식충 식물의 조직에서 생존 가능한 다세포 땀샘의 분리, Nepenthes

본 방법의 목적은 분자 분석을 위해 신선한 식물 조직으로부터 단일하고 순수한 선(gland)을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 네펜데스(nepenthe) 식물에서 포충낭을 채취합니다. 그 다음, 조직의 신선도를 유지하기 위해 얼음 위에서 마이크로 샘플링 플랫폼에 조직을 직접 고정합니다.

마이크로 샘플링 과정 동안, 샘플을 정밀하게 분리하여 PCR 튜브로 옮긴 후 수집된 물질에 대해 정량 PCR 분석을 수행합니다. 최종적으로, 기계적 마이크로 샘플링 기술을 사용하여 식충 식물로부터 단일하고 순수한 샘플을 얻음으로써, 향후 분자 분석을 위한 특정 조직을 신속하고 미세 침습적으로 제공합니다. 식충 식물은 동물성 단백질을 소화할 수 있는 능력을 갖춘 식물군 내의 전문종입니다.

분자 수준에서 이것이 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 지식은 여전히 제한적입니다. 이 문제를 다루기에 적합한 모델은 천재 충수의 이미지 혼합인데, 왜냐하면 여기에는 소화 과정에 기여하는 선(gland)을 생성하는 뚜렷한 장기 이미지들이 포함되어 있기 때문입니다. 충수 내에서.

이러한 샘들은 하단 사진의 내부에 위치하고 있습니다. 분자 분석을 위해서는 지름이 약 100 to 200 micrometers인 이 넓고 평평한 구조물을 신선한 조직에서 직접 분리해야 합니다. 또한, 이 샘들이 보호 후드로 덮여 있어 분리 과정이 더 까다롭습니다.

샘플링 과정에서 3차원 관찰이 필요하고 정밀하게 3차원으로 이동할 수 있는 도구가 요구되는 카포트(carport)와 유사한 구조를 가지고 있었기 때문에, 기존의 미세 절단 기술로는 우리의 문제를 해결할 수 없음을 알게 되었습니다. 예를 들어, 레이저의 경우 식물 조직의 높은 수분 함량으로 인해 실패했습니다.

따라서 우리는 3D 구조의 조직 일부나 단일 세포를 분리하기 위해 aika라고 불리는 새로운 기계적 미세 절제 기술을 사용하고 도입하기로 결정했습니다. 이 기술은 3D 마이크로 매니퓰레이터가 통합된 실체 현미경 또는 공초점 현미경으로 구성되어 있어, 매우 낮거나 높은 시료에 쉽게 접근할 수 있습니다. 이는 현미경과 함께 하나의 기둥처럼 이동하며, 식물 시료의 경우 주로 마이크로 모세관을 사용합니다.

하지만 충수돌기 유리(appendix glass)의 경우, PTO 구동 마이크로 포셉이 본 실험 절차에 더 효과적이라는 것을 확인했습니다. 충수돌기 실험을 위해 플랫폼을 수정하였습니다. 소형 VXY 스테이지가 얼음으로 채워진 용기를 지지하며, 이 용기는 홀더에 고정된 조직 샘플과 샘플을 배치할 글랜드를 모두 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽니다.

얼음은 조직 내의 분해 과정이 충분히 지연되도록 하여 조직의 원래 분자 상태를 인식할 수 있게 합니다. 다음 절차는 이미지의 하단 부분으로부터 확립되었습니다. 약 1~2cm² 크기의 조각을 절제한 후 평평하게 폅니다.

그 후 조직을 양면테이프를 사용하여 슬라이드 글라스 위에 고정합니다. 이 조직 샘플을 RNase-free water로 덮어 샘플링 과정 동안 습윤 상태를 유지합니다. 그다음 샘플의 샘플링 대상 부위인 샘과 보호 후드 부분이 매니퓰레이터 쪽을 향하도록 배치합니다.

샘플과 도구 사이의 각도를 조정하여 샘플의 샘플의 샘플의 glands가 평평하게 놓이도록 해야 합니다. 유니버설 스테이지를 사용하면 두 축으로 기울기를 조정할 수 있으며, 현미경 하에서 쉽게 보정할 수 있습니다. 금속 스테이지는 현미경 하에서 샘플의 온도를 낮게 유지해 줍니다.

샘 조직의 선(gland)들이 뚜렷하게 구분됩니다. 형광을 통해 선과 보호 후드의 윤곽을 쉽게 식별할 수 있습니다. 샘 분리를 위해 FSE 필터로 시료를 관찰합니다.

RNA 추출을 위해 UV 필터를 사용합니다. 선 조직을 분리하기 위해서는 마이크로 포셉(micro forceps)의 매우 정밀한 위치 지정이 필수적입니다. 저속 모드에서 도구를 조작하는 것을 권장합니다.

마이크로 포셉을 사용하여 선(gland)에 접근하고 조이스틱으로 포셉 팔을 가장자리에 위치시킨 후, 마이크로 포셉을 조심스럽게 닫습니다. 그런 다음 주변 조직으로부터 선을 들어 올립니다. 정밀하게 분리하면 하부의 혈관 조직이 드러나는 온전한 강(cavity)을 확인할 수 있습니다.

분리된 샘은 PCR 튜브로 옮겨 준비된 버퍼에 넣습니다. 이 방법을 검증하기 위해, 유동성 피치(pitch of fluid)로 분비되는 atoma leg protein short, TAP의 유전자 발현을 측정하였으며, 게놈 DNA의 사전 추출 과정 없이 샘에서 유전자를 직접 증폭할 수 있음을 확인하였습니다. 이는 분리된 조직에 PCR 반응 혼합물을 추가하는 것만으로 가능합니다.

일련의 실험에는 서로 다르게 처리된 네펜데스(nepenthes)의 선(gland)과 그 주변 표피 조직의 샘플이 사용되었습니다. 각 실험마다 총 RNA를 추출하였습니다. 얻어진 mRNA는 역전사를 통해 해당하는 cDNA로 합성되었으며, 이후 PCR 반응에 사용되었습니다.

관심 유전자 서열을 증폭하기 위해, 실시간 PCR을 사용하여 네펜테스(nepenthes) 선 조직과 표피에서의 TLP 발현 수준을 비교하였습니다. 그 결과, *Nepenthes allotta*와 *Nepenthes miis* 모두에서 표피 조직 대비 선 조직의 비율이 1보다 작게 나타나, 분비선에서의 TLP 전사체 수준이 표피 조직보다 더 높음이 확인되었습니다. 이는 먹이와의 접촉이 유전자 발현을 유도할 수 있는지 테스트하기 위함이었습니다. 먹이 포획 후, TLP 전사체 수준과 무처리 사진 및 *Drosophila melanogaster*를 공급한 사진을 비교하였습니다.

표피 조직에서 TLP 발현이 더 높게 나타났습니다. 선 조직과 표피 조직의 TLP 전사 수준 및 처리된 nepenthes miis의 사진을 비교하였습니다. 두 조직 유형 모두에서 TLP 발현이 상향 조절된 것은 포충낭 액 단백질의 생성이 실제로 먹이에 의해 유도될 수 있음을 나타냅니다.

PCR 결과는 먹이 섭취가 두 조직 유형 모두에서 TLP 발현을 효과적으로 변화시키며, 샘(gland)과 표피 사이의 발현 비율을 전환할 수 있음을 시사합니다. 당사는 FA 충수 조직에서 cleanse를 수확하는 효율적인 방법을 개발하였으며, 유전자 발현 실험을 수행하기에 충분한 양의 mRNA를 분리하였습니다. 우리가 개발한 이 새로운 방법을 통해 충수 샘의 전사체학(transcriptomics)뿐만 아니라 대사체학(metabolomics) 및 단백질체학(proteomics)까지 연구하는 것이 가능해졌습니다.I.