설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는 체외

이 절차의 전반적인 목표는 표적 단백질이 이동에 미치는 영향을 조사하기 위해 1차 설치류의 출생 후 신경아세포를 형질주입하는 것입니다. 이것은 설치류 팝의 rostral migratory stream에서 neuroblast를 먼저 해부함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이들을 해리시키고 DNA 또는 S-H-R-N-A와 핵 결합을 통해 이들을 형질주입하는 것이다.

다음으로, 신경아세포는 매달린 방울에 다시 응집된 다음 적절한 시간 동안 현탁액에서 배양됩니다. 마지막 단계는 재응집된 신경아세포 클러스터를 3차원 매트릭스에 삽입하고 마이그레이션하도록 두는 것입니다. 궁극적으로 면역형광 또는 타임랩스 이미징 현미경은 신경아세포 이동을 분석하는 데 사용됩니다.

이 방법은 출생 후 뇌에서 줄기세포 유래 신경아세포 이동 조절과 같은 신경 발생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 까다롭고 시간이 많이 소요될 수 있는 바이러스 벡터를 사용하는 것에 비해 상대적으로 쉽고 빠르다는 것입니다. P 6에서 P 7의 쥐 배설물을 희생한 후, 각 쥐에게 메스 날을 사용하여 코에서 소뇌까지 중간 시상 봉합선을 따라 피부를 후방으로 절개합니다.

다음으로 피부를 벗겨냅니다.두개골을 따라 동일한 절개를 반복합니다. 그런 다음 집게로 두개골 피판을 부드럽게 제거하고 주걱으로 후각구와 함께 뇌를 조심스럽게 제거합니다.

그 후, 뇌의 가장 큰 3분의 1을 잘라내어 버린다. 그런 다음 조직 초퍼를 사용하여 뇌 조직을 1.4mm 두께의 코로나 조각으로 자릅니다. 슬라이스를 냉 해부 매체가 들어있는 접시에 옮깁니다.

그런 다음 해부 현미경으로 조각을 봅니다. 바늘을 사용하여 조심스럽게 분리하십시오. rostral 철새 하천은 OB 섹션의 중심에 삼각형의 반투명 영역과 작은 원형 영역으로 나타납니다.

더 많은 유아 뇌 절편에서 주변 조직을 포함하지 않도록 주의하면서 미세 수술 칼로 각 조각의 RMS를 잘라냅니다. 다음으로, 플라스틱 페이스트 피펫으로 RMS 조각을 수집하고 얼음 위의 차가운 해부 매체가 들어 있는 작은 접시에 넣습니다. 그런 다음 접시를 부드럽게 회전하여 접시 중앙에 RMS 조각을 모읍니다.

플라스틱 피펫으로 조각을 모아 15ml 튜브에 옮깁니다. 파편이 튜브 바닥에 가라앉도록 두십시오. 해부 매체를 2ml의 해리 매체 T tri로 교체합니다.

그 후 P 1000 피펫을 사용하여 분절 현탁액을 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 RMS 단편을 평가합니다. 조직 조각이 담긴 튜브를 섭씨 37도의 수조에 2분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 용액을 다시 10회 피펫팅하고 단편이 분리되었는지 확인합니다.

그런 다음 5ml의 pre wormed DMEM과 10%FCS를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 433배 G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 여분의 매체를 제거하고 소생하십시오. 1ml의 예열 DMEM과 10% FCS를 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 현탁시킨 다음 동일한 배지 4ml를 더 추가합니다.

그런 다음 셀 계수를 수행합니다. 최적의 결과를 얻는 동안 각 핵 애정에 대해 최소 2.5 곱하기 10에서 6번째 세포가 필요합니다. 3-4 번 10 핵 당 6 개의 세포를 사용합니다.

세포 현탁액을 433배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 이 절차에서 가능한 한 많은 매체를 제거하십시오. 즉시 Resus, 이전에 배양된 쥐 뉴런 핵 애정 용액에 세포 펠릿을 현탁시킵니다.

실온에서 100마이크로리터의 세포 현탁액을 SI R-N-A-D-N-A를 포함하는 각 EOR 튜브로 전달합니다. 그런 다음 P 200 파이펫으로 2-3회 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 nucle affection vete의 바닥에 샘플을 추가합니다.

핵 애정을 위해 쥐 세포의 경우 G dash 0 1 3 프로그램을 사용하거나 마우스 세포의 경우 O dash 0 0 5를 사용하십시오. 그 후, 핵에 영향을 받은 샘플에 전쟁 전 DMEM 1ml와 10%FCS를 빠르게 첨가합니다. nucle affection kit에서 제공하는 플라스틱 피펫을 사용하여 5ml의 전쟁 전 DMEM과 10%FCS가 포함된 15ml 튜브로 샘플을 옮깁니다.

그런 다음 433배 G에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 여분의 모든 매체를 조심스럽게 제거하고 P 20 피펫을 사용하여 25-30 마이크로 리터의 전쟁 전 DMEM과 10 % FCS에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 30마이크로리터 이상의 매체를 사용하지 마십시오.

그런 다음 현탁액을 P 35 접시 뚜껑 안쪽에 한 방울 떨어뜨려 피펫으로 만듭니다. 그런 다음 35ml의 완전한 매체가 들어 있는 P 2 접시 위의 뚜껑을 뒤집습니다. 이산화탄소 5%와 함께 섭씨 37도의 인큐베이터에 최소 5시간 동안 그대로 두십시오.

5시간 후 뚜껑에 매달린 방울을 접시의 전체 매체로 옮깁니다. 절단 팁이 있는 P 1000 피펫 사용. 그런 다음 DNA NU 핵 감염의 경우 24시간 동안 또는 SI A HRA 핵 감염의 경우 48시간 동안 5%이산화탄소와 함께 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다.

이제 25 밀리리터의 완전한 매체를 준비하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 몇 시간 동안 사전 평형을 이룹니다. 그 동안 섭씨 80도의 음의 냉동고에서 기저막 매트릭스의 냉동 분취액을 꺼내 냉장실에서 얼음으로 해동합니다. 각 핵 애정에 대해 최대 8개의 13mm 멸균 커버 슬립이 들어 있는 6cm 접시를 준비합니다.

접착 필름으로 덮인 아이스박스에 접시를 놓습니다. 습도를 유지하려면 무릎이 있는 주가 포함된 6cm 접시를 최대 3개까지 담을 수 있는 15cm 접시 안에 축축한 티슈 스트립을 놓습니다. 다음으로, 완전한 배지를 1 대 3 비율로 haw 매트릭스에 추가하고, 재응집된 세포 클러스터를 15ml 튜브로 옮기고, 5분 동안 G를 433회 원심분리합니다.

그런 다음 여분의 매체를 제거하고 팔레트를 10 마이크로 리터의 완전한 매체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 2마이크로리터의 세포 응집체 현탁액을 각 멸균 커버 슬립에 놓습니다. 18마이크로리터의 매트릭스 완전 배지 혼합물을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 매트릭스를 전체 덮개에 펴 바릅니다.

15cm 접시에 뚜껑이 들어있는 6cm 접시를 놓은 직후 미끄러집니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 5% 이산화탄소를 15-20분 동안 가열합니다. 매트릭스가 응고된 후 각 6cm 접시에 5ml의 완전한 배지를 부드럽게 넣고 피펫 팁으로 떠 있는 커버 슬립을 누른 다음 5% 탄수화물로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 신경아세포가 세포 응집체 밖으로 이동할 수 있도록 합니다.

이 그림에서 분리된 쥐 RMS 세포는 이동 신경아세포 마커 DCX 및 베타 3 튜불린에 대해 면역 양성인 것으로 나타났습니다. 그리고 이 그림은 이동 신경아세포 마커 DCX와 PSA NCA가 쥐 밖으로 이동하는 세포에서 발현된다는 것을 보여줍니다. 마우스 Neuroblast Nu 핵 애정에 대한 RMS Explan, 해리된 마우스 RMS Neuroblast는 3차원 매트릭스에 내장된 GFP 재응집체로 핵 영향을 받고 6시간 동안 이동하도록 허용했습니다.

재응집된 세포 클러스터에서 이동하는 신경아세포는 높은 transfection 효율을 보여줍니다. 여기서, 쥐 신경아세포는 GFP를 인코딩하는 두 개의 서로 다른 플라스미드로 핵 영향을 받아 매트릭스에 매립되고 24시간 동안 이동하도록 방치되었습니다. 그런 다음 세포를 고정하고 GFP 및 베타 3 튜불린에 대한 면역 염색하여 이동 거리를 측정했습니다.

응집된 세포 클러스터는 6개의 동일한 섹터로 나뉘며, 클러스터의 가장자리와 가장 멀리 이동한 셀 사이의 거리는 각 섹터에 대해 측정됩니다. 이 그림은 GFP 양성 NUCLE 영향 세포에 의해 이동한 상대적 거리의 정량화를 보여주고 GFP 음성 비핵 영향을 받은 세포를 제어하여 신경아세포 이동을 모니터링합니다. S-H-R-N-A 핵 애정 쥐 신경아세포를 대조군 S-H-R-N-A 벡터 또는 HRNA 타겟 고정 및 액틴 번들링 단백질을 포함하는 동일한 벡터로 핵에 영향을 준 후, 세포를 48시간 동안 재응집하여 매트릭스에 내장하고 24시간 동안 이동하도록 방치했습니다.

그런 다음 응집체를 고정하고 GFP 및 베타 3 튜불린에 대한 면역 염색을 수행했습니다. 효과적인 체결 고갈은 Western Blood Analysis에 의한 S-H-R-N-A 핵 애정 후 50시간 후에 감지할 수 있으며 Acton은 여기에 로딩 컨트롤로 표시됩니다. 다음은 상대적 이동 거리에 대한 정량적 분석으로, 고정 고갈이 신경아세포 이동을 크게 손상시킨다는 것을 보여줍니다.

이 절차에 따라 산후 전기천공법과 같은 다른 방법을 수행하여 NU Nuclear Affection Migration Assay로 얻은 결과를 생체 내에서 검증할 수 있습니다.