압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

본 절차의 전체적인 목표는 약물 또는 질환 상태가 소저항 장간막 동맥의 압력 유도 혈관 긴장도에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스 모델로부터 장간막 아케이드(mesenteric arcade)를 분리합니다. 두 번째 단계는 4차 소저항 동맥을 박리하는 것입니다.

다음 단계는 동맥 표본의 캐뉼레이션, 가압 및 배양입니다. PSS에서 마지막 단계는 동맥 표본의 생리적 무결성을 평가하는 것이며, 이는 혈관 긴장도의 자발적 발달과 혈관 수축제 및 혈관 확장제에 대한 적절하고 가역적인 반응을 통해 입증됩니다. 최종적으로 압력 유도 수축을 측정할 수 있습니다.

이 기술의 함의는 고혈압, 저혈압 또는 혈관 기능 장애의 치료나 진단으로 확장됩니다. 본 기술은 혈관 저항, 관류 및 혈압의 핵심 결정 요인인 혈관 긴장도의 압력 유도 변화에 기저가 되는 핵심 메커니즘을 규명하기 때문입니다. 본 절차는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Jja가 시연하겠습니다.

글라스 캐뉼라를 마이크로 피펫 홀더에 장착하고, 마이크로 피펫 홀더를 관류 챔버에 부착하여 관류 챔버를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. Milli Q수로 헹군 후, 해부 용액으로 각각 5분 동안 헹굽니다. 그런 다음 챔버에 해부 용액 2 mL를 채웁니다.

다음으로, 기포가 생기지 않도록 캐뉼라 전체와 연결된 튜빙을 조심스럽게 채웁니다. 해부 현미경 하에서 둔탁한 핀셋을 사용하여 반 매듭이 지어진 봉합사 두 개를 준비합니다. 해부용 핀셋을 사용하여 두 캐뉼라의 끝부분에서 약간 떨어진 곳에 부분적으로 묶인 봉합사 매듭을 장착합니다.

다음으로, 마취된 쥐의 골반에서 흉골까지 피부를 절개한 후 하부 근육층을 차례로 절개하여 정중선 개복술을 수행합니다. 이때 복강 내 장기가 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 세포 외 배양액의 오염을 방지하기 위해 소화물과 분변이 새어 나오지 않도록 양 끝단을 각각 묶어줍니다.

그 후, 공(pori)에 가까운 소장의 근위단과 회맹접합부에 가까운 원위단을 절단합니다. 그런 다음, 영양 혈관 근처의 장간막 기저부를 절개합니다. 이어서 소장 장간막 전체를 얼음처럼 차가운 해부 용액이 담긴 50 milliliter 비커로 옮겨 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 신선한 해부액으로 헹구어 혈액을 제거합니다. 이제 장의 근위단 끝부분을 장판이 깔린 접시의 우측에 고정하고, 나머지 장을 반시계 방향으로 펼칩니다. 실체 현미경 하에서 장간막을 펼치고 혈관이 드러나도록 해당 분절을 고정합니다.

2차 분지 근처의 모든 피복 지방을 먼저 제거한 후, 소장과 평행한 3차 및 4차 소장간막동맥을 박리합니다. 그 다음 정맥을 박리하여 V자형 분지점이 있는 동맥을 분리합니다. 선택한 분절을 찌르지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 소장과 평행한 동맥 부위를 4~5 mm 길이로 분리합니다. 소장으로 들어가는 모든 5차 분지들을 분지 기점에서 약간 떨어진 지점에서 절단하여 일부를 남겨둡니다. 이 부분들은 동맥 분절을 관류 챔버로 옮길 때 고정 지점으로 사용되며, 이후 캐뉼라 삽입을 안내하는 역할을 하게 됩니다.

그런 다음 동맥의 양측 5차 분지 원위부에서 두 번 절개하여 동맥 분절을 절단하고 이를 관류 챔버로 옮깁니다. 해부용 핀셋으로 동맥 분절의 끝부분을 잡고 유리 마이크로 피펫으로 혈관의 한쪽 끝을 캐뉼라 삽입합니다. 이전에 준비해 둔 부분적으로 묶인 봉합사를 캐뉼라가 삽입된 끝부분으로 밀어 넣어 고정합니다.

그 다음, 해부 용액이 채워진 10 milliliter 주사기를 이 캐뉼라에 연결된 스톱콕(stop cock)에 부착합니다. 주사기를 천천히 들어 올립니다. 용액에 작용하는 중력으로 인해 혈관의 열린 끝단에서 혈관 내 혈액이 제거됩니다.

동맥 내 혈액을 제거한 후, 스톱콕을 잠급니다. 이제 동맥 분절의 묶이지 않은 끝단에 다른 유리 캐뉼라를 최대한 가깝게 조심스럽게 가져가 혈관의 원위단을 두 번째 유리 캐뉼라에 묶습니다. 미리 준비하여 부분적으로 묶어둔 봉합사를 캐뉼라가 삽입된 끝단으로 밀어 넣어 고정합니다.

동맥 분절을 잡아당기거나 끌지 않도록 주의하고, 양쪽 캐뉼라에 연결된 스톱콕(stopcock)이 닫혀 있는지 확인하십시오. 관류 챔버를 라이브 비디오 녹화 장치가 갖춰진 도립 현미경 스테이지로 옮깁니다. 그런 다음 동맥 분절의 근위단에 연결된 캐뉼라의 스톱콕을 서보 제어 압력 조절 장치에 연결하십시오.

관강 내 압력을 안정적으로 유지하기 위해 다른 캐뉼라에 연결된 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 다음으로, 진공 튜브를 관류 튜브에 연결하고 흡입 포트를 챔버의 관류 포트에 연결합니다. 단일 인라인 용액 가열기를 통해 분당 2 mL의 속도로 따뜻한 PSS를 사용하여 혈관 관류를 시작하십시오.

연동 펌프를 사용하여, 챔버 내 PSS의 온도가 37 °C에 가까워지면 진공 장치를 켭니다. 관강 내 압력을 20에서 100 mmHg까지 천천히 높입니다. 압력 조절기의 자동 압력 설정을 사용하여 혈관에 누출이 있는지 확인합니다.

그 후, 압력을 100 mmHg로 유지하면서 동맥 분절의 굴곡 여부를 평가합니다. 나사 레버를 사용하여 캐뉼라를 이동시켜 동맥 분절을 직선으로 펴주되, 동맥 분절이 과도하게 늘어나지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 장간막 아케이드(mesenteric arcade)의 생체 내 압력을 모사하기 위해 압력을 70 mmHg로 낮추고, 동맥 분절이 안정화되어 근원성 긴장(myogenic tone)이 형성되도록 합니다.

본 절차에서는 단색 비디오 전하 결합 소자 카메라가 장착된 현미경의 10배 대물렌즈를 사용하여 동맥을 관찰합니다. 비디오 프레임 그래버와 실시간 에지 검출 시스템을 사용하여 내강 직경을 측정합니다.

그 다음 혈관 직경을 기록하고 근성 톤(myogenic tone)의 발달 과정을 모니터링합니다. 이후 압력을 20 mmHg로 낮추고 직경이 안정될 때까지 기다립니다. 그런 다음 관강 내 압력을 20, 40, 60, 80, 100과 같이 단계적으로 높이며, 각 압력에서 동맥의 직경이 안정될 때까지 유지합니다.

다음 단계로, 기록된 파형과 같이 0.39 mM EGTA와 0.1 mM sodium nitroprusside가 포함된 칼슘 없는 PSS에서 압력 단계 반응을 반복합니다. 70 mmHg로 가압했을 때 쥐의 소장 장간막 동맥 직경은 자발적으로 감소하며, 1 µM acetylcholine을 첨가하면 직경이 초기 직경에 가깝게 증가합니다. 조직 배양액에 1 µM phenylephrine을 첨가하면 동맥 직경이 감소하며, 이 그림은 소장 장간막 동맥을 칼슘 없는 PSS에서 배양했을 때 동맥 직경이 증가함을 보여줍니다. 다양한 관류압에서의 단일 가압 동맥 세그먼트 직경이 이 표에 제시되어 있습니다.

여기서는 PSS와 칼슘이 없는 PSS가 있는 상태에서 혈관 내 압력을 점진적으로 높이는 동안 동맥 직경을 지속적으로 기록합니다. 각 압력 단계에서 도달한 동맥 직경의 곡선과 각 압력 단계에서 달성된 근원성 톤(myogenic tone)의 막대 그래프가 여기에 표시됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 소저항 동맥의 근원성 거동을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 통해 내피세포 파괴 및 동맥 투과성과 같은 추가 절차를 수행할 수 있습니다. 이 두 절차 모두 소저항 동맥의 혈관 긴장도 조절에서 내피세포와 칼슘의 역할에 관한 추가적인 질문에 답을 제공할 수 있습니다.