Name: 배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: 배우세요 배양 세포에서 소포체 하위 도메인의 분포와 이동성을 GFP 형광 단백질과 공초점 현미경을 이용해 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 내 단백질 역학 연구에 활용됩니다.

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저자는이 문서의 게시에있는 그것의 도움과 지원을위한 폰다 치오 Filarete에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 TECNAI G2 투과 전자 현미경의 사용 센트로 피오 디 Nanomedicina에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. ER 형광 단백질 플라스미드, 세포 배양 및 형질 <ol><li> 본 연구에서 사용 된 플라스미드는 쥐 시토크롬 B의 ER 이소 형의 꼬리 영역과의 C-말단에 융합 된 GFP의 향상된 버전으로 구성 (5) 링커 서열을 통해 (B 등 (5) 여기 기함). 꼬리 영역 (5), 업스트림 및 다운 스트림 극성 시퀀스에 의해 측면에 17 잔류 TMD (횡단 도메인), (UPS 및 DPS) 등의 기본 B의 트립신 절단 후 관련 막 남아있는 전체 시퀀스 (Pro94-Asp134)를 포함 . 링커 [(의 Gly) 4 빼앗아] 3이어서 MYC 에피토프로 구성하고, 전체 cDNA를 포유 동물 발현 벡터의 Hind3 된 pcDNA3-Xba1 사이트에 삽입된다. 이 플라스미드의 구성 정보가 GFP ER-16로 언급되는 이전의 간행물에 기재되어있다. </li><li> 10 % 죽은 태아의 보충 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)의 COS-7 세포를 성장L 소 혈청, 2 밀리미터 L-글루타민, 37 ° C에서 인큐베이터에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % CO 2. </li><li> 형질. 제조자에 의해 설명 된대로 판 3 × 10 5 6 - 웰 플레이트에 둥근 유리 커버 슬립에 세포와 다음 날에, JetPEI 시스템으로 형질. 최적 JetPEI / DNA 비율은 사용 된 플라스미드 및 세포주에 따라 최대 형질 감염 효율을 확립하기 위해 시험되었다 유의 : 우리의 경우, JetPEI는 2:1의 DNA 비율 70-80 % 년 형질 감염 효율에 이르게한다. </li></ol> 2. 라이브 형광 스캐닝 공 초점 현미경 <ol><li> 라이브 세포 이미징. 형질 세포가 W / 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 % 펜 / 연쇄상 구균, 25 mM의 HEPES와 보충 페놀 레드, O를 DMEM 가득 24mm 커버 슬립의 강 문화 전지 실에 파종 된에 커버 슬립을 넣어 , photobleaching에에서 샘플을 방지하기 위해 50 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드 1:100 OxyFluor. SP5 공 초점 microscopD의 GFP-ER은 488 nm의 레이저와 50분의 525 대역 통과 방출 필터를 사용하여 시각화되고으로 온도가 조절 CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)를 탑재 전자는 라이브 셀 이미징 실험에 사용됩니다. </li><li> FRAP (을) photobleaching에 후 형광 복구. OSER 구조에 대응하는, 또한 (ROI)의 영역을 그리고 그것을 (샘플에서 5.5-6 μW에 대응하는, 30 mW의 아르곤 레이저의 100 %) 20 반복 및 488 nm의 조합을 사용하여, 405 nm의 표백 우리의 경험에서, 효율적이고 신속한 광표백에 이르게, (샘플에서 11.6 μW에 해당하는 30 mW의 다이오드 레이저 (405)의 60 %,) 레이저. </li><li> 10 분 (픽셀 시간 = 1.61 마이크로 초 / PX)에 대해 하나의 프레임마다 10 초를 복용하여 표백의 ROI에 형광의 회복을 기록합니다. </li><li> (FLIP)을 photobleaching에 형광 손실. OSER 구조에 따른 투자 수익 (ROI), 전술 한 바와 같이 표백제를 그립니다. 표백은 매 30 초를 반복,사후 표백 이미지는 30 분 (픽셀 시간 = 1.61 마이크로 초 / PX)마다 10 초를 기록한다. </li><li> FRAP 및 플립 분석. 모든 이미지는 ImageJ에 소프트웨어 (사용하여 분석 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html을</a> ). FRAP 실험에서, 표백 투자 수익 (ROI)의 형광 복구는 시간과 항상 시간에 일정하게 체크 표백 셀의 총 형광, 정규화를 통해 측정된다. </li><li> FLIP 실험의 경우, 표백 OSER 및 전체 세포를 덮고 외부의 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 시간이 지남에 따라 그 형광 강도를 측정하고 영상 자체에 기인 한 형광의 어떤 저하를 보정하기 위해 표백 셀에 그려진 ROI의 형광 수준으로 정상화. </li><li> 모든 실험에서의 ROI의 형광 강도로부터 (세포 외부의 영역에서 결정) 배경 신호를 감산. 마지막으로, 할머니를 사용하여 결과를 플롯aphPad 프리즘 소프트웨어. </li></ol> 3. 투과 전자 현미경에 의한 미세 구조 분석 시약의 많은 독성을 감안할 때, 모든 절차는 적절한 실험실 입고 수행되어야한다. 흄 후드 코트와 장갑. <ol><li> 페트리 접시에서 커버 슬립을 제거한 후, 실온에서 10 분 동안 0.1 M cacodylate 완충액, pH 7.4의 여과 2 % 글루 타르 알데히드를 사용하는 단일 층으로서 접시의 바닥에 성장 남은 세포를 고정한다. </li><li> 테플론 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁고 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 전송할 수 있습니다. 10 분간 9,000 g에서 원심 분리에 의해 세포 펠렛. , 뜨는을 제거 신선한 정착액을 추가하고, 4 ℃에서 하룻밤 남겨 </li><li> 버퍼와 펠렛을 씻으, 실온에서 1 시간 동안 cacodylate 버퍼에 1 % 오스뮴의 용액으로 후 고정합니다. </li><li> 를 MilliQ의 물로 씻어하고있는 블록 얼룩 엔20 ~ 60 사이의 분 동안 증류수에 1 % 우라 닐 아세테이트. </li><li> 에탄올 시리즈 (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 10 분마다 100 %) 증가에 샘플을 탈수하고, (각 15 분) 프로필렌 옥사이드에 짧게 두번 세척 하였다. </li><li> (2 시간 내지 하룻밤) 프로필렌 옥 시드 +의 Epon (1:1)의 혼합물에 샘플을 침투. </li><li> 최소 24 시간 동안 60 ° C에서 경화의 EPON 에폭시 수지에 포함. </li><li> 제 60 ~ 70 ㎚의 두께를 갖는 섹션을 구하는 45 ° 다이아몬드 나이프 탑재 인해 Ultramicrotome LEICA UC6를 사용하여 수동으로 트리밍 수지 진영. 300 메쉬 구리 그리드에 대한 부분을 수집합니다. </li><li> 우라 닐 아세테이트 (20 분)의 포화 용액으로 그리드 섹션을 얼룩과 구연산 (7 분)를 이끌어, 철저하게 이중 증류수 여과 물을 침지하여 그리드를 세척하고 실온에서 건조 할 수 있습니다. </li><li> 더러워 그리드는 TECNAI G2 투과형 전자 현미경을 사용하여 관찰되고, 이미지는 BOTT를 사용하여 캡처되는(일반적으로 6,000-39,000 X에 이르기까지) 다른 최종 배율에서 OM-마운트 CCD 카메라. </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
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<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 문서에 설명 된 프로토콜 및 이미징 방법은 살아있는 세포의 ER에 거주 형질 TA 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용되었다. 우리는 또한 미세 구조 분석에 의해이 세포 내 구획의 구조에서 이러한 단백질의 과발현의 효과를 분석 하였다. 살아있는 세포 공 촛점 이미징 및 전자 현미경의 조합이 단백질의 동적 특성을 조사의 매우 강력한 수단이다 나타내고, 단백질 기능에 관한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 한 방법은 시간 (일반적으로 일 사흘)을 소비하지 않고, 이미지 수집 및 분석을위한 많은 사용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램의 개발이 photobleaching에 기반, 라이브 세포 이미징 비교적 간단합니다. 이러한 기술의 주요 제한은 형광 융합 단백질의 사용이다 때문에형광 태그는 그 단백질의 적절한 폴딩 및 / 또는 어셈블리에 영향을 미칠 수있다. 또, 과다 발현은 형질 감염, 형광 태그로 단백질의 동작을 ...

녹색 형광 단백질 (GFP) 및 스펙트럼 변형, 형광 현미경의 평행 개발의 발견은 세포에있는 단백질 행동의 조사를 위해 완전히 새로운 길을 열었습니다. 때문에 강렬한 조명 아래에서 자신의 형광을 소화하는 형광 물질의 고유 용량이 가능하다 (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 같은 형광 복구와 같은 기술은, 공 초점 라이브 세포 이미징을 기반으로하고의 사용은 형질 형광 융합 단백질 1-3. 그들은 널리 자신의 기능 4와 관련된 중요한 단서를 공개 할 수있는 단백질의 현지화뿐만 아니라, 자신의 이동성과 기공을 갖는 전송뿐만 아니라,을 평가하는 데 사용됩니다. 진핵 세포의 고유 기능은 특정 지질과 단백질 성분이 세포 내 구획의 존재입니다. 세포 소기관은 물리적으로 isolat와 있지만ED는 그들이 서로 통신 및 셀룰러 항상성을 유지하기 위해 분자 구성 요소를 공유 할 필요가있다. 분비 경로는 ER에서 합성 단백질과 지질이 그들의 기능을 발휘하는 정확한 최종 목적지에 도달 할 수 있음을 보장합니다. 세포 내 소기관 또한 분자 (지질)에 직접 구획 사이에서 교환 될 수 있도록 동적 접촉 위치에 의해 접속 될 수있다. 또한, 많은 단백질에 큰 이종 체 단지에서 조립 또는 기능적으로 활성화 될 수 또는 최종 목적지로 이송하기 위해 특정 지질 종 (지질 뗏목 / 마이크로 도메인)와 관련있다. 이러한 생물학적 측면 모두는 크게 단백질의 역학적 특성에 영향을 미치는, 따라서 적절하게 아래에 설명 된 기술에 의해 조사 할 수있다. 우리 그룹은 ER의 아키텍처와 다른 서브를 연구하기 위해 널리 FRAP를 사용하고 전자 현미경과 결합 플립도메인. ER은 분비 경로의 제 1 국이고, 단백질과 지질 5 선별에 중요한 역할을한다. 그것은 누구의 고유 한 하위 도메인의 여러 가지 기능 (예 : 단백질과 지질의 생합성 및 인신 매매, 단백질 폴딩, 칼슘 2 + 저장 및 해제, 및 생체 이물 대사)를 반영하는 매우 역동적 인 세포 기관이다. 그들이 공간적, 형태 학적, 그리고 기능적으로 구별 그러나, 비록 이러한 도메인은 서로 연속하고, 그들의 상대적인 풍부함 생리 및 병리 적 조건하에 세포에서 변형 될 수있다. 가장 잘 알려진 및 ER의 보통 공간적으로 분리 된 도메인들은 핵막 및 매끄럽고 거친 ER이며 그러나 다른 사람은 ER 구조는 다양한 종류의 세포에서보다 정교한 구조 및 3 차원 조직이 있다는 것을 증명하고있다 또한 저산소증, 약물과 같은 스트레스 자극에 의​​해 유도 될 수있는 생리 학적 조건 하에서 조직관리, 또는 ER 상주 횡단 단백질 2,6의 과발현 (및 참조 안에). 우리는 또한 최근에 인간의 질병 1,7의 세포 모델에서 이러한 구조의 존재를 증명하고있다. 부드러운 ER의 누적 cisternae에서 발생 그들은 또한 그들의 아키텍처에 기초 karmellae, 얇은 판자, 및 결정상 ER로 알려져 있지만, 그들은 2003 년 6 조직 부드러운 소포체 (OSER)의 집단 이름이 부여 된, 같은 자신 크기는 다를 수 있습니다. 세포는 꼬리 고정 (TA) ER 상주 단백질 (D의 EGFP-ER), 트랜스에서 GFP의 약한 이합체 경향이 극적으로 ER의 조직과 구조를 변경의 세포질 영역에 융합 GFP 형질 전환 된 후. FRAP 및 플립 실험은 D EGFP-ER은 OSERs 내에서 확산 자유롭게 것으로 나타났다하고 OSER에 망상 ER에서 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지 &lt;사실/ 엠&gt; 집계 주변의 망상 ER 연속 있음을 나타냅니다. 미세 분석은 우리가 나노 수준에서 OSER 아키텍처와 조직에 대한 자세한 설명과 함께 형광 데이터의 상관 관계를 할 수있다 : OSERs은 항상 부드러운 ER의 쌍 cisternae의 스택으로 구성되어 있지만, 이러한 정기적 사인 배치로 공간 조직의 다양한 형태를 가질 수 배열이나 윤 생체, 또는 육각형의 &quot;결정체&quot;관의 배열. 이러한 재 배열들은 생리적 조건 9 저산소증 10, 약물 치료 11 암 9로 다음과 같은 스트레스에 따라 세포에서 발견 된 것처럼, 미세 마커 상당한 잠재력을 가지고있다, 입방 형태학 8로 이어집니다. GFP 융합 단백질을 사용하여이 제 데모 후에, 우리는 약물 치료 12 ASSE에 응답하여 ER 도메인의 증식을 분석하기 위해 이미징 실험을 사용SS 세포 13 oligomerise하고, 그 병원성 1,8 관련된 수도 ER 계 세포 응집체의 형성에 돌연변이, ALS TA-결합 단백질의 역할을 조사하기 위해 형광 단백질의 경향. 그것은 (많은 신경 변성 질환 (14)에서 발생하는) 세포 응집체의 형성이 독성 돌연변이 단백질 및 주변 셀 요소 (15) 사이의 상호 작용을 방지하기위한 보호 메커니즘이 될 수 있다는 것을 제안하고있다. 다음은 그의 C-말단 소수성 도메인은 ER의 세포막 내로 삽입되고, 자신의 동적 거동의 분석 및 ER 도메인에서 자신의 과발현의 효과 구조를 조사하는 광학 및 전자 현미경 방법의 조합에 대하여 설명한다 배양 된 세포의 구조 (실험 프로토콜의 흐름도는 그림 1 참조).

<table><tbody><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM) w/o 페놀 레드</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM 용액</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase 주식회사</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 등급 I</td><td>시그마 알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>카코딜산나트륨 트리하이드레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트 이수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>73943</td><td>경미한</td></tr><tr><td>방사성 프로필렌 옥사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON 임베딩 미디엄 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate </td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Spectral Confocal Microscope </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 현미경 케이지 인큐베이션 시스템 </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초박극자 </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프 </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘 소프트웨어</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24mm 커버슬립용 강철 배양 세포 챔버</td><td>생명과학 도구</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

이러한 강렬한 interorganelle 분자 트래픽에도 불구하고 자신의 독특한 구성과 기능을 유지하지만 진핵 세포의 지질과 단백질은 지속적으로, 세포 구획 사이에 교환됩니다. 이 문서에 설명 된 기술은 생체 내에서 자신의 생리적 환경에서 단백질과 지질의 이동성과 인신 매매를 공부하는 강력한 수단입니다. (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 형광 복구 널리 엑소-세포 내 이입 통로, 세포 기관 또는 subcompartments 사이의 연속성, 단백질 복합체의 형성, 단백질 지역화보기를 통해 세포 내 인신 매매를 공부 라이브 세포 이미징 기술을 사용하는 지질 마이크로 도메인에서 모두의 생리적 및 병리 적 조건에서 관찰 될 수있다. 이러한 방법의 한계로 인해 형광 융합 단백질의 용도에 주로, 그들의 잠재적 인 단점 과발현 인공적 포함세포에서 이온과 태그 및 기본 단백질의 접힘 및 현지화의 차이의 가능성. 마지막으로, 광학 현미경 (약 200nm)의 해상도의 한계로 스트레스 세포에서 유래 할 수있는 ER 또는 특정 subcompartments의 미세 구조의 조사를 허용하지 않는 (즉, 저산소증, 약물 투여, 횡단의 과발현 ER 상주 단백질) 또는 병적 인 조건에서, 우리는 미세 배양 형질 세포의 라이브 세포 이미징을 결합하여 투과 전자 현미경을 기준으로 분석한다.

그림 2는 단백질 이동의 예 FRAP 연구 결과를 보여줍니다. D EGFP-ER 단백질의 이동성은 표백 OSERs에 photobleaching에 후 빠른 형광 복구에 의해 증명된다. 정량 분석​​을 위해, 하프 타임 및 모바일 분획은 다음 방정식 단지 수 피팅에 의해 실험적으로 측정 된 데이터로부터 유도 하였다 : F (t) = F 포스트 + (F의 REC-F의 게시물) (1-e-t / τ) F 포스트 photobleaching에 후 형광 신호이고, F의 REC 등록시 t, 표백 후의 도달 시간 상수 τ되는 형광 극대 복구 값이다. 형광 복구를 변경하고, 결과적으로, ...

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

다음 실험의 전반적인 목적은 형질전환된 형광 단백질이 소포체 내에서 어떻게 분포하고 이동하는지 조사하고, 발현이 초미세 구조 아키텍처에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 배양된 세포에 GFP가 태그된 꼬리 고정(tail anchored) 소포체 상주 단백질을 일시적으로 형질전환합니다. 형질전환 후, 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 및 형광 소실을 평가하기 위해 살아있는 세포의 공초점 이미징을 수행합니다.광퇴색(photobleaching) 또는 flip 과정에서 투과 전자 현미경을 사용하여 초미세 구조 분석을 수행합니다. 분석 결과, GFP가 태그된 B five 컨스트럭트의 발현이 소포체의 조직과 구조를 극적으로 변화시켜 응집체 형성을 유도한다는 것이 입증되었습니다. 본 연구에서 제시하는 방법은 단백질 및 지질의 이동성과 트래픽킹과 같은 기본적인 세포 생물학적 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한, 약물 치료에 대한 반응을 연구하거나 형광 단백질 및 올리고 현대화를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 근위축성 측삭 경화증과 같이 병원성과 관련이 있을 수 있는 세포 내 응집체 형성과정에서 병원성 변이 단백질의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 플라스미드는 링커 서열을 통해 C 말단이 쥐 cytochrome B5의 er 동형 단백질 꼬리 영역에 융합된 강화된 버전의 GFP로 구성됩니다. B5의 꼬리 영역은 트립신에 의해 절단된 후에도 막에 결합된 상태로 유지되는 전체 서열을 포함하고 있습니다.여기에는 상류 및 하류 극성 서열이 양옆에 배치된 17개 잔기의 transmembrane domain이 포함됩니다. 링커는 M epitope와 그 뒤를 잇는 GLY four S3로 구성됩니다. 전체 CDNA는 포유류 발현 벡터인 PC DNA three의 Hindi three XO one 부위에 삽입됩니다. transfection 준비를 위해, transfection 전날 37 °C, 5% CO2 조건의 보충된 DMEM에서 cost seven 세포를 배양하고, 다음 날 6-well plate 내의 원형 24 mm 유리 커버슬립 위에 3 × 10⁵ 개의 세포를 플레이팅합니다.제조업체가 여기에 설명한 jet PEI 시스템을 사용하여 세포를 형질전환하며, jet PEI와 DNA의 비율은 2:1로 사용합니다. 이는 일반적으로 70~80%의 형질전환 효율로 이어집니다. 이미징 전 24시간 동안 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 유지하십시오. 다음으로, 핀셋을 사용하여 형질전환된 세포가 있는 커버슬립을 이미징 챔버로 옮깁니다.남은 세포를 보존하기 위해 조직 배양 접시를 인큐베이터로 되돌립니다. 전자 현미경을 이용한 초미세 구조 분석을 위해, 또는 살아있는 세포 이미징을 위해 스틸 세포 배양 챔버에 2 mL의 이미징 배지를 추가합니다.시료의 광퇴색을 방지하기 위해 이미징 배지에 Xi Fluor를 포함합니다. 단백질 생합성으로 인한 A 형광 신호 및 결과적인 전체 형광의 증가를 피하기 위해, 번역 억제제인 smide가 존재하는 상태에서 실험을 수행해야 합니다. 온도 조절 CO2 인큐베이터와 형광 회복 수행을 위한 적절한 광증배관 설정이 적용된 적절한 레이저가 장착된 공초점 현미경 스테이지 위에 이미징 챔버를 놓습니다.광퇴색(photobleaching) 또는 프랙(frack) 처리 후 세포의 초점을 맞추고, 픽셀 포화가 발생하지 않도록 획득 파라미터를 설정하십시오. 또한, 이미지 획득으로 인한 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 출력을 가능한 한 낮게 설정해야 합니다. 이미징 파라미터 설정이 완료되면, 두 개 이상의 세포가 포함된 새로운 시야(field of view)로 이동하십시오.각 획득 영역(acquisition field)에서 세포 하나는 탈색되지 않은 상태로 유지하여, 탈색된 세포의 형광 신호를 정규화하는 데 사용할 수 있도록 해야 합니다. 탈색을 위해, 조직화된 매끄러운 소포체(organized smooth endoplasmic reticulum, OSER)에 해당하는 관심 영역(region of interest, ROI)을 지정하십시오.효율적이고 신속한 광퇴색을 위해 적절한 횟수의 반복 횟수로 이미지 프로그램의 bleach 설정을 맞춥니다. 필요한 경우, 488 nanometers 레이저와 405 nanometer 레이저를 조합하여 사용할 수 있습니다. 실험 전 과정 동안 10초마다 단일 프레임을 10분 동안 캡처하도록 소프트웨어를 설정합니다. 여기에는 preble, bleach 및 회복 기간이 모두 포함됩니다.모든 설정이 완료되면, 표백 및 캡처를 시작하십시오. 캡처가 완료되면, 새로운 시야로 이동하여 이 과정을 반복하십시오. 각 커버당 4~5개의 시야를 캡처하십시오.광퇴색(photo bleaching) 또는 플립(flip) 시의 형광 손실을 측정하기 위해 다음 단계로 이동하십시오. 10분 동안 매 30초마다 10초씩 광퇴색 및 광퇴색 후 이미징 시퀀스를 수행하고, 새로운 시야(field of view)로 이동하도록 프로그램을 설정하십시오. OSER 구조에 해당하는 ROI를 설정하고, 분석을 위해 이전과 동일하게 광퇴색 및 캡처를 시작하십시오.frap 및 flip 이미지를 Image J 소프트웨어로 가져옵니다. 먼저, frap 실험에 대해 시간에 따른 탈색된 ROI의 형광 회복 정도를 평가하고, 세포 외부 영역을 선택하여 시간에 따른 평균 강도를 측정함으로써 배경 형광을 결정합니다. 다음으로, ROI의 형광 강도에서 배경 신호를 뺍니다.데이터를 시간이 지나도 일정하게 유지되어야 하는 탈색된 세포의 총 형광값으로 정규화하십시오. 그런 다음, F post를 광탈색 후의 형광 신호, F rec를 탈색 후 도달한 최대 형광 회복 값, T를 등록의 최종 시간, tau를 등록의 중간 시간으로 하는 여기에 표시된 단일 지수 방정식에 맞추어 피팅하십시오.플립(flip) 실험을 분석하려면, 표백된 OSER 외부의 세포 전체를 포함하는 ROI를 설정하고 시간에 따른 형광 강도를 측정합니다. 프랙(frack) 실험의 경우, 세포 외부 영역을 사용하여 배경값을 뺍니다. 이미징 자체로 인해 발생하는 형광 감소를 보정하기 위해, 표백되지 않은 세포에 설정한 ROI의 형광 수준으로 데이터를 정규화합니다.마지막으로 GraphPad prism 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 결과를 도식화합니다. 전자 현미경 시료 준비에 사용되는 많은 시약은 독성이 있습니다. 따라서 다음 단계들은 실험복과 장갑을 착용한 상태에서 흄 후드 내에서 수행해야 합니다.광학 현미경 관찰을 위해 페트리 접시에서 커버 슬립을 제거한 후, 접시 바닥에 단층으로 성장한 나머지 세포들을 상온에서 10분 동안 고정합니다. 다음으로, 테플론 스크레이퍼를 사용하여 세포를 떼어내어 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 9,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거하고 신선한 고정액을 추가한 뒤 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하고 다음 날 사용합니다.패스 pipet으로 고정액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 cate buffer를 첨가하여 펠릿을 세척합니다. 펠릿이 흐트러지지 않도록, buffer를 첨가할 때 튜브의 벽면을 타고 흘러내리게 합니다. 세척액을 흡입하여 제거한 후, Cate Buffer 내의 1% Osmium tetroxide 용액에 세포를 넣고 상온에서 1시간 동안 후고정합니다.다음으로, Milli Q수로 헹군 후 증류수에 희석한 1% uranyl acetate를 마이크로 원심분리 튜브에 직접 첨가합니다. 20분에서 1시간 동안 염색 차단을 해제하고, 70%, 80%, 90%, 100% 및 다시 100%의 상승 에탄올 시리즈에서 각 10분씩 샘플을 탈수합니다. 그런 다음 펠렛을 propylene oxide로 15분씩 2회 세척합니다.프로필렌 옥사이드를 프로필렌 옥사이드와 epon의 1:1 혼합물로 교체하여 시료를 침투시키고, 최소 2시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 시료를 포매하기 위해 epon 에폭시 수지가 미리 채워진 포매 몰드에 세포 펠릿 조각을 넣고 60 °C에서 최소 24시간 동안 경화시킵니다. 다음 날, 45도 다이아몬드 칼이 장착된 울트라 마이크로톰에 수지 블록을 장착합니다.트리밍 나이프를 사용하여 수지 블록에서 시료가 포함되지 않은 부분을 수동으로 제거합니다. 그런 다음 울트라 마이크로톰을 사용하여 60~70 nanometer 두께의 절편을 얻습니다. 절편을 염색하기 위해 300 mesh 구리 그리드에 수집합니다.그리드를 30 µL의 포화 우라닐 아세테이트 용액 방울 위에 올려놓고 20분 동안 배양합니다. 그다음 Milli-Q수로 3회 세척하고, 다시 그리드를 리드 시트레이트 소량 방울 위에 올려 7분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 그리드를 Milli-Q수에 담가 충분히 세척한 후 실온에서 건조시킵니다.투과전자현미경을 사용하여 염색된 그리드를 관찰하고, 하단에 장착된 CCD 카메라를 이용해 6,000배에서 39,000배 사이의 최종 배율로 이미지를 캡처하여 조직화된 매끄러운 소포체 내 D-E-G-F-P ER의 측면 확산을 조사합니다. 일시적 형질전환을 거친 3개의 커버슬립에서 유래한 7개의 세포를 이 비디오에서 설명한 대로 FRAP으로 분석하였으며, 이 타임랩스 시퀀스에 나타난 바와 같이 두 개의 OSER 구조를 광퇴색시키고 시간에 따른 형광 회복을 기록하였습니다. 광퇴색 1분 후에 뚜렷한 형광 회복이 검출되었으며, 4분 후에 신호가 더욱 증가한 것을 확인하여 회복 반감기를 결정하고 D-E-G-F-P-E-R의 이동 분율을 정량화하였습니다.캡처된 이미지는 여기에서 볼 수 있듯이 이 비디오에서 설명한 대로 분석되었습니다. 탈색된 영역의 형광 강도는 시간이 지남에 따라 증가했으며, 이는 형광 단백질이 응집체 내에서 매우 높은 이동성을 가짐을 입증합니다. 소포체(endoplasmic reticulum)의 서로 다른 하위 도메인 간의 연속성을 연구하기 위해, 이 타임랩스 시퀀스에 표시된 대로 플립(flip) 실험을 수행했습니다.여기서 노란색 화살표로 표시된 OSER의 지속적인 표백은 동일한 세포 내의 나머지 ER 및 다른 OSER 구조에서 형광의 점진적인 감소를 유발합니다. 빨간색 화살표는 형광 신호가 시간이 지나도 일정하게 유지되는 표백되지 않은 세포의 일부를 나타냅니다. 이 데이터에 대한 정량적 분석 결과, 망상 구조의 ER이 점진적이고 빠르게 비워지는 것이 확인되었으며, 이는 응집체들이 나머지 ER과 물리적으로 연결되어 있음을 입증합니다. 이러한 응집체의 미세 구조를 조사하기 위해, 높은 수준의 D-E-G-F-P ER을 발현하는 세포를 투과 전자 현미경으로 관찰하였습니다.이 현미경 사진은 막 응집체가 포함된 세포질의 저배율 모습을 보여줍니다. 응집체는 적층형 cyi와 파동형의 사인파 모양 막으로 구성되어 있습니다. 여기에서 확인할 수 있듯이 말입니다.미토콘드리아가 OSER 구조 주변에 무리 지어 있는 것을 볼 수 있으며, 화살표로 표시된 리보솜은 가장 바깥쪽 cyi의 막에만 분포하고 있습니다. 막 사이의 11 nanometer 두께의 전자 밀도가 높은 공간이 세포질과 연결되어 있음에 유의하십시오. OS ER은 층판형 er에 의해 형성될 수 있는데, 이는 납작한 er cyi가 겹쳐진 구조로, 박절편에서는 연속적이거나 단편적인 모습으로 나타날 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 적층 구조의 가장 바깥쪽 시스테르나에서 소포가 출아하는 모습이 때때로 관찰될 수 있습니다.종합하면, 이 데이터는 D-E-G-F-P ER이 형질전환된 배양 세포에서 관찰되는 형광 응집체가 공간적으로 잘 정의된 3D 기하학적 구조로 조직화된 매끄럽고 평평한 ER steri 패치를 나타낸다는 것을 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 포화된 픽셀 없이 모든 이미지를 획득하는 것이 중요하며, 포화된 픽셀은 형광 회복을 변화시켜 결과적으로 단백질 이동성 분석에 영향을 줄 수 있습니다. 이미지 획득 중의 광퇴색으로 인한 형광 강도 변화나 초점 평면의 미세한 변화를 고려하기 위해, 항상 광퇴색 영역(ROI)의 형광 신호를 동일한 세포의 전체 형광 값으로 정규화하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을...

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

문화 세포의 수를 결정하는 것은 문화 조건을 표준화하고 정확한 quantitation 실험을 수행 중요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세포가 hemacytometer를 사용하여 계산하는 방법을 보여줍니다.

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

배우세요 배양 세포에서 소포체 하위 도메인의 분포와 이동성을 GFP 형광 단백질과 공초점 현미경을 이용해 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 내 단백질 역학 연구에 활용됩니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

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