-4. 이러한 연구는 림프 배수로 인해 빠르게 지워진 용해성백신(즉, 생체 재료 이없는)의 i.LN. 주입을 채택했습니다. 따라서, 다중 주사- 또는 다중 주사의 주기-이러한 인상적인 치료 효과 달성 하기 위해 관리 되었다. LN에 있는 향상된 보존은 항원 및/또는 보조및 면역 세포 사이 상호 작용을 향상시킬 수 있었습니다, 면역 세포 프라이밍의 힘을 더 향상. 이러한 잠재력은 항원 및 보조 전달의 운동학이생성된특정 면역 반응을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 최근 연구에 의해 지원된다. 또한 약물 및 백신 용량을 국소화하고 최소화하면 만성 염증과 같은 전신 효과를 줄이거나 제거할 수 있습니다.
생체 재료는 백신1,8,9의효능과 효율성을 향상시키기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 생체 재료 캐리어의 캡슐화 또는 흡착은 화물을 저하로부터 물리적으로 보호하고 용해도 한계를 극복할 수 있습니다. 중합체 마이크로 또는 나노 입자와 같은 생물 재료 운반선의 또 다른 주목할만한 특징은 여러 종류의화물을 공동으로 로드하고, 그 후, 제어 된 간격을 통해 이러한화물을 방출 하는 기능. 그러나 생체 재료 백신과 생체 요법을 계속 방해하는 중요한 제한은 면역 세포의 비효율적인 표적화및 림프절에 대한 제한된 인신 매매입니다. 예를 들어, 종래의 경로를 통한 생물재료 백신의 말초주입(예를 들어, 비상인, 근육)은 전형적으로 LN 표적화불량을 나타내며, 주입된 물질의 최대 99%가 주사 부위에 남아 있다4,10. 최근에는 생체재료 백신 운반선의 크기가 간질흐름8,10을통해 LN에 대한 이러한 백신의 우대 인신매매 또는 배수를 개선하기 위해 조정되고 있다. 이러한 발전은 새로운 백신을 위한 LN 환경을 표적으로 하고 엔지니어링하는 것의 중요성을 강조하며 향상된 세포 및 유머 면역 반응으로 이끌어 냈습니다.
본 논문은 지질 안정화 폴리머 입자와 i.LN. 전달을 결합하여 통제된 방출 백신 창고5,11을생성하는 백신 프로토콜을 제시한다.  i.LN에대한 수술 기술을 사용하는 최근 연구에 구축. 마우스6,7,12,13에서,우리는 작은 동물5에서 생물 물질 백신을 주입하기위한 신속하고 비 수술 전략을개발했다. i.LN. 전달을 생체재료 백신 운반대와 결합하여 제어방출백신 창고5의단일 주사 후 7일 이내에 CD8 T 세포 반응을 강력하게 강화했다. 강한 유머 반응(즉, 항체 티터)도 생성되었다; 두 가지 개선 사항은 생체 재료 운반대에서 제어 방출에 의해 매개된 림프절의 백신 성분의 보존 증가와 관련이 있었다. 흥미롭게도, 백신 입자의 크기는 LN에서 이러한 물질의 운명을 한 번 변경: 나노 스케일 입자는 세포에 의해 직접 섭취를 높게 보였다, 더 큰 미세 입자는 세포 외 LN 환경에 남아 있는 동안 및 방출화물(예를 들어 adjuvant) LN 상주 항원 제시 세포에 의해 채택 된5. 이 데이터는 주입된 생체 재료의 크기를 통제해서 새로운 백신을 위해 이용될 수 있는 2개의 통로를 건의합니다 i.LN.
본 문서에서생분해성 지질 안정화 폴리머 입자(마이크로 및 나노스케일)는 수정된 이중 에멀젼 전략5,11을사용하여 합성된다. 입자 특성은 레이저 회절 및 현미경 검사를 특징으로합니다. 이러한 입자는 일반적인 무독성 트레이서염료(14)를사용하여 비수술적으로 확인된 잉구이날 LN내로 직접 주입된다. 조직학 또는 유동 세포측정에 의한 LN의 후사 분석은 LN 환경 내의 입자분포를 검증하고 시간이 지남에 따라 입자의 세포 섭취 및 유지를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 조직학적 처리 및 유동 세포측정을 자세히 설명하는 프로토콜의 경우, 독자는 최근 JoVE 기사 및 저널 보고서15-22를참조합니다. 일반적인 결과는 강력하고 효율적인 면역 반응을 달성하거나 표적 병원체에 대한 면역력을 조정하기 위해 악용 될 수있는 이러한 창고의 로컬 LN 표적을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-디올레올sn-글리세로-3-포스포콜린1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>클로로포름 1,2</td></tr><tr><td>-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 암모늄염(DSPE-PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td>클로로포름 10mg/ml 스톡</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890</td> 클로로포름 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA)<td>의 10mg/ml 재고</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td>락타이드:글리콜라이드(50:50). MW 30,000-60,000</td></tr><tr><td>디클로로메탄(DCM)</td><td>VWR</td><td>BDH1113</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>베톤</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evans 블루 트레이서 염료</td><td>VWR</td><td>AAA16774-09</td><td></td></tr><tr><td>U-100 BD 초미세 단단 인슐린 주사기, 31 G 5/16 in 바늘</td><td>VWR</td><td>BD328418</td><td></td></tr><tr><td>일회용 바늘, BD Medical, 21 g, 1.5 BD</td><td></td><td></td> Luer-Lok 팁, BD 의료, 1 ml VWR BD309628 팔콘 세포 여과기, 멸균, 코닝, 40 &마이크로를 가진 바늘 VWR BD305167 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>주사기</td><td></td></tr>;<tr><td> m</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD 세포 라벨링 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 마이크로스피어 6.00 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>17149</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 마이크로스피어 0.05 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>17156</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin, Purified</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003056</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Sonicator 초음파 프로세서 Q125</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>1/8 in 직경 microtip 프로브</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T 25 디지털 균질화 장치</td><td>IKA</td><td>YO-04739-22</td><td>10 G 분산 소자</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>레이저 회절 입자 크기 분포 분석기</td><td>Horiba</td><td>LA-950</td><td>제공된 큐벳 스타일 유리 분획 셀</td></tr><tr><td>포함 Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

적응형 면역 반응의 생성은 T와 B 림프구에 이 외국 분자의 처리 그리고 프리젠 테이션을 위한 림프절에 대한 항원의 효율적인 배수 또는 인신 매매에 의존한다. 림프절은 이렇게 새로운 백신 및 면역 요법을 위한 중요한 표적이 되었습니다. 이러한 조직을 표적으로 하기위한 최근 전략은 수용성 백신 성분의 직접 림프절 주입이며,이 기술과 관련된 임상 시험은 유망하고있다. 몇몇 생체 재료 전략은 또한 생체 재료 백신 입자의 최적 배수를 위한 입자 크기를 조정하는 예를 들면, 림프절 표적을 향상시키기 위하여 조사되었습니다. 이 논문에서 우리는 항원, 보조제 또는 그밖 백신 성분으로 적재될 수 있는 생분해성 폴리머 입자와 직접 림프절 주입을 결합하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법에서 중합체 미세 입자 또는 나노 입자는 지질 안정기를 통합하는 수정된 이중 에멀젼 프로토콜에 의해 합성된다. 입자특성(예: 크기, 화물 적재)은 레이저 회절 및 형광 현미경 검사법에 의해 각각 확인된다. 마우스 림프절은 그 때 림프절에 있는 고분자 입자의 표적 주입 사이트의 시각화 및 후속 증착을 허용하는 무독성 추적자 염료의 말초 주입에 의해 확인됩니다. 이 기술은 림프절에 전달된 생체 재료 및 백신 성분의 용량과 조합을 직접 제어할 수 있으며 새로운 생체 재료 기반 백신 개발에 활용될 수 있습니다.

이 원고에 제시된 프로토콜에 대한 예상 결과는 입자 합성, 동물 제제 및 입자 주입의 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다.
도 1은 양용 지질에 의해 안정화된 생분해성 폴리머 입자의 합성 및 특성화를 묘사합니다. 에멀젼/용매 증발 합성 프로토콜(도1A)의결과는 생성된 최종 에멀젼의 육안 검사에 의해 질적으로 평가될 수 있다. 입자 배치는 불투명한 외관을 가진 균일하고 안정적인 에멀젼이어야 합니다. 합병증은 종종 지질 안정제의 부적절한 저장으로 인해 크림 또는 flocculate에 대한 에멀젼을 포함한다. 이러한 불안정을 피하기 위해 지질은 탈수 상태 또는 질소로 제거된 밀봉된 유리병에 -80°C로 보관해야 합니다. 입자 합성의 정량적 평가는 크기 분포를 분석하기 위해 레이저 회절 또는 동적 광 산란을 사용하여 수행될 수있다(도 1B). 예상 결과에는 입자의 균일한 모집단을 나타내는 단단히 분포된 단모달 입자 크기가 포함됩니다. 이 원고에 기재된 합성 파라미터는 나노입자 및 미세입자에 대해 약 100nm 또는 3 μm을 중심으로 한 수평균 분포를 각각 생성한다. 입자 합성의 추가 질적 평가는 형광화물의 다중 클래스를 통합하기 위해 위의 프로토콜의 수정을 통해 달성 될 수있다. 도 1C에서,형광 펩티드(FITC, green)로 적재된 미세입자의 현미경 이미지는, 리포필성 염료(DiD, red) 및 오버레이 영상(yellow)이 입자의 부피 내에서 원하는 크기 범위 내에서 입자의 생성 및 캡슐화를 확인한다.
도 2의 처음 두 패널은 본 논문에 기재된 i.LN. 주입 전략에 대한 동물 제제의 예상 결과를 요약한다. 방법론은 입자의 후속 i.LN. 주입의 위치를 식별하기 위해 무독성 추적자의 말초 주입에 의해 인구닐 LN을 표시하는 것을 포함한다(도 2A)5. 언급했듯이, 꼬리 베이스에서 피하 주사에 따른 트레이서 염료의 배수는 잉게날 LN(도2B)5의시각화를 가능하게 한다. 승인 된 탈모 크림의 섭취는 마우스에 위험을 제기 할 수 있습니다. 따라서, 적용된 모든 크림을 철저히 제거하고 발과 마우스의 복부 면에 특별한 주의를 기울여야 한다. 열량은 젖은 부드러운 천이나 젖은 종이 타월을 사용하여 하나의 부드러운 동작으로 제거해야합니다. 이 마우스의 노출 된 피부에 찰과상으로 이어질 수 있기 때문에 크림을 제거하기 위해 문지르지 마십시오.
inguinal LN에 전달의 로컬 확인관찰 또는 조직학을 통해 평가될 수 있다. LN 볼륨성공적인 주입의 지표로 주입 하는 동안 시각적으로 모니터링할 수 있습니다. 예상되는 결과에는 인접한 조직이나 셀에 상당한 누출없이 LN 구조 전반에 걸쳐 효율적인 화물 분배가 포함됩니다. 또한, 주입된 유체가 LN의 트레이서를 대체/희석함에 따라 주사 후 염료 농도/착색이 덜 강렬해져야 한다. 조직의 관찰은 손상되지 않은 것을 밝혀야하지만 유체 주입으로 인해 LN을 확대해야합니다. 잠재적인 과제는 너무 빨리 주입하거나 LN을 누락포함, 둘 다 주변 피하 조직에 볼륨의 용출을 일으킬 수 있습니다. 이러한 바람직하지 않은 결과는 부검 또는 조직학에 의해 확인될 수 있으며, 여기서 입자 현탁액은 주입을 대상으로 한 노드로부터 세포 및 조직 원격으로 퍼지는 것을 관찰할 것이다. 대조적으로, 예상되는 결과는 LN 구조 내의 입자의 봉쇄로 인해 확대된 잉구인 LN의 식별일 것이다. 절제된 LN의 조직학적 처리는 그림 2C 및 2D에도시된 바와 같이 림프조직에 화물의 납품을 결정적으로 확인할 수 있다. 도 2의 입자는 형광화물을 통합하여 주입 중뿐만 아니라 조직학적 처리 및 형광 현미경 검사기 동안화물을 시각화할 수 있도록 합니다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> 그림 1. 지질 안정화 입자의 합성 및 특성화. A)에멀젼/용매 증발에 의해 제조된 지질 안정화 입자의 합성을 설명하는 회로도. B)미세 입자의 크기 분포 (고선, 직경 = 2.8 μm) 및 나노 입자 (대시 라인, 직경 = 113 nm). C)형광 표지 펩타이드와 형광 입자 염료로 로드된 입자의 형광 현미경 이미지. 라벨: 펩타이드(녹색) 및 입자(빨간색). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> 그림 2. i.LN. LN 내의 생분해성 입자의 주입 및 분포. A) i.LN. 주입에 대한 방법론. B)피부를 통해 마우스에 LN의 시각화 (상층 이미지) 및 다음 부검 (낮은 이미지)5. C)형광 표지 폴리머 미세 입자 (입자, 녹색) 및 형광 표지 된 폴리머 미세 입자의 증착 및 분포를 확인하는 LN의 조직학적 염색; T 세포, 빨간색; B 셀, 블루). D)형광 표지 나노 입자 (50 nm, 왼쪽 이미지) 및 미세입자 (6 μm, 오른쪽 이미지) LNs에서 24 분 주입 후. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

림프절은 면역 반응을 조율하고 백신을 위한 중요한 표적인 면역 조직입니다. 생체 재료는 더 나은 표적 림프절을 위해 채택되고 항원 또는 유수품의 전달을 통제하기 위하여 채택되었습니다. 이 논문은 이러한 아이디어를 결합하여 생체 적합성 폴리머 입자를 림프절에 주입하는 기술을 설명합니다.

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

본 절차의 전반적인 목표는 직접 주입 기술을 사용하여 림프절에 생체 재료 백신 입자를 침전시키는 것입니다. 먼저, 이중 유화법을 사용하여 지질로 안정화된 고분자 입자를 합성하십시오. 그런 다음 입자를 세척하고 크기, 적재물, 로딩 또는 안정성과 같은 재료 특성을 측정하십시오.다음으로, 염료가 림프절로 배출된 후 시각화할 수 있도록 마우스의 꼬리 기저부에 추적 염료를 투여합니다. 마지막 단계는 D 표지된 림프절을 확인하고 해당 위치에 소량의 폴리머 입자를 주입하는 것입니다. 서혜부 림프절 내 입자의 존재와 분포를 확인하기 위해 조직학, 면역형광 및 공초점 현미경 관찰을 사용할 수 있습니다.림프절에 대한 직접 주입법을 백신 접종용 생체 재료와 결합하면 림프절 미세환경 내 백신 성분의 조합과 용량을 정밀하게 제어할 수 있으며, 해당 조직 내에서 화물을 조절하여 방출할 수 있습니다. 모든 백신은 효능을 나타내기 위해 림프절에 도달해야 합니다. 따라서 생체 재료와 통합된 면역 신호가 국소 림프절 신호 전달에 어떤 영향을 미치는지 정의하는 것은 이러한 사건들을 전신 면역 반응과 연결 짓는 데 있어 중요합니다.이러한 지식은 생체 재료 백신이 전통적인 경로를 통해 투여될 때 어떻게 작용하는지 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 생체 재료의 림프절 내 전달은 림프절 조직 구성에 미치는 생체 재료의 영향을 연구하는 도구로 활용되지만, 이 플랫폼은 암 및 자가면역 질환을 겨냥한 새로운 치료용 백신과 면역 요법을 개발할 수 있는 응용 기회 또한 제공합니다. 미세 입자의 경우, 고분자 지질 및 기타 수불용 화물을 포함하는 유기상을 얼음 위에서 12 watts로 초음파 처리하십시오.물과 오일 에멀젼을 만들기 위해, 증류 H2O 500 µL 또는 1 mg의 펩타이드 단백질이나 기타 수용성 화물을 포함하는 H2O 500 µL를 첨가합니다. 30초 동안 계속 혼합합니다. 바이알을 위아래, 좌우로 부드럽게 흔들어 팁 주변으로 완전한 유화가 이루어지도록 합니다.이제 수중유(water-in-oil) 에멀젼을 40 mL의 H2O에 붓고 16,000 RPM에서 3분 동안 균질화하여 수중유 에멀젼을 준비합니다. 다음으로, 마그네틱 바를 넣고 수중유 에멀젼을 하룻밤 동안 교반하여 과잉 용매를 제거합니다. 에멀젼을 40 µm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 50 mL 원심분리용 코니컬 튜브에 붓고 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 입자 펠렛을 1 mL의 물에 재현탁시켜 현탁된 입자를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.5분 동안 원심분리하여 입자를 수집합니다. 레이저 회절법 또는 광산란법으로 입자 크기를 측정합니다. 분획 셀(fraction cell)에 첨가된 물의 부피가 정렬 및 블랭킹(blanking)을 수행하기에 충분한 수준인지 확인합니다. 입자 현탁액 10 µL를 피펫으로 취해 분획 셀에 넣습니다.입자 크기 분석기 챔버 도어를 닫습니다. 그런 다음 PLGA의 입자 크기를 측정합니다. 이때 굴절률은 1.60을 사용하십시오.소프트웨어 인터페이스를 사용하여 주입 하루 전 수 개수 기준으로 입자 직경을 계산하십시오. IACUC 승인을 받은 동물 실험 프로토콜에 따라 마우스를 마취하십시오. 발가락을 이용하여 마취 깊이를 평가하십시오.집게 반사(pinch reflex)를 테스트하고 호흡을 모니터링하여 호흡수가 분당 100에서 120회인지 확인합니다. 꼬리 기저부와 뒷다리 부위의 털을 깎습니다. 동물의 복측 털을 제거하고, 뒷다리 관절 바로 위쪽의 배측까지 측면을 따라 털을 제거합니다.각 염료 주입 시, 마이크로 파이펫을 사용하여 10 µL의 염료 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 31게이지 바늘을 통해 1 mL 인슐린 주사기로 10 µL 전체를 흡입합니다. 이제 주입 간 로딩을 위해 꼬리 기저부의 양측에 염료 용액 10 µL를 피하 주사합니다. 남은 털을 제거하기 위해 순한 제모 크림을 도포합니다.뒷다리와 복부 사이의 영역까지 반드시 도포하십시오. 3분 후, 따뜻한 H₂O를 묻힌 젖은 장갑 낀 손으로 제모 크림을 피부에 부드럽게 문지릅니다. 즉시 이 과정을 반복하여 남은 제모제를 제거하십시오.다음으로, 부드러운 천이나 종이 타월을 따뜻한 물로 적셔 마우스의 하단부를 한 번의 동작으로 닦아냅니다. 마우스를 가열 램프 아래에 두어 회복시킨 후, 최소 12시간 동안 다시 사육합니다. 마취된 마우스를 조사하여 각 서혜 림프절로의 추적자 또는 염료 배출을 확인합니다.림프절은 뒷허벅지와 복부 근처에 어두운 점으로 보여야 합니다. 이제 각 주사에 필요한 원하는 주입 농도의 증류수에 입자를 다시 현탁하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 입자 용액 10 µL를 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기십시오.1 mL 주사기에 연결된 31 gauge 인슐린 바늘로 10 µL 전체를 흡입합니다. 바늘을 피부와 90도 각도가 되게 하여 염색된 림프절 주변의 피부를 팽팽하게 당깁니다. 피부를 1 mm 깊이까지 관통합니다.림프절의 가시적인 비대를 관찰하면서 전체 부피를 천천히 주입하십시오. 열 램프 아래에서 마우스를 회복시킨 후, 사육장으로 돌려보내거나 추가 테스트를 진행하십시오. 먼저, 입자 합성 및 크기 분포를 확인하십시오.에멀전 용매 증발 합성 프로토콜은 최종 에멀전을 육안으로 검사하여 정성적으로 평가할 수 있습니다. 에멀전은 가시적인 응집물이 없는 균일한 현탁액 상태여야 합니다. 입자 크기 분포는 레이저 회절법 또는 동적 광산란법으로 확인할 수 있으며, 입자 샘플은 단일 모드 분포를 보여야 합니다.형광 펩타이드나 친지성 염료와 같은 하나 이상의 형광 화물을 포함하도록 프로토콜을 수정함으로써 입자 합성의 추가적인 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 염료는 입자 주입을 위한 림프절의 위치 확인 및 표적화에 사용될 수 있습니다. 교육 과정 중에는 염료 주입 후 마우스를 안락사시키고 부검하여 림프절의 위치를 익힐 수 있습니다. 감염된 림프절의 t 세포 및 b 세포 구역 내 입자 분포는 절편화 및 염색된 림프절의 공초점 현미경 관찰을 통해 확인합니다.크기와 같은 입자 특성의 차이는 주입 후 형광 현미경 이미징을 통해 림프절에서 관찰할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 첫째 날에는 입자 합성 및 동물 준비를 진행합니다. 둘째 날에는 입자 세척, 특성 분석 및 림프절 내 주입을 수행합니다.이 영상을 시청하고 나면 추적자나 염료를 사용하여 마우스의 서혜 림프절을 시각화하고 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 통해 이전에는 불가능했던 수준의 정밀한 제어로 바이오 소재 백신 운반체를 림프절로 직접 비수술적으로 전달할 수 있습니다. 바이오 소재의 직접적인 림프절 전달은 과학자와 엔지니어, 면역학 및 백신 개발 연구자들이 바이오 소재 백신과 면역 신호가 림프절과 상호작용하는 근본적인 방식을 탐구할 수 있게 하며, 이러한 소재가 면역력을 자극하고 형성하는 메커니즘에 새로운 통찰을 제공할 것입니다.

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 혈관 신생을위한 치료 인자를 과발현 프로그래밍 줄기 세포의 제조 방법을 설명한다. 설명 과정은 체외에서 지방 유래 줄기 세포를 형질 전환하고, 쥐의 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진하기 위해 프로그램 된 줄기 세포의 효능을 검증 고분자 합성 (가) 있습니다.

생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

우리는 비타민 E-TPGS를 유화제로 사용하여 폴리(락틱-코-글리콜산)로 구성된 나노 입자 및 마이크로 입자의 생산 및 특성화를 설명합니다. 유화제의 농도와 같은 다양한 제형 매개 변수를 통해 평균 직경이 220 nm에서 1.98 μm 인 나노 입자를 생성 할 수 있습니다.

비타민 E-TPGS와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 PLGA 나노 입자

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

Submandibular 동맥을 지역 약물 전달 및 새로운 치료제의 개발에 대 한 이해 침 샘 생물학에서입니다. 선물이 배달 정확성과 실험의 재현성을 향상 시키는 업데이트 및 상세한 retroductal 주입 프로토콜. 여기에 소개 하는 응용 프로그램은 고분자 나노 입자의 배달.

Retroductal 나노 Murine Submandibular 동맥에 주입

Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

표준 프로토콜은 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 IL-1α의 항종양 활성 및 관련 독성을 연구하기 위해 설명된다.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

배우세요 생분해성 폴리머 입자를 쥐의 사타구니 림프절에 직접 주사하는 방법을. 이 기술은 백신 효능을 향상시키고 림프절 미세환경에서 면역 반응을 정밀하게 제어할 수 있습니다.

생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입

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