멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

이 절차의 전반적인 목표는 aurn Erythroblast 하위 집단으로 적출 사건의 식별을 용이하게 하는 것입니다. 첫 번째 단계는 핵 생성 사건이 풍부한 개체군을 만드는 것입니다. 이는 시험관 내 적혈구 배양을 통해 이루어지며, 스트레스를 받지 않은 마우스의 대퇴골, 경골 및 골반 뼈에서 분리된 저밀도 골수 세포에서 장기적으로 시작하거나 단기 배양을 통해 이루어집니다.

스트레스 적혈구증을 일으키기 위해 이전에 정맥 절개술을 받은 쥐의 비장에서 채취한 ple cytes로 시작합니다. 배양의 마지막 단계에서 배양된 세포는 관심 형광 마커로 고정, 투과 및 염색됩니다. 이러한 세포는 이미징 유세포 분석기에서 실행된 다음 분석하여 핵 형성 세포 집단에서 적출을 진행하는 세포를 식별하고, 핵 형성 과정을 조절하고 매개하는 세포골격 구성 요소를 식별할 수 있습니다.

형광 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 짧은 시간에 훨씬 더 많은 수의 핵 세포를 관찰하고 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 적혈구 세포세포 핵 형성에 관여하는 분자 메커니즘과 같은 적혈구 형성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 적혈구 세포와 저밀도 골수 세포를 구별하려면 먼저 멸균 유세포 분석 튜브에 1ml의 배양 배지를 첨가하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 25 게이지 x 5/8인치 바늘을 투베르큘린 주사기에 부착하고 수확한 대퇴골과 경골을 통해 신선한 배양 배지를 유세포 분석 튜브로 몇 번 부드럽게 플러시합니다. IMDM으로 세포 현탁액을 5ml로 조정한 후, 15ml 튜브에 1.083g/ml 밀도 구배 세포 분리 배지 5ml에 조심스럽게 층을 이룹니다. 2 밀리리터 표시까지 모든 것을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 수집 된 버피 코트를 신선한 배양 배지로 세척하고 배양 배지에서 세포를 세척 한 후 실온에서 5 분 동안 적혈구 용해 완충액으로 적혈구를 세척하고 펠릿을 동일한 플레이트에 현탁시킵니다. 6웰 세포 배양 플레이트에 있는 세포를 성장 배지에서 웰당 5번째 세포의 10분의 5 농도로 최종 부피 2.5 밀리리터로 만들고 배양 5일 후 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

원래 배양 플레이트의 각 웰에 있는 적혈구 세포의 수를 세고 각 웰을 해당 개별 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 회전시킨 후 상등액을 흡인하고 에리트로포이에틴만 함유한 신선한 성장 배지에서 펠릿을 밀리리터당 5번째 세포의 10배의 2배 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 MS 5 개의 세포 플레이트에서 상등액을 흡인하고 적혈구 세포를 웰에 첨가합니다.

2일 후, 상층액을 저밀도 PLE cyte의 cytokines toul erythroblasts가 없는 신선한 성장 배지로 교체합니다. 5ml 주사기의 플런저를 사용하여 40미크론 스트레이너를 통해 비장을 50ml 튜브에 담습니다. 세포 스트레이너를 성장 배지로 세척하고 세포 현탁액의 최종 부피를 5ml로 조정합니다.

그런 다음 방금 설명한 대로 밀도 구배에 의해 세포층을 분리한 후 적혈구를 이가 나고 7ml의 배양 배지에서 세포를 세척합니다. 그런 다음 Resus는 사이토카인이 보충된 성장 배지에 펠릿을 현탁시키고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 하룻밤 동안 24웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1밀리리터의 최종 부피로 6개의 세포를 1-5배 배양합니다. 다음 날.

앞서 설명한 바와 같이 부착된 MS 5개의 세포를 포함하는 웰로 세포를 옮기고 6-8시간 후에 분석하고, 배양 웰에서 적혈구를 수집하고 PBS Resus에서 3.7% 포름알데히드 500마이크로리터에 고정하고 부드러운 피펫팅으로 펠릿을 현탁시킵니다. 15분 후, 마이크로 원심분리기에서 20초 동안 2000GS로 세포를 회전시키고 상등액을 흡입하고 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 마이크로 원심분리기에서 세포를 회전시킨 후 다시 상층액을 흡인하고 세포를 최소 15분 동안 얼음 위에 놓습니다.

영하 20도의 온도를 넣고 얼음 위에 아세톤 용액을 보관합니다. 그런 다음 팩스 버퍼 세척 후 표시된 대로 일련의 아세톤 세척으로 세포를 신속하게 재현탁 및 스핀다운하고 실온에서 30분 동안 적절한 항체 칵테일 100마이크로리터에 세포 펠릿을 배양합니다. 그런 다음 팩스 완충기에 있는 세포를 다시 세척한 후에, drac 5를 포함하는 팩스 완충기의 60 마이크로리터에 있는 지탱한 펠릿을 다시 중단하고 적어도 10의 실험적인 표본 당 000의 사건을 모으는 화상 진찰 유세포 분석기에 표본을 실행하십시오.

그런 다음 명시야 종횡비, 단축 대 장축의 길이 비율, 크기를 나타내는 명시야 영역을 기준으로 세포를 선택하여 분석을 시작합니다. 명시야 영역 값이 20보다 낮고 200보다 높은 이벤트는 대부분 각각 파편과 세포 응집체이며 분석에서 제외됩니다. 그런 다음 이미지의 선명도를 나타내는 gradient RMS 매개변수의 값을 기반으로 단일 셀을 분석하고, 초점이 잘 맞은 이미지를 선택하기 위해 50번째 백분위수보다 큰 gradient RMS 값을 가진 셀을 포함하는 두 번째 게이트를 만듭니다.

다음 게이트에서, 명시야 영역에 의해 측정된 세포의 크기 및 TER 19 형광 염색에 의해 측정된 적혈구 마커 TER 19에 대한 양성 반응에 기초한 세포는 각각 비 적혈구 또는 잔류 세포 응집체이며 다음 단계의 분석에서 제외됩니다. 세포는 DR Five 종횡비 강도, 핵의 단축 대 장축의 비율 및 d dr five 발현의 강도에 따라 선택됩니다. DR 5 음성 세포는 대부분 망상적혈구 및 적혈구와 같은 세포와 드래그 5 종횡비가 낮은 세포를 적출 세포입니다.

대부분 이중선은 분석 보행에서 제외됩니다. 드래그 5 개의 양성 DNA 양성 세포,이 시점에서 대부분 적혈구 세포입니다. 그런 다음 이러한 적혈구는 세포의 크기와 TER one 19 평균 픽셀 면적 또는 TER one 19 발현의 밀도를 나타내는 TER one 19 영역을 기반으로 분석되며, 이는 TER one 19 염색의 밝기를 나타냅니다.

직교 색채 적혈구는 19개의 높은 세포인 작은 TER 1로 인식됩니다. 마지막으로, ortho chromatic erythroblasts의 하위 집단은 낮은 명시야 종횡비와 높은 델타 sentu XY TUR one 19를 특징으로 합니다. DR 5는 초기 TUR 1 19 양성 망상적혈구의 중심과 DR 5 양성 핵의 중심 사이의 거리와 그녀 19 및 DNA 염색 DRAAK 5에 대한 항체와 함께

세포는 또한 일반적으로 적혈구 아세포와 핵형성 중 f 액틴의 국소화를 확인하기 위해 염색됩니다. 주목할 점은 적출의 진행은 종횡비가 감소하는 세포로 시각화할 수 있다는 것입니다. 즉, 점점 길쭉해지고 델타 OID xy TUR 1 19 드래그 5가 관찰됨에 따라 세포가 관찰됩니다.

F 액틴은 핵형성 중 절단 고랑에 집중하고 핵이 압출되면 소멸합니다. 관심 있는 다른 단백질 및 구조도 적절한 항체 또는 형광 마커로 염색하여 적출 중 이들의 역할을 이미징할 수 있습니다. 예를 들어, 편광 미세소관 형성은 핵형성 전에 야생형 직교 색채 적혈구에서 시각화할 수 있지만 콜히친으로 처리된 적혈구에서는 시각화할 수 없습니다.

콜히친에 의한 튜불린 중합 억제는 명시야 채널에서 보이는 세포체의 중심과 DR 5로 달성된 핵 염색의 중심 사이의 매개변수 델타 OID XYB FDR 5를 측정하여 입증된 바와 같이 세포 분극을 감소시킵니다. 이 절차에 따라 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 Erythroblast 섬에서 관찰된 것과 같은 적혈구증에 관여하는 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용에 관한 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적혈구가 풍부한 모집단에서 적출 이벤트를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.