침전 형성 폴리에틸렌 글리콜 마이크로겔의 특성은 반응물의 분자량에 의해 제어됩니다

이 실험 절차의 전반적인 목적은 광중합 침전 반응을 이용하여 약물 전달체 및 조직 공학 지지체로 사용할 폴리에틸렌 글리콜 마이크로 겔을 형성하는 것입니다. 이는 먼저 광개시제, 완충액, 트리에틸아민 및 PEG DL 용액을 포함한 시약들을 준비하고 이를 37 °C로 가온함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 시약들을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 37 °C의 온도를 유지하면서 볼텍싱하는 것입니다.

다음으로 황산나트륨을 혼합하고, 용액을 UV 광원 아래에 두어 30초 동안 가교 결합시킵니다. 가교 결합 후, 용액 상단에 마이크로 겔이 포함된 혼탁한 층이 형성됩니다. 마지막 단계로 혼합물에 PBS를 첨가하고 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.

최종적으로, 현미경 관찰과 동적 광산란법(dynamic light scattering)을 통해 마이크로 겔의 크기를 측정하며, 덱스트린 밀도 구배를 이용하여 밀도를 측정합니다. 또한, 마이크로 겔의 습윤 중량과 건조 중량을 측정하여 팽윤도를 계산합니다. 에멀젼, 현탁 및 분산 기술과 같은 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 침전 반응으로 형성된 마이크로 겔이 유기 용매나 안정제 없이도 낮은 다분산 지수(poly dispersity index)를 갖는다는 점입니다. 또한, 침전 반응의 온화한 조건, 마이크로 겔의 맞춤형 특성 및 주입에 적합한 낮은 점도 덕분에 NVivo 응용 분야에 적합합니다.

이 방법은 균일한 크기와 낮은 다분산 지수(poly dispersity index)를 모두 갖춘 스캐폴드 제작과 같이 조직 공학 및 재생 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 약물 내의 성장 인자를 쉽게 캡슐화할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 약물 전달 치료까지 확장될 수 있습니다. 우선, 광개시제 500 milligrams를 정밀하게 측정하여 탈이온수 100 milliliters에 첨가해 0.5% 용액을 만듭니다.

용액을 UV 광선으로부터 보호하고, 광개시제가 완전히 용해될 때까지 약 1시간 동안 지속적으로 저어주며 40°C로 가열합니다. 용액이 완전히 용해되면, 0.22 µm 필터로 여과하여 멸균한 후 필요한 때까지 4°C의 암소에 보관합니다. 다음으로, 점도를 낮추기 위해 Triethylamine을 37°C로 예열합니다.

그 다음, 해당 용액 612 µL와 6 M 염산을 260 µL 함께 PBS 39.4 mL에 첨가하고, 멸균 상태에서 pH를 7.8로 조정합니다. 최종 용액을 0.22 µm 필터로 여과하고, 필요할 때까지 37 °C에서 보관합니다. Sony et al.의 연구에 따라, 기발표된 방법에 따라 PEG 전구체를 제조하고 완성된 제품을 아르곤 가스 하에 -20 °C에서 보관합니다. 그 후 사용 직전에, triethanolamine과 염산이 첨가된 PBS 0.8 mL를 PEG diacrylate 200 mg에 천천히 첨가하여 200 mg/mL PEG diacrylate 용액 1 mL를 준비합니다.

또한, 실험 직전에 황산나트륨 213 mg을 정밀하게 측정하여 탈이온수 1 mL에 녹입니다. 1.5 M 용액을 조제하기 위해, 용액을 37 °C에서 20분 동안 가열한 후 완전히 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 용해가 완료되면, 최종 황산나트륨 용액과 PEG di Acrylate 용액 모두를 37 °C에서 0.22 µm 필터로 여과합니다.

PBS와 triethylamine 및 hydrochloric acid 혼합물 127.5 µL, 0.5% 광개시제 10 µL, 그리고 200 mg/mL PEG diacrylate 용액 25 µL를 1.6 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 혼합합니다. 그 후, 캡슐화하려는 원하는 분자들을 추가합니다.

이 튜브들을 1.5 molar 황산나트륨 용액과 함께 37 °C로 가열합니다. 그런 다음, 예열된 1.5 molar 황산나트륨 용액 87.5 µL를 PEG 용액이 들어있는 첫 번째 튜브에 넣고, 파이펫팅을 3~5회 반복하여 혼합합니다. 혼합 후에는 염 농도가 균일하게 분포되며 용액이 투명해져야 합니다.

튜브를 UV 램프 아래에 두고 30초 동안 가교 결합을 유도합니다. 가교 결합 후에는 마이크로겔이 포함된 용액 상단에 뿌연 층이 형성되어야 합니다. 그다음, 튜브에 750 µL의 PBS를 첨가하고 볼텍싱하여 용액을 잘 섞어줍니다.

그런 다음 혼합물을 4,000 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 펠릿이 형성되면 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하고 신선한 PBS에 마이크로겔을 부유시킵니다. 마이크로겔을 신선한 PBS로 총 5회 세척하며, 매 세척 단계 사이에 원심분리를 통해 펠릿을 형성합니다.

마지막 세척 후 상층액을 제거하고, 펠렛에서 30 µL의 마이크로 젤을 취해 1 mL의 탈이온수에 넣습니다. 그다음 마이크로 젤 용액을 수조 초음파 세척기에서 50~60 Hz, 1.4 A의 전력으로 1시간 동안 초음파 처리합니다. 이어서 마이크로 젤 용액 15 µL를 깨끗한 산 식각 유리 슬라이드 위에 분주하고, 그 위에 1.5번 산 식각 커버 슬립을 덮습니다.

슬라이드를 실험실 티슈 위에 뒤집어 놓고 슬라이드를 부드럽게 눌러 과잉 용액을 제거하고 마이크로 겔이 단일 층으로 형성되었는지 확인합니다. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 DIC 100x 오일 대물렌즈로 마이크로 겔의 이미지 여러 장을 캡처합니다. 마이크로 겔의 크기를 측정하여 대표 직경을 구합니다.

N을 마이크로겔의 총 개수, VI를 마이크로겔의 부피로 하는 여기에 표시된 부피 기반 방정식을 사용하여 다분산 지수를 계산하십시오. 평균 마이크로겔 밀도를 측정하기 위해 먼저 탈이온수에서 7, 6, 5, 4, 3 및 1%의 덱스트린 용액을 준비하십시오. 덱스트린 용액의 밀도는 여기에 표시되어 있습니다. 그다음, 15 mL 원심분리관에 7% 덱스트린 용액 2 mL를 넣으십시오.

그 다음 6% dextrin 용액 2 mL를 천천히 피펫팅하여 7% dextrin 위에 뚜렷한 층을 형성합니다. 5분 후, 다음 층인 5% dextrin 2 mL를 추가하고, dextrin 농도가 낮아지는 순서대로 각 농도의 dextrin이 층을 이룰 때까지 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 마이크로 겔을 1% dextrin 용액 위에 조심스럽게 층을 만들어 올리고, 밀도 구배를 5 °C에서 4,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.

그 다음 마이크로 젤의 위치를 시각화하고 층 사이의 위치에 따른 마이크로 젤의 밀도를 계산합니다. 마이크로 젤의 팽윤 질량을 측정하려면, 먼저 마이크로 원심분리 튜브의 무게를 미리 측정한 후 마이크로 젤 1 mL를 첨가합니다. 각 세척 단계 사이에 탈이온수로 마이크로 젤을 5회 세척합니다.

마지막 세척 후 마이크로 겔을 침전시키기 위해 샘플을 4,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 이를 탈이온수에 재현탁하고 최소 48시간 동안 팽창시킵니다. 48시간 후, 팽창된 마이크로 겔을 4,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리한 다음 모든 상층액을 제거합니다.

그런 다음 샘플의 무게를 측정하여 습윤 질량을 기록합니다. 정확한 습윤 무게를 얻은 후, 마이크로 젤을 -80 °C에서 냉동시킨 다음 동결 건조하여 수분을 제거하고 건조 질량을 얻습니다. 모든 수분이 승화되면, MS를 마이크로 젤의 습윤 무게, MD를 건조 무게로 하는 여기에 표시된 식을 사용하여 마이크로 젤의 수분 및 폴리머 함량을 계산합니다.

다양한 분자량의 20% PEG를 사용하여 형성된 PEG 마이크로 겔의 평균 직경이 여기에 표시되어 있습니다. UV 노출 시간을 늘리는 것 또한 마이크로 겔의 직경에 영향을 미쳤습니다. UV 노출 시간이 증가함에 따라, 여기에 표시된 세 가지 제형의 직경도 함께 증가하였습니다.

덱스트린 구배로 측정한 밀도는 전구체 peg 분자의 분자량이 증가함에 따라 감소했습니다. 이는 수분 함량 백분율 그래프에서도 확인되며, 분자량이 더 높은 peg일수록 폴리머 g당 수분 함량이 더 높은 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 마이크로 겔에 형광 결합 단백질을 탑재할 수 있음을 보여주기 위해 중합 전 혼합물에 알부민을 첨가하였으며, 이는 구체 내부에 포집되었습니다.

형광 표지 단백질의 농도가 높아질수록 구체의 다분산 지수(poly dispersity index)는 증가했으나, 평균 크기는 일정하게 유지되었습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 용액을 37 °C로 가열해야 하며, 슬라이드를 세척하고 이미징을 위해 준비하는 동안 응집물을 제거하기 위해 마이크로 겔을 충분히 볼텍싱(vortex)해야 한다는 점에 유의하십시오. 이 절차 이후에, 약물 방출 효과에 관한 추가적인 의문에 답하기 위해 약물 캡슐화를 위한 추가 방법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 침전 반응을 통해 온화한 조건에서 peg DA 마이크로 겔을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.