쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 생후 초기 마우스에서 피질 미세아교세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 생후 초기 마우스의 피질 뇌 조직을 미세 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 혼합 교세포 배양물을 in vitro에서 17~21일 동안 배양하는 것입니다.

다음으로, 이러한 혼합 글리아 배양물에서 미세아교세포를 분리합니다. 마지막 단계는 추가 실험을 위해 미세아교세포를 세포 배양 플레이트에 도말하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 검사와 ELISA를 사용하여 이 분리 프로토콜이 미세아교세포의 면역 표현형과 기능성을 유지함을 보여줍니다.

미세 해부(microdissection)에 포함된 SEP는 수행하기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 속도와 정확성이 모두 필요합니다. 즉, 작업 속도가 너무 느리면 세포 회수율이 떨어지며, 뇌수막을 불완전하게 제거하면 글리아(glial) 배양액이 오염되어 글리아 성장을 방해하게 됩니다.

이후 MCM이라 칭할 마이크로그리아 완전 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 강아지 한 마리당 한 개의 플라스크를 준비하고 최소 1시간 동안 배양합니다. 이 평형화 단계는 실험의 성공을 위해 필수적입니다.

다음으로, 분주액을 준비하여 얼음 위에 올려 냉각시킵니다. 필요한 모든 배지의 경우, 강아지 한 마리당 6 mL의 MCM을 분주하고 해부 전에 37 °C 항온수조에서 가온합니다. 수평 기류 작업대와 해부 현미경을 70% ethanol로 닦아냅니다.

다음으로 시술에 필요한 멸균된 수술 도구들을 작업 영역에 배치합니다. 머리 고정을 위한 해부용 배지가 담긴 멸균 접시 하나와 해부를 위한 또 다른 접시를 준비합니다. 뇌 조직의 세절을 위해 세절용 배지를 별도의 접시에 분주합니다.

절단 및 뇌 적출 후, 갓 분리한 뇌를 해부 현미경 아래에 두고 등쪽이 위로 향하게 한 상태로 건조하게 유지하며 외형을 관찰합니다. 핀셋 끝을 중뇌와 피질의 교차점에 삽입하여 뇌를 고정합니다. 위치가 고정되면 등쪽 피질 뇌막을 완전히 제거합니다.

다음으로, 미세아교세포의 순도와 수득률을 최대화하기 위해 복측 뇌수막을 제거합니다. 모든 수막 조직을 완전히 제거하는 것이 매우 중요합니다. 대뇌피질을 뇌의 나머지 부분과 분리하십시오.

피질의 복측 또는 내측에 남아 있을 수 있는 잔여 피질 수막을 반드시 제거하십시오. 수막 조직을 제거한 후, 앞서 준비한 다지기 접시에 피질을 넣습니다. 2등급 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에서 가위를 사용하여 뇌 조직을 잘게 다집니다.

다져진 조직을 15 mm 원심 분리관으로 옮깁니다. 수율을 최대화하기 위해 가위와 조직 분쇄 접시를 각각 1 mL의 분쇄 배지로 헹굽니다. 이 세척액을 수집하여 다져진 조직이 들어 있는 15 mL 원심 분리관에 넣습니다.

조직 현탁액을 1~2분 동안 그대로 두어 잘게 다진 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 그 후, 가라앉은 조직이 흐트러지지 않도록 주의하면서 상층액 2 mL를 조심스럽게 제거하여 버립니다. 이전에 데워둔 MCM 3 mL를 다진 조직에 추가한 다음, 조직을 강하게 trituration 합니다.

트라이어(trier) 작업이 완료되었을 때 식별 가능한 고형 조직이 남아 있지 않아야 합니다. 동일한 피펫 팁을 사용하여 MCM 3 mL를 추가로 첨가해 팁에 남아 있는 분쇄된 샘플 잔여물을 수집하십시오. 수집이 완료되면, 분쇄된 조직을 원심분리하여 세포를 펠릿(pellet)화하십시오.

완료되면 펠렛화된 세포를 생물학적 안전 작업대로 옮깁니다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 부드럽게 재현탁합니다.

세포 펠릿을 2 mL의 따뜻한 MCM으로 현탁한 후, 준비된 플라스크에 세포 재현탁액을 첨가합니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 플라스크를 손바닥에 가볍게 두드려 조직 파편을 제거합니다.

탭핑 전후에 세포를 확인하여 부유물이 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 다음으로, 배지를 신선한 MCM으로 교체하고 플라스크를 인큐베이터로 옮깁니다. 매일 세포를 확인하여 성장 및 오염 여부를 모니터링하십시오.

약 17일에서 21일 후면 미세아교세포(microglial cells)를 수확할 수 있습니다. 세포의 준비 상태를 확인하려면 도립 위상차 현미경으로 관찰하십시오. 미세아교세포가 약 40%의 합류도(confluency)에 도달하여, 다른 세포들 위에 단층으로 성장하는 작고 밝은 구형 세포의 모습으로 나타나면 수확할 준비가 된 것입니다.

미세아교세포를 분리하기 위해, 플라스크를 실험대 위에 대고 강하게 두드립니다. 이러한 교반 과정은 미세아교세포의 낮은 부착 특성 덕분에 미세아교세포를 다른 신경교세포로부터 분리하는 데 도움이 됩니다. 플라스크 캡을 파라필름으로 밀봉하고, 온도 조절이 가능한 비가습 회전 진탕기를 사용하여 혼합 신경교세포 배양물을 5시간 동안 회전시킵니다.

이 시간이 지난 후, 미세아교세포(microglia)가 플라스크 표면에서 떨어져 나왔는지 육안으로 확인합니다. 도립 위상차 현미경으로 관찰했을 때 미세아교세포는 밝고 구형인 자유 부유 세포로 보입니다. 플라스크 바닥에는 성상교세포(astrocytes)와 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)의 잔류 층이 부착되어 있을 것입니다.

다음으로, 미세아교세포가 포함된 상층액을 멸균 원추형 원심분리 튜브에 수집하고 원심분리합니다. 원심분리된 미세아교세포 펠렛을 따뜻한 미세아교세포 성장 배지에 현탁하고, 혈구계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 24시간 후에 세포를 플라스틱 또는 멸균 유리 커버슬립이 놓인 24웰 플레이트 형식으로 배양합니다.

부유 세포와 잔해물을 제거하기 위해 배지를 따뜻한 새 MGM으로 교체합니다. 이 단계는 세포 생존과 휴지기 미세아교세포 유지에 매우 중요하며, 이 재급여 단계 직후에 미세아교세포의 순도를 평가하여 실험 준비가 되었는지 확인합니다. GFP를 내생적으로 발현하는 미세아교세포 유래 세포 배양물을 대식세포 항원 IBA1으로 염색하고 DAPI로 대조 염색하였습니다.

세포핵을 시각화한 결과, 95% 이상의 세포에서 GFP IBA one과 dpi의 공동 국소화가 관찰되었습니다. LPS로 세포를 자극한 후, 미세아교세포는 작은 분지형 표현형에서 아메바 모양으로 뚜렷한 형태학적 변화를 보였습니다. P 65에 대한 면역화학 염색 결과, 정상 조건에서 P 65는 세포질 전체에 걸쳐 확산되어 국소화되어 있음이 확인되었습니다.

반면, Pam P 65에 2시간 동안 노출시킨 후에는 면역 반응성이 세포핵으로 극적으로 이동하였으며, 이를 통해 분리된 미세아교세포(microglia)가 생화학적 면역 기능을 유지하고 있음을 확인하였습니다. 전염증성 사이토카인인 TNF alpha의 분비량은 PAM 또는 LPS 노출 후 측정되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 최상의 결과를 얻기 위해 신생 쥐의 피질 미세아교세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

멸균 기술을 유지하고, 박리된 피질 영역에서 뇌수막 조직을 완전히 제거하는 것이 중요합니다.