Name: 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법을 이용하여 쥐 적혈구 모세포의 탈핵 이벤트를 식별하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 적혈구 생성 과정의 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 전문적인 기술 지원을 Amnis 공사 (EMD Milllipore의 일부)에서 신시내티 아동 병원 연구 재단과 리처드 마르코, Sherree 친구, 스콧 모르드개의 연구 유동 세포 계측법 코어 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08HL088126 및 R01HL116352 (TAK)를 부여하고 P30의 DK090971 (YZ).

체외 적혈구 문화 1. 장기 (예 생체 내 적혈구 분화 문화 프로토콜 Giarratana로 등. 8, 수정 및 마우스 세포에 대한 적응) 이 체외 적혈구 프로토콜의 3 단계 장기입니다. 우선 스텝 (일 0-4)은 2 × 105 세포 / ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 인터루킨 -3 (IL-3), 및 에리트로 포이 에틴 (EPO)이 보충 된 적혈구 모세포 성장 배지에 배치된다. 두 번째 단계 (5-6 일)에서, 세포 × 10 2에서 재현 탁하는 5 세포 / 만 에뽀 보충 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에 부착 기질 세포 (MS5)에 ML와 공동 배양 하였다. 세 번째 단계 (7-9 일)에, 세포는 최대 적출에 사이토 카인 (그림 1A)없이 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에서 MS-5 세포의 층에 배양. 모든 동물 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다신시내티 아동 병원 의료 센터. <ol><li> 뼈와 저밀도 골수 세포의 분리의 수확 <ol><li> 2 ML 15 ML 원뿔 튜브에 2 % 소 태아 혈청 (FBS)를 포함하는 멸균 IMDM을 추가하고 얼음에 보관. </li><li> (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입,) 기관 승인 프로토콜 다음 (또는 그 유전자 타겟 마우스없이 함께) 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스를 안락사. </li><li> , 집게와 메스를 사용하여 골반 뼈, 대퇴골, 두 다리의 경골을 분리 IMDM 2 %의 FBS가 들어있는 튜브에 추가하고 얼음에 보관. </li><li> (25-G의 X 몇 번 부드럽게 뼈를 통해 5 / 8 &quot;바늘. 세척 IMDM 2 %의 FBS와 집게 및 투베르쿨린 주사기를 사용하여 멸균 유동 세포 계측법 튜브와 플러시 뼈에 1 ㎖ IMDM 2 %의 FBS 추가 세포 현탁액에서 ~ 500 μl를 흡입하고) 뼈를 통해 다시 세척하고, 유동 cytometr으로 골수 세포를 수집 바이Y 관. 뼈가 흰색으로 나타날 때 세척이 완료됩니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너 세트를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. IMDM 2 %의 FBS와 같은 매체가 5 ML에 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조절 이용하여 셀 스트레이너를 씻으십시오. </li><li> 밀도 구배 원심 분리하여 저밀도 골수 세포 (LDBM)를 준비 :주의 깊게 매체 1.083 ㎍ / ㎖ 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 25 밀도 구배 세포 분리의 5 ML에 세포 현탁액의 5 ML 레이어 분없이 브레이크 / 낮은 가속 실온 (RT)에서. </li><li> 뜨는 전송 (모든 것을 최대 15 ML 튜브의 2-ML 마크 버피 코트를 얻기 위해 약) 새로운 15 ML 튜브에 5 분에서 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 RT. </li><li> 기음 뜨는 RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 남아있는 적혈구 (RBC)를 용해. 적혈구 모세포의 큰 순도는 경우(생화학 적 연구에 대한 예) 최종 단계에서 필요한, 자기 분리에 의해 린 NEG 세포에이 단계에서 더 LDBM 세포를 정화. </li></ol></li><li> LDBM 또는 린 NEG 세포에서 시작 생체 적혈구 분화 배양 프로토콜 (그림 1A) <ol><li> 추가 7 ㎖의 IMDM 2 %의 FBS, 5 RT에서 분 및 구성된 2 ㎖ 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM)에서 펠렛 세포를 재현 탁 525 XG에 스핀 : . 함유 StemPro-34 배지, 나. 2.6 % StemPro-34 중간 보충, C. 20 % BIT-9500, D. 900 NG / ML 황산 철, 전자. 90 NG / ML 질산 철, 바. 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민 g. 10 -6 M 하이드로 코티손 아. 갓 사이토 카인을 추가 : I) 100 NG / ML SCF, ⅱ) 5 NG / ml의 IL-3, ⅲ) 3 IU / ml의 에뽀. </li><li> 단을 사용하여 자동화 된 세포 계수기를 사용하여 수동으로 또는 현미경에서 세포를 세는ocytometer. </li><li> / 잘 EGM 2.5 ㎖ (2 × 10 5 LDBM의 세포 / ml)의 최종 부피를 37 ° C에서 배양 5 × 10 5 세포의 농도로 6 - 웰 세포 배양 접시 접시 (이 고려된다 문화의 날 # 0)입니다. </li><li> 상층 액 1.5 ㎖를 흡입 RT에서 5 분 525 XG에 회전, 3 사이토 카인을 포함하고 일 # 2에 다시 우물에 매일​​ 추가 새로운 배지 1.5 ㎖에 재현 탁하여 매체를 변경, 3, 4, 최적화 증식기. 3 일째에, 모든 세포를 제거 세고 ~ 2 × 105 세포 / ml의 웰 세포 농도를 유지하기 위해 웰 적절한 개수로 분할. 37 ° C / 5 % CO 2에서 문화를 유지한다. </li><li> 4 일에, 새로운 세포 배양 6 - 웰 플레이트의 우물 판 MS5 세포 (쥐 기질 세포 라인). MS5 세포 배양 배지는 20 % FBS를 함유하는, 100 단위 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 2 mM L-글루타민을 α-MEM된다. </li><li> 5 일에서 수를 계산자동 세포 계수기 또는 수동으로 혈구를 사용하여 현미경에서를 사용하여 원래 배양 플레이트의 각 웰에 세포 (지금은 크게 적혈구 모세포 농축). </li><li> 각 우물에서 모든 셀을 들어 올려 15 ML 원뿔 튜브로 전송, RT, 기음 상층 액에서 5 분 525 XG에 스핀 다운 및 2 × 10의 농도로 만 에뽀 (3 IU / ㎖)를 포함하는 신선한 EGM 펠릿을 용해 5 세포 / ㎖. </li><li> MS-5 세포는 전날 (공동 문화의 시간이 70 ~ 80 % 년 자랄를 대상으로) 도금 만 에뽀를 포함 EGM에있는이 우물의 적혈구 세포를 추가 한 우물에서 대기음 뜨는 (안 자신의 매체이지만 선택은, MS-5 세포는) 몇 일 동안 EGM에서 잘 남아있다. </li><li> 하루 # 6에 신선한 EPO를 추가 매체 변경합니다. </li><li> 더 추가 사이토 카인과 EGM를 사용하여, 하루 # 7 매체를 변경합니다. 일에서 9까지의 7, 세포 계측법 매일 안티 Ter119 및 SYTO-16로 염색 및 P 후 흐름을 적출에 대한 테스트 샘플멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법 (3 절에 설명 된대로)에 대한 샘플을 염색에 roceed. 참고 :. 하루에 2, 4, 6, 문화의 7에 도금하기 전에, 세포 계측법 크기 (FSC) 대 표면 마커 CD44와 Ter119을 평가하여 흐름과 적혈구 모세포 농축과 분화 배양 세포를 모니터 9 또는 CD71, Ter119 및 FSC 도 10, 11을 사용할 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 빠른 탈핵 분석, 요시다 등에 의해 기술 된 프로토콜에 따라. 수정 12 (그림 1B) <ol><li> 체외 적혈구 문화에 대한 스트레스 적혈구 유도와 기질 세포의 준비 <ol><li> IACUC의 지침에 따라 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스 (예 : 이소 플루 란 솔루션을) 마취. 마우스가 충분히 부드러운 뒷발 핀치에 반사 반응의 부재과 확인하여 마취되었는지 확인절차를 수행하는 동안 정기적으로 호흡. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다. </li><li> 500 μL의 최종 볼륨에 출혈이 꼬리를 통해 스트레스 적혈구 생성을 유도한다. 인슐린 주사기를 사용하여 복강 동물의 유체 인공 호흡 (주입하기 전에 Trendelenburg 위치에 동물을 보유하고 내부 장기를 손상하지 않도록 낮은 복부에 주입) 보장하기 위해 생리 식염수 같은 양을 주입. </li><li> 새장을 이동하기 시작하고 떨어지지 않고 서서 걸을 수있는 동물로 표시된대로 모터 컨트롤을 회복 할 때까지 무인 마우스를 방치하지 마십시오. phlebotomized 마우스는 다른 마우스없이 케이지에 배치됩니다. </li><li> 이일 후, 24 웰 세포 배양 플레이트의 우물에서 MS-5 세포를 접시. MS5 세포 배지에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 MS-5 세포를 품어 (-MEM 20 % FBS를 포함, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM의 L-글루타민)을 목표로 70 ~ 80이어야합니다 %의 합류 전48 시간 후 N 판 우물. </li></ol></li><li> 비장과 비장 세포의 처리의 수확 <ol><li> 네 일 (96 시간) 스트레스 적혈구 유도 한 후, 이전에 IACUC 승인 프로토콜 (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입)을 통해 마우스를 출혈 안락사. </li><li> 수확 비장과 IMDM 2 % FBS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 넣어 얼음에 보관. </li><li> 위로 실험실, 멸균 조건하에 조직 배양 후드에서, 50 ㎖의 튜브 위에 설정된 40 μm의 셀 스트레이너에 비장 함유 관을 반전. 5 ㎖의 플라스틱 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 분쇄. </li><li> IMDM 2 %의 FBS와 셀 스트레이너를 세척하고 같은 매체를 이용하여, 5 ml의 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 조심스럽게 5 ㎖의 밀도 구배 세포 분리에 5 ㎖의 비장 세포 현탁액 레이어 매체없이 브레이크 / 낮은 가속 RT에서 25 분 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 1.083 ㎍ / ㎖. </li><li> 이전새로운 15 ML 튜브 및 RT에서 5 분 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 상층 액 (버피 코트를 얻기 위해 15 ML 튜브의 2-ML 마크에 대한 아래로 용액) . </li><li> RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 기음 뜨는를 Lyse 적혈구. </li><li> 세포를 세척하고 희석하고 4 ℃에서 5 분 525 XG에서 RBC의 용해 버퍼와 스핀을 중화 7 ML의 IMDM에게 2 %의 FBS 추가 </li><li> 기음 뜨는 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM) 2 ㎖에 펠렛 세포를 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 플라스틱에 적혈구 모세포 농축 분리 된 저밀도 비장,, (빨리 체외 적혈구 문화의 첫 번째 단계)의 문화 <ol><li> 자동 세포 계수기 또는 수동 혈구에 의해 세포를 계산합니다. 이 단계에서 비장 당 고립 된 세포의 수는 평소 ~ 15 × 10 6입니다. </li><li> F에 (사이토 카인을 포함하는 더 EGM에있는 세포를 일시 중지원고 판 농도) : SCF 50 겨 / ㎖, IL-5 NG / ML 및 에뽀 2 U / ㎖. </li><li> / 24 - 웰 세포 배양 접시에 1 ㎖ / 웰 (물론 세포의 총 수에 따라 당 세포의 같은 수의)의 최종 부피에서 37 ° C에서 O / N을 배양 플레이트 1-5 X 10 6 세포 5 % CO 2. </li></ol></li><li> MS5 세포에 적혈구 모세포 (빠른 체외 적혈구 문화의 두 번째 단계의 문화 <ol><li> 대기음 아니라 플라스틱 뜨는 아니라 각 얼음에 5 분 동안 PBS에서 차가운 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 (높은 적혈구 모세포 풍부한) 세포를 올립니다. </li><li> (사이토 카인없이) EGM에 한 번 세탁하고 동일한에 재현 탁, 신선한 튜브에 세포를 넣고. </li><li> 에 1 ~ 2 ㎖의 볼륨 접시 5 × 5 -1 X 10 6 세포 각 MS5 셀 코팅 된 24 웰 플레이트의 잘. 약리 억제제가 실험에 사용되는 경우, 현재 적절한 농도를 추가. </li><li> 인도를 6 ~ 8 시간 (시간을 품다치료 WT 샘플의 약 30 % -40 %의 안구 적출술)의 현미경 관찰. MS-5 세포에 적혈구 모세포의 바인딩은 자신의 핵의 제거를 가속화합니다. </li><li> 얼음에 5 분 동안 차가운 PBS + 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 각 우물에서 세포를 올립니다. 적혈구 모세포와 함께, MS-5 세포는 또한 수집하지만이 나중에 쉽게 FSC 하이 Ter119으로 유세포 분석에서 제외 할 수 있습니다 - 세포. </li><li> 이 단계에서 세포는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 분석을 위해 고정 및 염색 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 핵의 제거시 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 지역화를위한 적혈구 모세포의 염색 <ol><li> , PBS로 세포를 씻어 5 RT에서 분 대기음 뜨는 525 XG에 스핀. </li><li> (고정 시간이 항에 따라 다를 수 있습니다 15 분 동안 PBS 3.7 %의 포름 알데히드 500 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포를 수정세대 프로빙) 부드럽게 피펫 팅된다. </li><li> 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브로 전송하고 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 20 초, 대기음 뜨는 부드럽게 각 튜브 및 피펫 500 μL PBS를 추가하여 하나의 세척을 수행하기위한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀. </li><li> 20 초, 기음 뜨는에 대한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀 적어도 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지. Permeablization는 3.6-3.9 신속하고 효율적으로 수행되어야하고, RT에서 회전 / 포부 다음, 세포 펠렛은 바로 세포가 더 나은 자신의 무결성을 유지하기 위해서는, 얼음에 다시 넣어해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> -20 ° C 냉동고에서 아세톤 솔루션을 꺼내 얼음에 넣어. 부드럽게 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤 DH (2 O 1:1)과 피펫에서 첫 번째 셀 펠렛을 재현 탁하여 세포를 투과. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 500 μL에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG60; 부드럽게 피펫 팅하여 얼음처럼 차가운 100 % 아세톤. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 부드럽게 피펫 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤에 한 번 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 2,000 20 초 XG, 대기음 뜨는 부드럽게 피펫 팅에 의해 차가운​​ FACS 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA)에 한 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 그 분자에 대한 항체 마커 라벨 칵테일을 준비 적혈구 세포 얼룩에 대한 F-액틴 염색 1 μl/100 μL Ter119-PECy7 0.1 U/100 μL의 AF488-phalloidin도 있습니다. 대체 또는 추가 염색은 (1시 50분), AF-594-복합 콜레라 독소 서브 유닛 B 지질 뗏목에 라벨 (1:200), 안티 pMRLC (Ser19) AF-488-항-β-tubulin에 항체를 사용하여 수행 할 수 있습니다 인산화 된 마이 오신 규제 라이트 안티 - 토끼 AF-488 - 복합 이차 항체 (1:400) 다음 체인 (1시 50분), 및 안티-γ-부르 돈 관에 대한 일차 항체린 차 토끼 항체 (1:100)는 안티 - 토끼 AF-555 - 복합 이차 항체 (1:300) 하였다. </li><li> 상층 액을 흡인 후, 부드럽게 마커 칵테일, 피펫 100 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 핵 얼룩 DRAQ5의 2.5 μM을 포함하는 FACS 버퍼를 준비합니다. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 DRAQ5를 포함하는 60 ㎕의 FACS 버퍼에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 2,000 XG에 스핀 다운, FACS 버퍼에 세포를 씻으십시오. </li><li> 촬상 실행할 샘플 촬상 특정 분석 소프트웨어의 유동 세포 계측기를 사용하여, 실험 당 적어도 10,000 이벤트를 수집 이전에 출판 (13)으로 원시 데이터 파일을 보정하고,도 2에 도시 된 바와 같이 결과를 분석하는 유동 세포 계측기. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 적혈구 생체 성공적, 대규모 생산을 달성하기 위해 효율적으로 재현하기 가장 어려운 시험 관내 적혈구 조혈 배양 단계이기 때문에 최근에는 적혈구 모세포 적출술의 연구는 운동량을 증가를 얻고있다. 최근까지, 적혈구 모세포 안구 적출술의 연구는 주로 형광 현미경을 이용하고 세포 계측법 방법을 흐른다. 형광 현미경 방법은, 참여 분자를 식별하는 데 도움이라도 특정 시점에 고정 수백 개의 셀 내에 적출술을 시행 정색 적혈구 모세포의 수가 적은 식별 현미경 관찰의 일을 필요로한다. 방법 유동 세포 계측법, 반면에, 문화 적출술의 속도뿐만 아니라,이 과정에서 특정 분자의 약물 또는 유전자 조작의 효과를 평가하는데 매우 유용하지만, intracellul에 어떤 데이터를 제공하지 않는다이러한 분자의 AR 현지화. 그것이 유세포 세포 수천의 형태 학적 데이터 모두의 신속한 취득 할 수 있으므로 멀티 스펙트럼 영상 유동 세포 계측법 유세포 면역 형광 현미경의 ...

포유류의 적혈구 계보 내의 터미널 차별화 정색 적혈구 모세포는 망상 2를 생성, 그 막 쌌다 핵 (pyrenocyte)를 1 추방 통해 적출의 극적인 과정으로칩니다. 또한 성공의 속도 - 제한 단계가이 프로세스의 실기구는, 대규모는 체외에서 적혈구의 생산은 아직 완전히 해명되지 않는다. 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화는 형광과 전자 현미경 3-5의 사용에 의존한다. 이 지루한 과정은 일반적으로 안구 적출술 이벤트의 제한된 수의 확인 결과 항상 의미있는 통계 분석을 허용하지 않습니다. 맥그래스 등. (6)에 의해 이전에 설명 적혈구 모세포 식별하는 방법에 확장, 우리는 멀티 스펙트럼 이마에 의해 적출 이벤트를 확인하고 연구의 새로운 접근 방식을 개발했습니다측정 값을 구하는 통계 분석을 수행하는 관측 충분한 수를 제공 할 수 ging를 유동 세포 계측법 (유체의 다 항목의 고속 이미징 셀, 유동 세포 계측법, 형광 현미경으로 결합 법) 07. 여기서, 우리는 적혈구 모세포를 동기화하고 평가시에 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 우선이 시험 관내 적혈구 조혈의 배양 방법을 설명한다. 그 다음 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다. 샘플은 사이토 촬상 흐름에서 실행하고 수집 된 세포는 적혈구 모세포 정색 6 식별 적절 게이팅된다. IMA 시야에서 측정 한 정색 적혈구 모세포이어서 그들의 애스펙트 비에 기초 분석ging를 각각 Ter119 및 DNA 스테인드 영역의 중심 간의 거리로 정의되는 파라미터 델타 중심 XY Ter119-DNA, 그들의 값 대. 낮은 화면 비율과 델타의 중심 XY Ter119/DNA와 세포의 인구는 고도의 세포를 탈핵에 충실. / - - 또는 결합 RAC2 - / - 야생형 (WT)를 사용하여 RAC2에 RAC1의 MX-크레 매개 조건부 삭제와 적혈구 모세포 대 적혈구 모세포; Rac3 - / - 유전 적 배경 및 다중 분광 영상의 흐름이 소설 분석 프로토콜은 세포 계측법, 우리는 최근 적출 비대칭 세포질 분열을 닮아 라 세미 GTPases에 의해 부분적으로 규제 actomyosin 링의 형성이 탈핵의 진행 7 중요하다는 것을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>&알파; MEM 배지</td><td>CellGro</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM 배지</td><td>Hyclone (Thermo Scientific)</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 SFM</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10640</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 영양 보충제</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10641-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>512450</td><td></td></tr><tr><td>BIT9500</td><td>Stemcell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>하이클론(Thermo Scientific)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>하이클론(Thermo Scientific)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>하이클론(Thermo Scientific)</td><td>SH30590.01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Butler-Schein</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1.083 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acetone Sigma-Aldrich</td><td>534064</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP 531-500</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>줄기세포 인자 (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>약국<td></td><td>에서 구할 수</td> 있는 <td>AMGEN</td></tr><tr><td>CD44-FITC 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-PECy7 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>557853</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-AF488</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-tubulin-AF488 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>#3623</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit AF488-secondary antibody</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit AF555-secondary antibody</td><td>Invitrogen (Life 기술)</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>AF594-cholera toxin B subunit</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34777</td><td></td></tr><tr><td>pMRLC (Ser19) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>#3671</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T-3559</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>황산철</td>, <td>시그마</td><td>F7002</td><td></td></tr>, <tr><td>질산철</td><td>, 시그마</td><td>F3002</td><td></td></tr>, <tr><td>EDTA</td>, <td>피셔 사이언티픽</td><td>BP120500</td><td></td></tr>, <tr><td>15ml 튜브</td>, <td>BD 팔콘</td><td>352099</td><td></td></tr>, <tr><td>50ml 튜브</td>, <td>BD 팔콘</td><td>352098</td><td></td></tr>, <tr><td>6웰 플레이트</td>, <td>BD 팔콘</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24- 웰 플레이트</td>, <td>BD Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Flow Tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Tuberculin 주사기</td><td>BD 309602</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘 25-G 5/8</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Capped flow tubes</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>40-&mu; m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>메스(일회용)</td><td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto 유세포분석기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImagestreamX Mark II 이미징 유세포분석기</td><td>AMNIS(EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 데이터 탐색 및 분석 소프트웨어(IDEAS) 버전 4.0 이상.</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950 세포 계수기</td><td>Drew Scientific</td><td>CDC-9950-002</td><td></td></tr><tr><td>NAPCO 시리즈 8000WJ 인큐베이터</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Mini Mouse Bench 원심분리기</td><td>Denville</td><td>C0801</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

포유류의 적혈구는 망상 적혈구 형성에 결과 적출의 극적인 과정을 마칩니다. 안구 적출술의 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 현미경으로 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화를 연구 할 때 발생하는 일반적인 문제는 안구 적출술을받은 세포의 충분한 수를 관찰하는 어려움이있다. 우리는 흐름의 다중 매개 고속 세포 이미징 (멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법), 효율적으로 탈핵 이벤트의 상당 수를 파악하기 위해, 유동 세포 계측법과 면역 형광 현미경을 결합하는 방법을 사용하여 새로운 분석 프로토콜을 개발, 그것은 할 수 있습니다 측정을 획득하고 통계 분석을 수행합니다. 우리는 먼저 여기 뮤린 적혈구 모세포를 동기화 번째에서 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 두 개의 체외 적혈구의 배양 방법을 설명평가의 전자 시간. 다음, 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다. 크기 및 정색 적혈구 모세포를 식별하는 데 사용되는 DNA/Ter119 염색법과 함께, 우리는 기다란 세포와 &quot;델타 중심 XY Ter119/Draq5의 인식에 도움 시야 채널 내의 셀의 파라미터&quot;종횡비 &quot;를 활용 &quot;그 Ter119 염색 (초기 망상)의 중심이 멀리 떨어져 DRAQ5 염색 (핵 겪고 압출)의 중심에서있는 세포 사건의 식별 따라서 명백히하다에 대한 셀을 표시 할 수 있습니다. 높은 델타의 중심과 낮은 화면 비율 정색 적혈구 모세포 인구의 일부는 매우 세포를 탈핵에 충실.

첫째, 세포는 자신의 브라이트 화면 비율 (자신의 장축 대 자신의 미성년자의 길이의 비율)와 자신의 명 시야 영역 (자신의 크기를 나타내는)를 기반으로 분석된다. 명 시야 영역 값 (20)보다 낮은 200보다 높은과 이벤트는 각각 주로 파편과 세포 집계하고, 분석 (그림 2A)에서 제외됩니다. 하나의 셀 (게이트 &quot;R1&quot;)는 다음 이미지의 선명도를 나타내는 그라데이션 RMS 매개 변수에 대한 자신의 값을 기준으로 분석됩니다. 게이트 &quot;R2&quot;는 초점 (그림 2B)에서 잘 촬영 한 이미지를 선택하기 위해 50 번째 백분위 수 이상 기온 ​​RMS 값을 포함하는 셀을 만들어집니다. 세포는 그들의 명 시야 영역에 의해 측정 된 자신의 크기에 따라 게이트 및 Ter119 형광 얼룩 평균 픽셀 매개 변수에 의해 측정 된 적혈구 마커 Ter119에 대한 자신의 양성 (게이트 &quot;Ter119 긍정적&quo...

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

이 절차의 전반적인 목표는 적혈구 모세포(Erythroblast) 하위 집단에서의 핵 배출(enucleation) 사건의 식별을 용이하게 하는 것입니다. 첫 번째 단계는 핵 배출 사건이 풍부한 집단을 생성하는 것입니다. 이는 비스트레스 마우스의 대퇴골, 경골 및 골반뼈에서 분리한 저밀도 골수 세포로부터 시작하는 장기 배양 또는 단기 배양을 통한 인 비트로(in vitro) 적혈구 생성 배양으로 수행됩니다.스트레스 적혈구 생성(stress erythropoiesis)을 유도하기 위해 이전에 정맥 절개술(phlebotomy)을 시행한 마우스의 비장에서 추출한 전구 적혈구(proerythroblasts)로 시작합니다. 배양 마지막 단계의 배양 세포를 고정 및 투과화한 후, 관심 있는 형광 마커로 염색합니다. 이 세포들을 이미징 유세포 분석기(imaging flow cytometer)로 분석하여, 핵이 있는 세포 집단 중 핵 탈출(enucleation)이 진행 중인 세포를 식별함으로써 핵 탈출 과정을 조절하고 매개하는 신호 전달 및 세포 골격 성분을 확인할 수 있습니다.형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 많은 수의 유핵 세포를 짧은 시간 내에 관찰하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 적혈구모세포의 유핵화에 어떤 분자적 기전이 관여하는지와 같은 적혈구 생성 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저밀도 골수 세포로부터 적혈구계 세포를 분리하기 위해, 먼저 멸균된 유세포 분석 튜브에 1 mL의 배지를 추가하십시오.그런 다음 투베르쿨린 주사기에 25 gauge 5/8 inch 바늘을 장착하고, 수집한 대퇴골과 경골을 통해 신선한 배양 배지를 유세포 분석 튜브로 몇 차례 부드럽게 세척합니다. IMDM을 사용하여 세포 현탁액의 부피를 5 mL로 조절한 후, 15 mL 튜브에 담긴 1.083 g/mL 밀도 구배 세포 분리 배지 5 mL 위에 조심스럽게 층을 이룹니다. 모든 내용물을 새로운 15 mL 튜브의 2 mL 표시선까지 옮기고, 수집된 버피 코트(buffy coat)를 신선한 배양 배지로 세척합니다. 배양 배지로 세포를 세척한 후, 동일한 플레이트에서 펠릿을 재현탁하고, 3 mL의 적혈구 용혈 버퍼(red blood cell lysis buffer)에서 실온으로 5분 동안 적혈구를 용혈시킵니다. 6-well 세포 배양 플레이트에 웰당 5 × 10⁵ cells

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

시험관 내 미세핵 분석은 유전체 독성 및 세포 독성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법이지만 수동 현미경 을 사용하여 분석법을 채점하는 것은 힘들고 주관성 및 득점자 간 가변성으로 고통받고 있습니다. 이 논문은 다중 스펙트럼 화상 진찰 유동 세포측정을 사용하여 분석의 완전 자동화된 버전을 능력을 발휘하기 위하여 개발된 프로토콜을 기술합니다.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

배우세요 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법을 이용하여 쥐 적혈구 모세포의 탈핵 이벤트를 식별하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 적혈구 생성 과정의 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

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