Name: 쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 학습하세요 쥐과 신생아 두피 소교 세포 분리 방법으로 면역 기능을 보존하는 기술을. 혼합 신경교 세포 배양 후 분리하여 생물학적 실험에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIEHS R01ES014470 (KMZ)에 의해 지원되었다.

이전에이 프로토콜을 시작으로, 출생 후의 일에 신생아 쥐를 수집 1-3 보호와 따뜻함 원래 케이지 침구 중첩 된 멸균 용기에 (P1-3). 그것은 소교 수율을 최적화하기 위해 이러한 프로토콜을 통해 신속하고 효율적으로 작동하는 것이 중요하다. 전체 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오. 1. 악기, 문화, 미디어 및 식기 준비 <ol><li> 10 ㎖ / 강아지 소교 완료 미디어 (MCM을 준비, 1X 최소 필수 보충 중간 얼의 [MEM] : 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.6 % V / V의 D-(+) - 포도당, 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 4 % V / V 태아 혈청 (FBS), 6 % V / V 말 혈청), 각각의 T-75 플라스크 (1 플라스크 / 강아지)에 추가, 모자 및 장소에 가로, 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2) 1 시간 동안 평형합니다. 그것은 절개를 시작하기 전에 플라스크 (들)이 미디어 평형하는 것이 필수적입니다. </li><li> Prepa다시 나누어지는, 따뜻한 해부 (6 ㎖ / 강아지) 37 ° C의 물을 욕조의 MCM의 세포 재 부유 (2 ㎖ / 강아지)에 대한 별도의 원뿔 튜브 MCM에서. , 및 해부 미디어 (DM; MEM은 100 ㎍ / ㎖의의 P 보충 / : 얼음 닦지 미디어 (;, 100 ㎍ / ㎖의의 P / S, 0.01 M HEPES 3 ㎖ / 강아지 HBSS는 보충 MM)에 대한 준비, 나누어지는 및 오한 S 2 ㎖ / 강아지). </li><li> 10 분 동안 70 % 에탄올에 침수에 의해 다음과 같은 수술 도구를 소독 : 가위 # 1 (1, 목을 벨 수있는)을, # 1 forcep (2, 코를 확보하고 피질을 제거하기 위해), 가위 # 2 (1; nonangled, 열 두피 ,) 가위 # 3 (1 수막을 제거하기 위해,,), forcep # 2 (1,,) 두개골을 제거하는 forcep # 4 (2, # 3 (1 forcep) 두피를 제거하는 뇌 조직을 말하다). 멸균 패드에 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 수평 공기가 워크 스테이션과 해부 현미경을 닦습니다. </li><li> 머리를 캡처 2 멸균, 100mm 배양 접시에 DM을 분배 (3 ㎖, 1 / 3 새끼 요리)와 절개 (1 ㎖;해부하기 전에 얼음에 냉장) / 강아지 1 접시. 뇌 조직 (, 1 접시 / 강아지 1 ㎖)를 닦지 1 멸균, 100mm 페트리 접시에 MM을 분배. </li></ol> 2. 뇌 조직 해부 <ol><li> 이전 안락사에 부드럽게 실험실 조직을 사용하여 70 % 에탄올로 목 강아지의 머리를 소독. 가위 1 번, 빠르게 머리를 제거하여 강아지를 안락사, 캡처 헤드를 이전에 준비 페트리 접시에. 안락사와 다음 동물로 진행하기 전에 한 강아지의 절개를 완료합니다. </li><li> 냉장 해부 접시에 머리를 이동, 개방 두피를 만들어 가위 # 2를 사용하여, 해부 현미경 # 1 (또는, 머리가 눈을 소켓을 통해 집게를 관통하여 고정 할 수 있습니다) forcep을 사용하여 코를 곤란하게하여 머리를 고정 Y-컷 : 머리의 기지에서와 눈을 향해 각도로 시작합니다. 부드럽게 두개골을 노출, 횡 방향으로 박리하여 두피를 제거 # 3 forcep 사용합니다. </li><li> forcep # 3를 사용하여 부드럽게베이스에 결합 조직을 제거머리. 그립,, 두개골의 기초가 (interhemispheric 균열 다음) 뇌와 두개골 사이의 forcep의 한 팔을 나사에 의해 조심스럽게 열고 두개골을 노출되면 부드럽게 열고 눈물을 위쪽으로 머리를 당겨. </li><li> forcep 번호를 사용하여 두뇌의 복부 측면에서 결합 조직을 방해하고,이어서 같은 도구를 사용하여 뇌를 제거합니다. 두뇌의 복부 측면에서 위쪽으로 힘을 사용하여 두개골 밖으로 뇌를 들어 올립니다. </li><li> 의 해부학 적 위치에 머리를 계속 : 등쪽면은 해부 현미경 하에서 피질을 시각화를 향, 중뇌 및 피질의 교차점에 포셉의 팁을 삽입하여 장소에 두뇌를 확보, 완전히 forcep 번호 4 대뇌 피질의 수막을 제거, 다음 복부 수막을 제거하기 위해 진행합니다. 수막이 완전히 제거되면, forcep # 4를 사용하여 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리합니다. 그것은 완전히 미세 아교 세포의 순도와 yiel을 극대화하기 위해 수막 조직을 제거하는 것이 필수적입니다D. </li></ol> 3. 뇌 조직 닦지 <ol><li> 전송 피질 이전에 접시를 닦지 준비하는, 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 멸균 기술을 사용하여 단계를 닦지를 계속합니다. </li><li> 가위 # 3를 사용하여 말하다 뇌 조직, 15 ML 원뿔 튜브로 전송 다진 조직;., 가위 및 MM 각 1 ㎖로 닦지 요리를 씻어 수집하고 다진 조직을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 린스를 분배이 세정 단계는 극대화 모든 잔여 조직이 원뿔 튜브로 전송하도록함으로써 미세 아교 세포의 수율. 다진 조직이 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 동안 방해받지 조직 현탁액을 남겨주세요. MM은 필수 영양소를 포함하지 않는 2 분을 초과하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 제거하고 정착 다진 - 조직을 방해하지 않도록 확실히하는 표준 피펫 팁으로 일반 1,000 μL의 micropipettor와 상층 액 2 ㎖를 폐기합니다. </li&gt; <li> 다진 - 조직에 MCM의 3 ㎖를 추가, 표준 피펫 팁으로 일반 1,000 μL의 micropipettor를 사용하여 전체 힘으로 조직을 씹다 분쇄가 완료되면 뚜렷한 단단한 조직이 남아 있어야합니다.. 피펫 팁에서 잔류 분쇄 샘플을 수집, 같은 피펫 팁과 MCM의 또 다른 3 ML을 추가합니다. </li></ol> 4. 성장 외피 세포 <ol><li> 원심 분리기 세포 (215 XG, 5 분, RT, 스윙 버킷 로터 임상 원심 분리기를) 펠렛 다진 조직. 생물 안전 캐비닛에 펠렛 세포를 반환 제거하고 상층 액을 버린다, 부드럽게 세포 펠렛 (; MCM 2 ㎖ / 튜브) 재현 탁 이전에 제조 된 T-75 플라스크에 세포 재 부유를 추가, 플라스크 모자와에 수평으로 배치 가습, 표준 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2). 세포는 24 시간 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> 24 시간 후, 부드럽게 방해하는 손의 손바닥에 플라스크를 누릅니다조직 파편. 이전과 파편의 완전한 제거를 보장하기 위해 도청 후 세포를 확인합니다. 설정 플라스크 수직, 제거 및 미디어를 폐기, 플라스크의 바닥에 신선한 MCM을 추가 (12 ㎖를, 37 ° C), 모자, 수평, 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 오염 매일 세포를 확인하고 성장을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 시험 관내 (DIV)의 약 17~21일, 미세 아교 세포가 혼합 된 아교 세포 배양에서 수확을위한 준비가 될 것입니다. 세포가 준비되어 있는지 확인하려면, 반전 위상차 현미경으로 세포를 검사합니다. 소교 수확 준비가되면 40 % 자랄 ~에. 그들은 다른 아교 위에 단층으로 성장하고, 작고, 밝고, 구형 세포로 나타납니다. </li></ol> 5. 혼합 된 아교 문화에서 소교 세포의 분리 <ol><li> 미세 아교 세포를 분리하기 위해, 적극적으로 실험실 벤치에 플라스크를 누릅니다. 이 동요는 미세 아교 세포의 낮은 부착 특성으로 인해 다른 glial 세포에서 분리 된 미세 아교 세포를하는 데 도움이됩니다. </li><li(, 37 ° C, 200 rpm으로 5 시간). 파라 필름과 혼합 된 아교 문화를 회전과 함께&gt; 인감 T-75 플라스크 캡 온도 제어, nonhumidified 회전 통을 사용하여 세포가 5 시간 이상을 진동하지 않도록 시각적으로 검사합니다. 그 미세 아교 세포는 반전 위상차 현미경을 사용하여, 5 시간 후 플라스크의 표면을 해제했다. 소교 무료 부동 세포를, 구형, 밝다. 별아교 세포와 플라스크의 바닥에 부착 된 희소 돌기 아교 세포의 잔류 층이있을 것입니다. </li><li> 펠릿 미세 아교 세포 (215 XG,, 5 분, 버킷 로터 스윙) 상층 액을 멸균 원뿔 원심 분리 관에 미세 아교 세포를 포함하는 미디어를 수집합니다. </li><li> ~ 2;, 0.6 % V / vglucose, 1 ㎜의 L-글루타민, 100 ㎍ / ㎖의의 P / S, 5 % V / V FBS 1 mM의 피루브산 나트륨 :; 따뜻한 미세 아교 세포 성장 매체 (MGM에서 미세 아교 세포 펠렛을 재현 탁 MEM은 보충 ML / 플라스크)을 사용하여 혈구 세포 농도를 결정하고, 플레이트 (1) X 10 24 - 웰 플레이트 포맷에서 105 세포 / 웰플라스틱 (500 μL / 잘, MGM) 멸균 유리 커버 전표.이 절차를 사용하여 평균 미세 아교 세포의 수율은 7.5 × 10 5 세포 / 강아지 피질이다. </li><li> 24 시간 게시물 도금, 부동 세포 파편을 제거하기 위해 신선한 MGM (37 ° C)와 미디어 및 재 공급 세포를 모두 제거합니다.이 단계는 세포 생존하고 대기 미세 아교 세포를 유지하는 것이 중요합니다. 세포를 즉시 재 이송 후 실험에 이용 될 수있다. </li></ol> 6. 예 트리트먼트 <ol><li> 팸 3 CSK 4 (팸)의 / ㎖, 10 NG / ㎖ 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 또는 차량 제어를 겨 (10)에 세포를 노출, 배양기에서 2 ~ 24 시간 동안 배양 (37 ° C, 5 % CO 2). </li></ol> 7. 기능 예 생체를 통해 면역 이미징 및 면역 세포 화학 소교 분석 <ol><li> 의 미세 튜브 (1.5 ㎖), 원심의 처리, 수확 세포 배양 매체 후미디어를 취소, ifuge 탁상 마이크로 원심 (900 XG 2 분)를 사용. 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송, 분석 즉시, 또는 상점 -20 ° C에서 사용할 준비가 될 때까지. 상업적으로 이용 가능한 마우스 TNF-α ELISA 키트를 통해 세포 배양 상층 액의 TNF-α의 농도를 분석합니다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어 4 %로 세포를 고정 (w / v)의 파라 포름 알데히드 / 4 % (W / V) 크로스 / PBS 산도 7.4 (4 % PFA, 15 분, RT). 고정 후, 부드러운가 진탕에 떨고으로 5 분 동안 PBS로 세포를 씻어. <ol><li> 면역 / 면역 세포 화학. 고정하고 PBS는 면역 세포 화학, 공정 미세 아교 세포를 세척 한 후. 부드러운 흔들림으로 수행의 모든 단계. PBS/0.1 % 트리톤 X-100에서 세포를 투과, 한 시간 동안 PBS/10 % 정상 염소 혈청에있는 블록 세포. 또는 버퍼를 차단하는 토끼 항 이바-1 항체 (7백50분의 1) 토끼 반대로 NF-κB의 항체 (1 / 1, 250 P65 서브 유닛)으로 4 ° C에서 세포를 O / N을 품어. 시각항원이지는 : 형광 복합 염소 항 - 토끼 IgG의 차 항체 (1 시간, 1 / 1, 000)와 함께 배양 한 다음 항체 복합체. PBS/0.1 % 트리톤 X-100 (3 배 5 분)로 세척하여 언 바운드 차 항체를 제거합니다. </li><li> 4 &#39;, 6 - Diamidino -2 - 페닐 인돌 / PBS (DAPI, 0.1 ㎍ / ㎖)와 카운터 얼룩 세포. 세포의 핵을 시각화하기는 CX3CR1-GFP + /에서 파생 된 모든 미세 아교 세포 - 마우스는 GFP를 표현한다. DAPI를 시각화하는 350 nm 파장의 필터를 활용, GFP를 시각화하는 488 nm 파장 필터, 그리고 594 nm 파장 필터는 P65와 이바-1 면역 복합체를 시각화 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 마운트 커버 실장 수성 용액을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 미세 아교 세포를 시각화 미끄러진다. </li></ol>

<ol><li>Ranshoff, R. M. P. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Physiology%3A+Unique+Stimuli%2C+Specialized+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39, 151-170 (1990).</li>
<li>Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+%26%2334%3Bresident%26%2334%3B+myeloid+cells%3A+The+case+of+the+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of &#34;resident&#34; myeloid cells: The case of the microglia.</a> Glia. 61, 112-120 (2013).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).</li>
<li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews.</a> Immunology. , 11-775 (2011).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+free+radical+production+by+porcine+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Cytokine and free radical production by porcine microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).</li>
<li>Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+a+growing+family+of+immune+receptors+that+are+differentially+expressed+and+regulated+by+different+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes.</a> J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+inflammation+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets.+Inflamm.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and inflammation in the CNS.</a> Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).</li>
<li>Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-mediated+neurotoxicity%3A+uncovering+the+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).</li>
<li>Halle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta.</a> Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Duewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasomes+are+required+for+atherogenesis+and+activated+by+cholesterol+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals.</a> Nature. 464, 1357-1361 (2010).</li>
<li>Stewart, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+ligands+promote+sterile+inflammation+through+assembly+of+a+Toll-like+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4.</a> 11, 155-161 (2010).</li>
<li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+Alters+Toll-Like+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression.</a> Front. Neurosci. 5, 80 (2011).</li>
<li>Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+microglia.%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of microglia.</a> Glia. 7, 111-118 (1993).</li>
<li>Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Amyloid+stimulation+of+microglia+and+monocytes+results+in+TNF+alpha-dependent+expression+of+induciblenitric+oxide+synthase+and+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis.</a> J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).</li>
<li>Kim, Y. S., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2C+major+player+in+the+brain+inflammation%3A+their+roles+in+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).</li>
<li>Colton, C., Wilcock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+activation+states+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Assessing activation states in microglia.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).</li>
<li>Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+activates+microglia+to+enhance+the+production%2Fsecretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29+without+induction+of+deleterious+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro.</a> J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li>
<li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NFkappaB%29+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+%28JNK%29-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+%28p38MAPK%29-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+%28TNFalpha%29+induction+in+lipopolysaccharide+%28LPS%29-stimulated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li>
<li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson%27s+Disease+Protein+alpha-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmun.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).</li>
<li>Minghetti, L., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+effector+cells+in+brain+damage+and+repair%3A+focus+on+prostanoids+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide.</a> Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).</li>
<li>Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Glial cells and Parkinson's disease.</a> J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+inflammation-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration.</a> Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).</li>
<li>Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShie%2C+FS+%22Curr.+Med.+Chem%22">Curr. Med. Chem</a>. 16, 643-651 (2009).</li>
<li>Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease+and+Parkinson%27s+disease%3A+are+microglia+pathogenic+in+either+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder.</a> Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murinemicroglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigenpresentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li>
<li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Res%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptorCX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1%2C+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li>
<li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li>
<li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+microgliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3Aimmunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
</ol>

저자는 연구가 관심의 충돌 가능성으로 해석 될 수있는 모든 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 수행 된 것을 선언합니다.

본 절차는 신생아 쥐에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 분리를위한 효과적인 방법을 제공합니다. 이 절차는 형광 이미징, 면역 세포 화학 및 ELISA에 의해 결정, 1) 보존 미세 아교 세포의 면역 표현형과 기능의 두 가지 이점을 제공하고, 2) 미세 아교 세포는 이전에 다른 glial 세포 (성상 세포 및 oligodentrocytes)의 존재로 성숙 할 수 있도록 아교 문화의 성숙 기간 동안 중요한 세포 - 세포 상호 작용을 용이하게 할 수있다 격리. 중요한 것은, 고립 된 세포가 유지 기능과 면역 표현형 생체 높은 생존 능력과 균일 성을 나타내었다. 높은 순도와 수율 미세 아교 세포의 성공적인 분리를 위해 특별한 관심과 근면으로 수행해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 이 단계는 다음과 같다 : 1) 전체 실험 절차를 통해 살균, 건강한 문화를 유지, 2) 고전에서 모든 수막을 제거tices 미세 절제하는 동안, 피질을 닦지 후 접시와 가위를 닦지 3) 적...

미세 아교 세포는 중추 신경계의 실질의 감시 대식 세포는 성인 포유류의 뇌의 전체 세포 인구의 약 12​​ %를 차지. 미세 아교 세포는 난황 주머니 골수 전구 세포에서 유래 및 성인 CNS 1-5에서 다른 cytoarchitectural 지역에서 세포의 밀도와 형태가 다양합니다. 건강한 성인의 뇌에서 미세 아교 세포는 미세 동적 프로세스와, 작은 분지 또는 극성 세포입니다. 그러나, 생체 영상 연구는 미세 아교 프로세스가 동적으로 &quot;를 연상시키는 방식으로 확장하고 자신의 미세 환경을 모니터링 철회 입증, 주변 대식 세포의 형태와는 달리, 미세 아교 세포는 세포 비활성 상태로 나타날 수 있습니다 건강한 두뇌에 대기, 로우 프로파일 표현형을 보여 샘플링 및 &quot;6,7를 조사. 미세 아교 세포는 스위칭, 높은 및 차동 뇌의 환경 및 병태 생리 학적 변화에 반응하는각각 음향 상태 - 일반적으로 자신의 휴식으로 간주하고 활성화 상태에 감시자에서. 정품 인증이 스위치는 병원체 - 관련 분자 패턴에 응답 수신자 같은 수용체 (TLR에), (PAMPS), 즉 세균 및 바이러스 유래 지질 단백질로 막 결합 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 결합에 의해 매개 될 수있다 , 핵산, 탄수화물 8-11. PAMPS뿐만 아니라, PRRS는 또한 세포 손상 12-16로 CNS의 항상성에 교란을 나타내는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)로 알려진 살균, 비병원성 분자,,에 대해 미세 아교 활성화를 유도하기 위해 표시되었습니다. 일단 종사, PRRS는 미세 아교 세포 형태 및 유전자 발현의 변화가 발생 폭포를 신호 세포를 시작, 특히, 활성화 된 미세 아교 세포는 아메바와 같은 표현형을 적용 세포의 핵에 P65 NF-κB의 서브 유닛 (P65)를 이동시키다, 및 상향 조절 produ의ction의과 반응성 산소 종 (ROS) 16 ~ 24과 함께 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터루킨-1 β (IL-1β)와 같은 염증성 사이토 카인의 분비. 중추 신경계의 선천성 면역 반응에 필수적인 있지만, 이러한 분비되는 분자는 따라서 파킨슨 병과 알츠하이머 병 25-29로 병에 걸린 상태에서 신경 퇴행을 유발 및 악화, 신경 세포의 산화 스트레스를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나 병적 인 상태에있는 미세 아교 세포 활성화 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 미세 아교 세포 활성화의 생체 기능의 많은 문화에 효과적으로 요약 할 수있다 따라서, 미세 아교 세포의 분리, 이러한 생물 학적 과정에 강력한 조사 도구입니다. 여러 가지 방법 CNS 조직 (30, 31)의 소화 효소 다음 퍼콜 그라데이션을 통해 격리 등의 미세 아교 세포를 분리 사용할 수 있습니다. 그러나, 소화 효소가 변경할 수 있습니다항원 발현 세포 표면 (32)을 감소하고, 본원에 기재된 방법보다 동물 당 낮은 세포 수율 결과로 세포의 면역 표현형. 이전에 퍼콜 그라데이션 수율 3-5 × 10 5 세포 30,33,34를 통해 전체 CNS에서 격리 방법을보고하면서 구체적으로, 우리는 7.5 × 10 5 세포의 강아지 피질 당 평균 미세 아교 세포의 수율을보고합니다. 본 절차는 이에 소교 면역 표현형 및 기능을 유지, 그들의 낮은 부착 특성에 기초하여 미세 아교 세포를 분리하여, 소화 효소의 사용을 우회. 회전 진탕 기, 이전의 확장에 기계적 교반을 통해, 및 C57BL / 6 쥐의 피질 - 본 연구에서는 신생아 이형 CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + /)에서 파생 된 혼합 된 아교 문화에서 미세 아교 세포의 분리를 설명 발행 방법 24,35. 우리는 미세 아교 세포의 쉬운 시각화를위한 이전의 마우스 변형을 활용,로단핵구 특이 적 프로모터 36-38 -이 마우스는 내인성 Cx3Cr1 궤적의 통제하에 GFP를 표현한다. 이 방법은 보존 면역 표현형 생체 박테리아 지질 다당류 (LPS) 또는 팸 3 CSK 4에 도전 할 때 형태 학적 변화, P65의 핵 전좌, 및 TNF-α의 분비에 의해 설명되는 것과 같이, TLR4와 TLR1 / 2 작용제와 고순도의 미세 아교 문화를 생산 였다.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td>은 <td>MilliQ 물로 20% 재고 용액을 만듭니다; 필터는 살균합니다; 4도에서 보관; C; 유통 기한: 3-6개월. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 100 mM (100x)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30239.01</td><td>4°C에서 보관. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 10,000 units/ml (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-20°C에 보관. MCM, MGM, MM, DM 제조에 사용.</td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>-20°C에 보관 MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (정의)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>필터는 살균합니다. -20 °C에서 보관하십시오. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr>L-글루타민이 없는 <td>최소 필수 매체 Earle's (MEM)</td><td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td>. 얼염이 함유되어 있습니다. MCM, MGM, DM 제작에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Gibco</td><td>16050</td><td>필터는 멸균; -20°C에서 보관. MCM 및 MGM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td>칼슘과 마그네슘이 없습니다. 4 &deg;C에 보관하십시오. MM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-031</td><td>4 &deg; C.에 저장. MM을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>코닝</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 딜락테이트(DAPI)</td><td>인비트로젠</td><td>D3571</td><td>세포핵을 염색하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>토끼 안티-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Iba1의 ICC 염색을 위해 1/750 희석에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>토끼 안티 NF&카파; B (p65)</td><td>Abcam</td><td>7970</td><td>p65의 ICC 염색을 위해 1/1,250 희석으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>ICC에서 항원:항체 복합체의 시각화를 위해 1/1,000 희석으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>10 ml 일회용 혈청 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 일회용 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 일회용 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>멸균 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>가위: 스트레이트 메쳄바움(가위 #1)</td><td>Roboz 수술</td>용 <td>RS-6010</td><td>1; 5 인치; 머리 제거에 사용됨</td></tr><tr><td>가위: Vannas (가위 #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>1; 비각도; 2.5 mm 절단 가장자리; 두피를 여는 데 사용</td></tr><tr><td>가위: Student Vannas (Scisso #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1; 곡선; 뇌 조직을 다지는 데 사용</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #7 (forcep #1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>2; 코를 고정하고 피질을 제거하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #2 (forcep #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>1; 두피 제거에 사용</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #3 (forcep #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>1; 두개골 제거에 사용</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #5a (forcep #4)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-21</td><td>1; 수막</td></tr><tr><td>Table of Specific Equipment</strong을</td> 제거하는 데 사용><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>줌 스테레오 해부 현미경&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td>SZ4060</td><td>현미경은 층류 수평 흐름 캐비닛</td></tr><tr><td>층류 수평 흐름 캐비닛</td><td>Nuaire</td><td>NU-201-330</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>3440001</td><td>Class II</td></tr><tr><td>Water-Jacketed CO2 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>97025-836</td><td>37 &deg로 설정; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Swing-out 버킷</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006441</td><td>Swing-out rotor</td></tr><tr><td>Swing-out rotor</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006445</td><td>최대 반경: 19.2 (cm)</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>With Swing-out</td></tr><tr><td>rotor AccuSpin Micro 17 microcentrifuge ( 탁상용 마이크로 원심분리기)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S98645</td><td>마이크로리터 로터 포함 (24 x 1.5/2.0 ml; 고양이 #: 75003524)&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

CNS 조직에서 미세 아교 세포의 분리 생체 미세 아교 세포 생물학을 연구하는 데 사용하는 강력한 조사 도구입니다. 본 발명의 방법은 회전 쉐이커 기계 교반에 의한 신생아 쥐의 피질에서 미세 아교 세포의 분리를위한 절차를 자세히 설명합니다. 이 미세 아교 세포의 분리 방법 수율 생체 내에서 정상 nonpathological 조건에서 대기 미세 아교 세포 나타내는 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 순도가 매우 높은 대뇌 피질의 미세 아교 세포. 형태 학적 변화, NF-κB (P65)의 P65 서브 유닛의 핵 전좌하고 각인 전 염증성 사이토 카인의 분비, 종양 괴사 인자-α (TNF-α의 유도에 의해 설명 된대로이 절차는 또한 미세 아교 세포 면역 표현형, 생화학 적 기능을 유지 ), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸) 문제시. 따라서, 본 분리 절차는 대기와 함께하는 양의 면역 표현형을 유지생체 조건에서 미세 아교 세포 생물학을 연구의 실험 방법을 제공 vated의 미세 아교 세포,.

격리하는 동안 미세 아교 세포 생체의 면역 표현형 및 기능을 유지하는 미세 아교 세포 생물학에 대한 조사의 모델로이 세포를 활용할 수있을 것이 중요합니다. (-와 C57BL / 6 CX3CR1-GFP + /) 및 LPS 또는 팸 하나와 처리 문화를 본 방법을 사용하여 미세 아교 세포의 immunofunctionality의 성공적인 보존을 설명하기 위해, 우리는 P3의 신생아에서 대뇌 피질의 미세 아교 세포를 고립. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 회전 흔들림을 통해 교반을 통해 미세 아교 세포의 분리는 정상 생체 내 조건에서 미세 아교 세포에 의한 정지 표현형을 유지합니다. 소교 순도를 평가하기 위해, CX3CR1-GFP + / - 세포 배양 식세포 항원 이바-1과 세포핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색 카운터 염색 하였다. prese를 통해 낮은 배율,...

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

이 절차의 전반적인 목표는 생후 초기 마우스에서 피질 미세아교세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 생후 초기 마우스의 피질 뇌 조직을 미세 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 혼합 교세포 배양물을 in vitro에서 17~21일 동안 배양하는 것입니다.다음으로, 이러한 혼합 글리아 배양물에서 미세아교세포를 분리합니다. 마지막 단계는 추가 실험을 위해 미세아교세포를 세포 배양 플레이트에 도말하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 검사와 ELISA를 사용하여 이 분리 프로토콜이 미세아교세포의 면역 표현형과 기능성을 유지함을 보여줍니다.미세 해부(microdissection)에 포함된 SEP는 수행하기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 속도와 정확성이 모두 필요합니다. 즉, 작업 속도가 너무 느리면 세포 회수율이 떨어지며, 뇌수막을 불완전하게 제거하면 글리아(glial) 배양액이 오염되어 글리아 성장을 방해하게 됩니다.이후 MCM이라 칭할 마이크로그리아 완전 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 강아지 한 마리당 한 개의 플라스크를 준비하고 최소 1시간 동안 배양합니다. 이 평형화 단계는 실험의 성공을 위해 필수적입니다.다음으로, 분주액을 준비하여 얼음 위에 올려 냉각시킵니다. 필요한 모든 배지의 경우, 강아지 한 마리당 6 mL의 MCM을 분주하고 해부 전에 37 °C 항온수조에서 가온합니다. 수평 기류 작업대와 해부 현미경을 70% ethanol로 닦아냅니다.다음으로 시술에 필요한 멸균된 수술 도구들을 작업 영역에 배치합니다. 머리 고정을 위한 해부용 배지가 담긴 멸균 접시 하나와 해부를 위한 또 다른 접시를 준비합니다. 뇌 조직의 세절을 위해 세절용 배지를 별도의 접시에 분주합니다.절단 및 뇌 적출 후, 갓 분리한 뇌를 해부 현미경 아래에 두고 등쪽이 위로 향하게 한 상태로 건조하게 유지하며 외형을 관찰합니다. 핀셋 끝을 중뇌와 피질의 교차점에 삽입하여 뇌를 고정합니다. 위치가 고정되면 등쪽 피질 뇌막을 완전히 제거합니다.다음으로, 미세아교세포의 순도와 수득률을 최대화하기 위해 복측 뇌수막을 제거합니다. 모든 수막 조직을 완전히 제거하는 것이 매우 중요합니다. 대뇌피질을 뇌의 나머지 부분과 분리하십시오.피질의 복측 또는 내측에 남아 있을 수 있는 잔여 피질 수막을 반드시 제거하십시오. 수막 조직을 제거한 후, 앞서 준비한 다지기 접시에 피질을 넣습니다. 2등급 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에서 가위를 사용하여 뇌 조직을 잘게 다집니다.다져진 조직을 15 mm 원심 분리관으로 옮깁니다. 수율을 최대화하기 위해 가위와 조직 분쇄 접시를 각각 1 mL의 분쇄 배지로 헹굽니다. 이 세척액을 수집하여 다져진 조직이 들어 있는 15 mL 원심 분리관에 넣습니다.조직 현탁액을 1~2분 동안 그대로 두어 잘게 다진 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그 후, 가라앉은 조직이 흐트러지지 않도록 주의하면서 상층액 2 mL를 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이전에 데워둔 MCM 3 mL를 다진 조직에 추가한 다음, 조직을 강하게 trituration 합니다.트라이어(trier) 작업이 완료되었을 때 식별 가능한 고형 조직이 남아 있지 않아야 합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 MCM 3 mL를 추가로 첨가해 팁에 남아 있는 분쇄된 샘플 잔여물을 수집하십시오. 수집이 완료되면, 분쇄된 조직을 원심분리하여 세포를 펠릿(pellet)화하십시오.완료되면 펠렛화된 세포를 생물학적 안전 작업대로 옮깁니다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 부드럽게 재현탁합니다.세포 펠릿을 2 mL의 따뜻한 MCM으로 현탁한 후, 준비된 플라스크에 세포 재현탁액을 첨가합니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 플라스크를 손바닥에 가볍게 두드려 조직 파편을 제거합니다.탭핑 전후에 세포를 확인하여 부유물이 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 다음으로, 배지를 신선한 MCM으로 교체하고 플라스크를 인큐베이터로 옮깁니다. 매일 세포를 확인하여 성장 및 오염 여부를 모니터링하십시오.약 17일에서 21일 후면 미세아교세포(microglial cells)를 수확할 수 있습니다. 세포의 준비 상태를 확인하려면 도립 위상차 현미경으로 관찰하십시오. 미세아교세포가 약 40%의 합류도(confluency)에 도달하여, 다른 세포들 위에 단층으로 성장하는 작고 밝은 구형 세포의 모습으로 나타나면 수확할 준비가 된 것입니다.미세아교세포를 분리하기 위해, 플라스크를 실험대 위에 대고 강하게 두드립니다. 이러한 교반 과정은 미세아교세포의 낮은 부착 특성 덕분에 미세아교세포를 다른 신경교세포로부터 분리하는 데 도움이 됩니다. 플라스크 캡을 파라필름으로 밀봉하고, 온도 조절이 가능한 비가습 회전 진탕기를 사용하여 혼합 신경교세포 배양물을 5시간 동안 회전시킵니다.이 시간이 지난 후, 미세아교세포(microglia)가 플라스크 표면에서 떨어져 나왔는지 육안으로 확인합니다. 도립 위상차 현미경으로 관찰했을 때 미세아교세포는 밝고 구형인 자유 부유 세포로 보입니다. 플라스크 바닥에는 성상교세포(astrocytes)와 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 잔류 층이 부착되어 있을 것입니다.다음으로, 미세아교세포가 포함된 상층액을 멸균 원추형 원심분리 튜브에 수집하고 원심분리합니다. 원심분리된 미세아교세포 펠렛을 따뜻한 미세아교세포 성장 배지에 현탁하고, 혈구계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 24시간 후에 세포를 플라스틱 또는 멸균 유리 커버슬립이 놓인 24웰 플레이트 형식으로 배양합니다.부유 세포와 잔해물을 제거하기 위해 배지를 따뜻한 새 MGM으로 교체합니다. 이 단계는 세포 생존과 휴지기 미세아교세포 유지에 매우 중요하며, 이 재급여 단계 직후에 미세아교세포의 순도를 평가하여 실험 준비가 되었는지 확인합니다. GFP를 내생적으로 발현하는 미세아교세포 유래 세포 배양물을 대식세포 항원 IBA1으로 염색하고 DAPI로 대조 염색하였습니다.세포핵을 시각화한 결과, 95% 이상의 세포에서 GFP IBA one과 dpi의 공동 국소화가 관찰되었습니다. LPS로 세포를 자극한 후, 미세아교세포는 작은 분지형 표현형에서 아메바 모양으로 뚜렷한 형태학적 변화를 보였습니다. P 65에 대한 면역화학 염색 결과, 정상 조건에서 P 65는 세포질 전체에 걸쳐 확산되어 국소화되어 있음이 확인되었습니다.반면, Pam P 65에 2시간 동안 노출시킨 후에는 면역 반응성이 세포핵으로 극적으로 이동하였으며, 이를 통해 분리된 미세아교세포(microglia)가 생화학적 면역 기능을 유지하고 있음을 확인하였습니다. 전염증성 사이토카인인 TNF alpha의 분비량은 PAM 또는 LPS 노출 후 측정되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 최상의 결과를 얻기 위해 신생 쥐의 피질 미세아교세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.멸균 기술을 유지하고, 박리된 피질 영역에서 뇌수막 조직을 완전히 제거하는 것이 중요합니다.

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

이 비디오에서는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 쥐 새끼 뇌에서 미세아교세포를 포함한 CD11b 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 뇌 조직을 균질화하여 단세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액은 항-CD11b 항체로 코팅된 마이크로비드로 배양된 후 자기 컬럼 기반 분리를 통해 CD11b+ 세포 집단을 정제합니다.

쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

이 비디오는 성인 쥐의 뇌 피질에서 미세아교세포를 분리하는 기술을 보여줍니다. 첫째, 피질은 뉴런과 다른 신경교세포를 제거하기 위해 세분화와 균질화를 거쳐 미세아교세포를 보존합니다. 그 후, 세포 현탁액은 항 미엘린 자기 마이크로비드와 자기장에 노출되어 미엘린 파편과 미엘린을 포함하는 세포에서 미세아교세포와 골수성 세포를 효과적으로 분리합니다.

성인 마우스 뇌의 피질에서 미세아교세포의 분리

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

이 연구는 단일 셀 문화를 생산하기 위해 마우스 구강의 잇몸 조직을 분리하고 처리 할 수​​있는 효율적인 방법을 설명합니다. 그 결과 세포는 더욱 유동 세포 계측법 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다.

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

학습하세요 쥐과 신생아 두피 소교 세포 분리 방법으로 면역 기능을 보존하는 기술을. 혼합 신경교 세포 배양 후 분리하여 생물학적 실험에 활용할 수 있습니다.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

더 많은 동영상 탐색