Name: 식충 식물의 조직에서 생존 가능한 다세포 땀샘의 분리, Nepenthes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 학습하세요 Nepenthes 식충 식물의 생존 가능한 다세포 땀샘을 기계적 미세 분리 기법으로 분리하는 방법을. 이 기술은 분자 분석 및 생화학 연구에 활용됩니다.

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식물을 재배해 준 예나 프리드리히 쉴러 대학교 식물원의 MPI-CE 온실 팀과 지원을 해준 빌헬름 볼란트와 막스 플랑크 협회에 감사드립니다.

1. 식물 재료 준비
<ol>
	<li>모든 Nepenthes 종은 화학 생태학을위한 MPI 또는 독일 예나에있는 식물원의 온실에서 자랐습니다.</li>
	<li>분비 조직을 준비하기 위해 투수를 수확하고 뚜껑, 골막, 미끄러운 부분을 포함한 위쪽 1/3을 제거합니다. 투수는 신선하게 사용하거나 액체 질소에서 냉동 사용할 수 있으며 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 투수 조직의 미세 해부
<ol>
	<li>마이크로 샘플링 플랫폼은 실체 현미경과 마이크로 매니퓰레이터로 구성되며, 현미경 본체에 직접 부착되어 3D 조이스틱으로 작동됩니다. 여기에서는 아우레카의 초기 프로토타입이 문서화된 대로 사용되었습니다(그림 2A).</li>
	<li>Nepenthes 투수에서 분비샘을 해부하기 위해 투수는 마이크로핀셋을 사용하여 매니퓰레이터에 부착합니다(그림 2A 및 2B).</li>
	<li>RNA 추출을 위해 모든 기구(면도날, 핀셋, 미세 조작기, 마이크로 집게, 물체 슬라이드)를 RNaseZAP으로 처리합니다.</li>
	<li>RNA 추출을 위해 PCR 튜브에 9 μl nuclease-free water와 1 μl RNase inhibitor를 첨가하여 수집 튜브를 준비합니다. 조직 샘플에서 직접 PCR을 수행하려면 뉴클레아제가 없는 물(10μl)만 사용하십시오.
	<ol>
		<li>신선하거나 냉동된 투수를 가지고 면도날과 핀셋을 사용하여 분비샘이 포함된 1-2cm2개의 조직을 제거합니다. 조직을 물로 씻으십시오. RNA를 추출할 경우 0.1% 디에틸피로카보네이트(DEPC)를 첨가합니다.</li>
		<li>양면 접착 테이프로 식물 재료를 물체 슬라이드에 고정하고(글랜드로 덮인 표면이 위쪽을 향해야 함, 그림 2C 및 2D) 이동식 테이블로 적용해야 하는 범용 스테이지에 접착 테이프로 슬라이드를 고정합니다.</li>
		<li>핵산을 추출하려면 얼음에서 준비해야 합니다. 따라서 평평한 스티로폼 상자를 가져 와서 샘플이 들어있는 범용 스테이지를 내부에 놓고 상자에 얼음을 채 웁니다. 그런 다음 상자를 현미경 아래에 놓습니다.</li>
		<li>준비를 위해서는 땀샘의 위치가 매우 중요합니다. 분비선은 부분적으로 보호 후드로 덮여 있으며(그림 3) 한쪽에서 겸자로만 접근할 수 있습니다. 또한 겸자에 대한 샘플의 각도는 Nepenthes 종에 따라 범용 스테이지 테이블을 약 135° 기울여 조정해야 합니다.</li>
		<li>현미해부는 육안 제어 하에 수행됩니다. 분비샘 분리를 위해 UV가 아닌 필터를 사용하여 DNA와 RNA의 분해를 제한하십시오.</li>
		<li>제어판을 통해 micromanipulator와 겸자를 선택한 글랜드로 이동합니다. 땀샘에 도달하면 겸자의 각 팔을 땀샘의 양쪽에 놓습니다. 겸자를 닫아 나머지 조직에서 샘을 제거합니다(그림 4A).</li>
		<li>집게에 부착된 글랜드를 물체에서 멀어지게 하고 수집 튜브로 향하게 합니다. 집게의 맨 끝을 튜브의 용액과 접촉시킵니다(그림 4B). 겸자를 열어 분비선이 풀리는 것은 땀샘이 도구 끝에 달라붙는 경향이 있기 때문에 잘 관찰해야 합니다. 조직은 PCR 또는 RNA 추출까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nepenthes 조직에서 직접 PCR 증폭
<ol>
	<li>제제 방법의 효율성을 입증하기 위해 DNA 추출 단계 없이 분비선 조직에서 직접 PCR 접근법을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>PCR 확대 사용 유전자 특정한 뇌관을 위해; 여기에서 thaumatin 같이 단백질 (TLP)의 순서를 위해 암호화합니다 (앞으로: 5' - CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', 반전: 5' - CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>10 μl의 뉴클레아제가 없는 물을 함유한 PCR 튜브에 1-5개의 땀샘을 수집합니다. 50 μl 반응의 경우 5 μl의 10x Taq 완충액, 1 μl 10 mM deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), 3 μl 25 mM MgCl2, 0.4 μl (1.25 U) Taq DNA 중합효소, 각 프라이머 1 μl (100 pmol) 및 28.6 μl의 nuclease-free water를 추가합니다.</li>
		<li>뒤에 오는 프로그램을 가진 thermocycler에 있는 PCR 반응을 실행하십시오: 3 분 동안 처음 변성 94 °C; 변성 (30 SEC 동안 94 °C), 어닐링 (30 SEC 동안 59 °C), 및 연장 (1 분 동안 72 °C)의 35 주기; 및 72 °C에 10 분의 마지막 연장 단계.</li>
		<li>아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 산물의 증폭을 증명합니다. 따라서 1.5%(w/v)의 아가로스를 사용하여 1x TAE(40mM Tris 염기, 20mM 빙초산, 1mM EDTA, pH 8) 완충액에 용해시킵니다. 아가로스가 녹을 때까지 용액을 전자레인지에 가열합니다. 100ml 아가로스 용액에 1μl 브롬화 에티듐(10μg/μl)을 첨가하여 다운스트림 시각화를 수행합니다. 전기영동 챔버에서 약 20분 동안 300V, 115mA의 1x TAE 버퍼에 겔을 넣습니다. TLP 앰플리콘의 올바른 크기는 690bp여야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 작은 조직 샘플에서 RNA 추출 및 역전사
<ol>
	<li>얼음 위에서 다음 단계를 수행합니다. RNA 추출을 위해 두 가지 추출 방법, 즉 전체 RNA 추출을 위한 Micro Kit와 마그네틱 비드가 적용된 mRNA 분리 키트가 사용되었습니다.</li>
	<li>1 μl RNase inhibitor와 9 μl의 nuclease-free water를 함유한 PCR 튜브에서 미세화제를 통해 최소 30개의 분비샘을 수집합니다. 그 후, 75 °C에 10 분 동안 thermocycler에 있는 조직을 lyse.</li>
	<li>총 RNA 추출.
	<ol>
		<li>준비 후 샘플에 90μl의 용해 용액을 추가하고 75°C에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 반응 혼합물을 컬럼(키트와 함께 제공)에 로드하고 제조업체의 설명서에 설명된 대로 세척 단계를 진행합니다.</li>
		<li>RNA를 10μl 용출 용액으로 각각 2회 용출하고 DNase I 처리를 계속합니다.</li>
		<li>추출된 RNA 20 μl에 10x DNase I 완충액 2 μl와 DNase I 1 μl(RNA 추출 키트와 함께 제공됨)를 추가하고 37°C에서 1시간 배양합니다.DNase 불활성화 시약 2 μl를 첨가하여 반응을 중지하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 최대 속도로 1.5분 동안 원심분리 단계를 거친 후 RNA는 새로운 RNase-free 튜브로 전달될 수 있습니다. 분광 광도계를 사용하여 각 샘플의 RNA 농도를 측정합니다. 샘플은 -80 °C에서 보관해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>마그네틱 비드를 이용한 mRNA 추출.
	<ol>
		<li>용해/결합 완충액(키트에 제공됨)을 사용하여 샘플 부피를 100μl로 조정하고 75°C에서 10분 동안 배양합니다. Oligo(dT)25 돌출부와 함께 제공된 20μl의 마그네틱 비드를 추가하고 실온에서 5분 동안 반응을 혼합합니다. mRNA는 폴리(A) 꼬리에 의해 비드의 올리고(dT)25 돌출부에 결합합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 마그네틱 비드에 결합된 mRNA의 세척 단계를 수행합니다. 용액은 자석을 사용하여 제거할 수 있습니다. 20 μl 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 비드를 재현탁합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 1 시간 동안 2U (1 μl)의 DNase (2 μl 10x DNase 완충액 및 17 μl nuclease-free water)로 샘플을 처리하여 게놈 DNA의 오염을 제거합니다. 그 후, 효소 용액은 자석에 의해 제거되고 비드는 20 μl의 10 mM Tris-HCl 완충액에 재현탁됩니다. RNA는 비드에 부착되어 있기 때문에 RNA 농도를 측정할 수 없습니다. 샘플은 -80 °C에서 보관해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>역전사의 경우 cDNA Synthesis kit를 사용하십시오. 반응은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
	<ol>
		<li>총 RNA의 역전사를 위해 1 μl(100 pmol) Oligo(dT)20 프라이머 또는 1 μl(0.4 μg) 무작위 헥사머, 1 μl RNase 억제제 및 1 μl 10 mM dNTP 혼합물을 1 μg의 RNA에 추가하고 nuclease-free water로 부피를 14 μl로 조정합니다. 65 ° C에서 5 분 동안 배양 한 후 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 1 μl 0.1M DTT, 1 μl 역전사 효소 및 4 μl의 5x RT 완충액을 추가합니다. 반응을 50°C에서 55분 동안 배양한 후 70°C에서 10분 동안 불활성화 단계를 수행합니다. 역전사 후 시료는 -20°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>마그네틱 비드에 결합된 mRNA의 경우, Tris-HCl buffer를 첫 번째 반응 혼합물(1 μl RNase inhibitor, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 12 μl nuclease-free water)으로 교체하고 65 °C에서 5분 동안 배양합니다. 비드의 Oligo(dT)25 돌출부로 인해 샘플에 Oligo(dT)20 프라이머 또는 무작위 헥사머를 추가할 필요가 없습니다. 그런 다음 위의 프로토콜을 따릅니다(4.5.1단계).</li>
		<li>분광 광도계로 cDNA 농도를 측정합니다. 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 실시간 PCR
<ol>
	<li>Real-time PCR을 사용한 분석의 경우 Micro Kit와 SYBR Green QPCR Master Mix로 추출한 총 RNA를 사용합니다. 동일한 양의 전사체를 보장하려면 역전사 후 각 샘플의 cDNA 농도를 동일한 값으로 조정하십시오.</li>
	<li>샘플 외에도 대조 반응을 삽입합니다. 비템플릿 대조군을 사용하여 시약의 오염 여부를 스크리닝하고 프라이머의 품질을 확인할 수 있습니다. 게놈 DNA의 부재를 확인하려면 non-RT control을 실행합니다. 두 반응 모두 Real-time PCR에서 음성(형광 신호 없음)이어야 합니다.</li>
	<li>서로 다른 샘플 간의 동일한 전사체 수준을 보장하려면 하나 이상의 참조 유전자를 사용하십시오. 여기에서는 액틴(정방향: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', 역방향: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') 및 18SrRNA(정방향: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTGGTG-3', 역방향: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3')를 인코딩하는 설계된 프라이머 쌍을 사용했습니다. 표적 유전자로 TLP(정방향: 5'-GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', 역방향: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3')를 선택했습니다. 증폭된 각 단편의 크기는 약 100bp였습니다.</li>
	<li>25 μl 반응의 경우 12.5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA(≥20 ng), 각 프라이머 400 nM 및 수동 참조 염료 ROX(키트와 함께 제공) 30 nM를 추가합니다. nuclease-free water를 사용하여 샘플 부피를 25μl로 조정합니다.</li>
	<li>반응은 뒤에 오는 프로그램을 가진 QPCR thermocycler에서 실행되었다: 폴리메라이제를 활성화하기 위하여 10 분 동안 95 °C에 처음 변성; 변성 (30 SEC 동안 95 °C), 어닐링 (60 SEC 동안 61 °C), 및 연장 (1 분 동안 72 °C)의 40 주기; 해리 곡선 (60 SEC 동안 95 °C, 55°C에서 30초, 95°C에서 30초). 해리 곡선은 프라이머 이량체의 부재를 결정하는 데 필요하며, 이는 추가 피크에 의해 검출될 수 있습니다.</li>
	<li>Liu와 Saint8의 방법을 사용하여 각 PCR 반응의 효율(E)을 결정합니다. 효율은 증폭 곡선의 선형 부분에서 편향될 수 있습니다. 여기서 한 사이클 포인트(CPA)의 상대 앰플리콘 수(Rn, A)는 다른 사이클(CPB)의 앰플리콘 양(Rn, B)과 연결됩니다.</li>
	<li>Relative Expression Software Tool(REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 Real-time PCR 결과를 분석</a>합니다. 이 프로그램을 사용하여 대조군과 비교하여 처리된 샘플에서 유전자의 발현 비율을 계산할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

오랫동안 식물 분비 구조, 특히 트리코메에 대한 연구는 본질적으로 해부학에 대해 수행되었으며 순전히 설명적이었습니다. 9-11의 리뷰에 요약된 바와 같이 이러한 유형의 출판물이 많이 있습니다. 식물 분비 구조에 대한 우리의 생화학적 및 분자적 지식은 예를 들어 민트 선 트리코메에 대한 몇 가지 초기 주목할만한 연구에도 불구하고 여전히 제한되어 있으며, 이는 선 트리코메가 피하 공간으로 분비되는 모노테르페노이드의 생합성 부위임을 보여줍니다12. 따라서 독립적으로 연구하기 위해서는 도구를 만들고 그러한 특수 기관을 분리하는 기술을 개발해야 합니다. 이러한 땀샘에 직접 접근하면 식물의 분비 시스템에서 생리학적 및 분자 과정을 직접 조사하고 이해할 수 있는 가능성이 제공됩니다. 분비 된 화합물의 생합성과 수송에 중요한 역할을 하는 유전자의 기능과 고도로 전문화된 기관의 발달이 어떻게 조절되는지에 대한 질문도 다룰 수 있습니다.
많은...

식물은 저분자 화합물부터 폴리머에 이르기까지 산업 및 제약 분야에서 다양하게 응용되는 매우 광범위한 화합물을 생성합니다. 이러한 화합물은 흔히 고도로 전문화된 구조에 의해 생성 및 분비되는데, 이들 중 상당수는 선모(glandular trichomes)나 밀선(nectaries)과 같이 식물 표면에 위치하거나, 특수세포(idioblasts) 또는 라텍스 및 수지관(latex and resin ducts)과 같이 내부에 위치합니다. 하지만 이러한 전문 분비 구조의 생물학적 특성에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 적으며, 다만 모든 유형의 선 조직이 활발한 대사를 나타내는 많은 특징을 보인다는 점이 알려져 있습니다. 특히 Nepenthes와 같은 식충 식물의 선 조직은 식물 세포 생물학의 모델 시스템으로 활용될 수 있습니다1.
식충 식물은 찰스 다윈(Charles Darwin)의 '식충 식물(Insectivorous Plants)'이 출판된 1875년 이후 여러 연구의 대상이 되어 왔습니다.2하지만 최근 몇 년 사이에야 분자 수준의 연구가 수행되었으며, 여전히 우리의 지식은 제한적입니다. 예를 들어, 다음과 같은 속의 식충식물 내 소화액의 단백질 조성은 네펜데스 여전히 완전히 밝혀지지 않았습니다. 최근에야 비로소 여러 종류의 가수분해 단백질과 그에 대응하는 일부 유전자들이 확인되었습니다.3의 함정 트랩에서 네펜데스 (그림 1), 다세포샘은 포충낭의 내부 바닥에 위치합니다. 이 샘들은 소화 효소를 생성하여 포충낭 액으로 분비하는 역할과 포충낭 액으로부터 용해된 영양분을 흡수하는 역할을 모두 수행합니다.4따라서 이러한 이중 기능 샘은 식충성에서 중심적인 위치와 기능을 담당하는 독특한 미세 조직을 나타냅니다. 네펜데스 이는 상세히 연구할 가치가 있습니다.
<img alt="식충식물 해부도, 네펜데스 포충낭 상세, 식물학 연구, 포획 메커니즘, 적응." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. Nepenthes alata 포충낭. 포충낭의 하단부에는 소화액과 내부 선들이 포함되어 있습니다.
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식물 과학에서 많은 실험적 접근 방식은 특정 조직이 아닌 기관 전체를 조사하기 때문에 '벌크 재료(bulk material)'에 의존합니다. 결과적으로, 이러한 재료의 균질화 및 분석은 개별 조직 및 세포에 비해 희석되고 비례적인 결과만을 제공할 수 있습니다5. 이 문제를 해결하기 위해 소위 레이저 캡처 미세절제술(LCM)과 같은 미세 준비 기술이 개발되었으며, 특정 식물 조직을 수집하고 그 개별 함량을 분석하는 데 성공적으로 사용되었습니다6. 그러나 LCM은 RNA와 같이 불안정하거나 빠르게 분해되는 세포 성분을 대상으로 할 때 제한적인 경우가 많습니다. 이러한 경우, 시간이 많이 소요되고 종종 생체 분자의 분해를 동반하는 사전 조직 고정 과정이 필요하다는 점이 단점이 됩니다. 또한, 많은 식물 조직의 높은 수분 함량과 세포벽의 강도로 인해, LCM은 신선한 조직에서 직접 준비하는 데 실패하는 경우가 많았습니다7. 유전자, mRNA, 단백질부터 이차 화합물 및 그 생합성에 이르기까지 분비선에 존재하는 세포 성분을 조사하기 위한 모든 접근 방식에는 해당 준비를 위한 대체 기술이 필요합니다. 따라서 준비 후에도 온전하게 유지되는 단일 세포 또는 다세포 선을 분리하기 위한 특정 기술이 필요합니다.
여기 직접적인 현미경 시각화 기능을 갖춘 기계식 마이크로샘플링 플랫폼을 이용한 방법이 제시되어 있습니다. 이 기술은 다음과 같은 식충식물 포충낭으로부터 개별 샘플 선(gland)을 준비하는 데 있어 신속하고 효율적입니다. 네펜데스 종. 이러한 다세포 샘은 두 가지 기능을 수행하며, 즉 이들은 흡수 과정뿐만 아니라 분비 과정에도 관여하며, 고정된 상태로 존재하고, 외부로 노출되지 않은 세포층은 함침되어 내피를 형성합니다. 주변 조직 없이 선 전체를 분리하여 PCR 튜브에 정교한 방식으로 넣을 수 있습니다. 이 기술은 선 조직 내의 유전자 발현뿐만 아니라 특정 유전자를 연구하는 데 적용됩니다.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>AM1931</td><td>총 RNA 분리, 50개 시료</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA 합성 시스템</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>18080-200</td><td>25 반응</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>10777-019</td><td>Rnase 억제제, 5,000 단위</td></tr><tr><td>무작위 헥사머(0.4 &mu; 지/&무; l)</td><td>QIAGEN GmbH, 독일</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, 분자 생물학 등급</td><td>Fermentas GmbH, 독일</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합 효소, (재조합)</td> <td>Fermentas GmbH, 독일</td><td>EP0402</td><td>10x Taq 버퍼 (KCl 또는 (NH4) 2SO 4) 및 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, 독일</td><td>AM2238</td><td>1,000 units</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA ladder, ready-to-use</td><td>Fermentas GmbH,</td><td>Germany SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR 마스터 믹스</td><td>Agilent Technologies, Inc., 미국</td><td>600828</td><td>단일 키트</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germany</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue 분광 광도계</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Germany</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Real-Time PCR System</td><td>Stratagene, 미국</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis Chamber</td><td>Biometra</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka</td><td>마이크로펜치</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>장착 Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar Filter set 01</td><td>Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany</td><td>485001-0000-000</td><td>UV 필터</td></tr><tr><td>Lumar Filter set 09</td><td>Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Germany</td><td>485009-0000-000</td><td>non-UV filter</td></tr></tbody></table>

식충 식물의 조직에서 생존 가능한 다세포 땀샘의 분리, nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

많은 식물은 특정 저분자량 화합물 및 단백질의 생산 및 분비에 관여하는 특수 구조를 가지고 있습니다. 이러한 구조는 거의 항상 식물 표면에 국한되어 있습니다. 그 중에는 꿀 또는 선상 상체가 있습니다. 분비된 화합물은 예를 들어 수분 매개자에 대한 유인제 또는 초식 동물에 대한 억제제와 같이 생물 환경과의 상호 작용에 자주 사용됩니다.
여러 측면에서 독특한 땀샘은 식충 식물에서 찾을 수 있습니다. Nepenthes 속의 소위 투수 식물에서 함정 트랩 내부의 이중 기능 땀샘은 한편으로는 먹이 소화에 필요한 모든 효소를 포함하여 소화액을 분비하고 다른 한편으로는 방출 된 영양소를 흡수합니다. 따라서 이 땀샘은 식물의 단백질 분비와 영양소 흡수의 근본적인 분자적, 생화학적, 생리학적 메커니즘을 연구하기 위해 예정된 이상적이고 전문화된 조직을 나타냅니다. 더욱이, 일반적으로 선상 구조를 갖춘 많은 식물에서 생산되는 2차 화합물의 생합성은 분비샘에서 직접 조사할 수 있습니다.
이러한 특수 구조에서 작동하려면 효율적이고 빠르며 대사적으로 활성화되고 다른 조직과의 오염 없이 격리되어야 합니다. 따라서 Nepenthes 소화액에 대한 연구를 위해 기계적 미세화 기법이 개발되어 적용되었습니다. 여기에서는 기계화된 마이크로샘플링 플랫폼을 기반으로 Nepenthes 트랩에서 단일 이중 기능 땀샘을 성공적으로 준비하는 데 사용된 프로토콜이 제시됩니다. 땀샘은 RNA를 준비한 후 PCR 기술에 의한 유전자 발현 분석을 위해 분리되어 직접 더 사용할 수 있습니다.

Nepenthes 포충낭 조직에서 단일 선(gland)을 준비하기 위해 기계식 미세 절제 기술이 개발 및 적용되었습니다. 미세 준비 플랫폼에는 마이크로 조작기에 부착된 미세 핀셋이 장착되어야 하며, 이는 컨트롤 패널로 작동됩니다. 현미경 하에 보이는 개별 선들을 핀셋으로 겨냥하여 선 조직을 잡고 기계적으로 제거할 수 있었습니다(그림 4A).
이후 분석을 위해 선 조직을 PCR 튜브로 직접 옮겼습니다(그림 4B). 선 조직 아래의 식물 관다발계가 드러났으므로 선 제거가 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었습니다(그림 4A).
제조 방법의 품질과 효율성을 추가로 입증하고 본 방법의 유용성을 확인하기 위해 PCR 분석을 수행하였습니다. 후보 유전자로 Nepenthes gracilis의 thaumatin-like ...

식물 땀샘은 생물 환경과의 상호 작용에 관여하는 많은 화합물의 생합성 및 분비를 담당하는 특수 구조입니다. 분자 및 생화학적 특징에 대한 연구를 가능하게 하기 위해 식충 식물인 Nepenthes에서 단일 대사 활성 분비샘을 분리하기 위해 기계적 미세준비 기술이 확립되었습니다.

식충 식물의 조직에서 생존 가능한 다세포 땀샘의 분리, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

본 방법의 목적은 분자 분석을 위해 신선한 식물 조직으로부터 단일하고 순수한 선(gland)을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 네펜데스(nepenthe) 식물에서 포충낭을 채취합니다. 그 다음, 조직의 신선도를 유지하기 위해 얼음 위에서 마이크로 샘플링 플랫폼에 조직을 직접 고정합니다.마이크로 샘플링 과정 동안, 샘플을 정밀하게 분리하여 PCR 튜브로 옮긴 후 수집된 물질에 대해 정량 PCR 분석을 수행합니다. 최종적으로, 기계적 마이크로 샘플링 기술을 사용하여 식충 식물로부터 단일하고 순수한 샘플을 얻음으로써, 향후 분자 분석을 위한 특정 조직을 신속하고 미세 침습적으로 제공합니다. 식충 식물은 동물성 단백질을 소화할 수 있는 능력을 갖춘 식물군 내의 전문종입니다.분자 수준에서 이것이 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 지식은 여전히 제한적입니다. 이 문제를 다루기에 적합한 모델은 천재 충수의 이미지 혼합인데, 왜냐하면 여기에는 소화 과정에 기여하는 선(gland)을 생성하는 뚜렷한 장기 이미지들이 포함되어 있기 때문입니다. 충수 내에서.이러한 샘들은 하단 사진의 내부에 위치하고 있습니다. 분자 분석을 위해서는 지름이 약 100 to 200 micrometers인 이 넓고 평평한 구조물을 신선한 조직에서 직접 분리해야 합니다. 또한, 이 샘들이 보호 후드로 덮여 있어 분리 과정이 더 까다롭습니다.샘플링 과정에서 3차원 관찰이 필요하고 정밀하게 3차원으로 이동할 수 있는 도구가 요구되는 카포트(carport)와 유사한 구조를 가지고 있었기 때문에, 기존의 미세 절단 기술로는 우리의 문제를 해결할 수 없음을 알게 되었습니다. 예를 들어, 레이저의 경우 식물 조직의 높은 수분 함량으로 인해 실패했습니다.따라서 우리는 3D 구조의 조직 일부나 단일 세포를 분리하기 위해 aika라고 불리는 새로운 기계적 미세 절제 기술을 사용하고 도입하기로 결정했습니다. 이 기술은 3D 마이크로 매니퓰레이터가 통합된 실체 현미경 또는 공초점 현미경으로 구성되어 있어, 매우 낮거나 높은 시료에 쉽게 접근할 수 있습니다. 이는 현미경과 함께 하나의 기둥처럼 이동하며, 식물 시료의 경우 주로 마이크로 모세관을 사용합니다.하지만 충수돌기 유리(appendix glass)의 경우, PTO 구동 마이크로 포셉이 본 실험 절차에 더 효과적이라는 것을 확인했습니다. 충수돌기 실험을 위해 플랫폼을 수정하였습니다. 소형 VXY 스테이지가 얼음으로 채워진

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감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.

성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립

우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.

침또는 단층으로 시험관 내 성장을 위한 인간 타액 선에서 타액 상피 세포의 격리

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Cannabis sativa의 선, capitate, 스토킹 및 고착성 trichomes의 편리하고 높은 처리량의 분리 및 농축을위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 액체 질소, 드라이 아이스 및 나일론 체만을 사용하는 트리초메의 건식, 비완충액 추출을 기반으로 하며 RNA 추출 및 전사체 분석에 적합합니다.

대마초 sativa에서 Glandular Capitate 스토킹 및 고착 Trichomes의 비 수성 분리 및 농축

학습하세요 Nepenthes 식충 식물의 생존 가능한 다세포 땀샘을 기계적 미세 분리 기법으로 분리하는 방법을. 이 기술은 분자 분석 및 생화학 연구에 활용됩니다.

식충 식물의 조직에서 생존 가능한 다세포 땀샘의 분리, Nepenthes

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