막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경 폐렴 구균 형광 염료를 사용
2014년 2월 17일
진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.
다음 실험의 전반적인 목표는 형광 염료를 사용하여 박테리아 시스템에서 막 역학 및 세포 내 이온 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 박테리아의 성장 단계에서 박테리아가 멤브레인을 가로질러 평형을 이룰 때까지 관심 플루어로 배양함으로써 달성됩니다. 다음으로, 박테리아를 선택한 약제로 처리하고 형광을 모니터링합니다.
결과는 지표 염료의 관찰된 형광 변화를 기반으로 멤브레인 탈분극, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 변화를 보여줄 수 있습니다. 진핵 시스템에서 사용되는 패치 클램핑과 같은 기존 전기생리학 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 이제 형광등을 사용하여 박테리아에서 막 역학 및 세포 내 이온 농도의 변화를 모니터링할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 염료 농도를 최적화하는 데 약간의 노력이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
로딩 조건 및 검출 설정: 박테리아 세포부터 시작합니다. 방금 세척 용액에 펠릿을 넣은 후 먼저 5개의 샘플에 충분한 밀리리터당 1억 CFU의 PBS 1밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 세척된 세포 1ml를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 1몰 필터 25마이크로리터를 추가합니다.
멸균된 포도당 원액을 주입한 다음 섭씨 37도의 가열 블록에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 첨가된 포도당은 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 15분 후 50마이크로몰 다이백 5마이크로리터와 PI 용액 10마이크로리터를 추가합니다.
세포를 여러 번 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 그런 다음 이 세포 현탁액을 투명한 96웰 플레이트의 5개 샘플 웰로 나눕니다. 다이백 NP 감지를 위해 설정된 예열 플레이트 리더에 플레이트를 로드합니다.
이제 판독값이 전처리 값으로 안정화될 때까지 30-40분 동안 분당 한 번씩 측정을 수행하여 세포막에 대한 다이백 평형을 모니터링합니다. 그런 다음 플레이트를 꺼내고 선택한 실험제를 추가합니다. 즉시 플레이트를 리더기에 다시 넣고 원하는 시간 동안 다이백 및 PI 형광을 계속 모니터링합니다.
이 절차를 위해 로딩 버퍼를 준비할 때 PBS 및 Probenecid를 추가하기 전에 잠시 와류를 수행해야 합니다. 이러한 용액을 첨가 한 후 다시 와류로 만들고 1 밀리리터의 2 x 세포 현탁액에 호일로 감쌉니다. 2 x 로딩 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.
이것은 10 개의 샘플에 충분합니다. 섭씨 37도의 수조에서 75분 동안 혼합물을 배양하고 이 모든 분석을 통해 빛으로부터 보호합니다. 염료의 농도와 배양 시간은 특정 박테리아 종 및 기타 실험 시스템 변수에 따라 분석 및 기준선 형광 검출 수준을 최적화하기 위해 조정해야 할 수 있습니다.
배양 후에는 세척할 때마다 세포를 세 번 세척합니다. 2, 400 Gs에서 10 분 동안 세포를 펠렛화하고 1 x pronic을 포함하는 2 밀리리터의 PBS에 재현탁시킵니다. 세 번 씻은 후 섭씨 37도에서 30분 더 세포를 배양합니다.
이를 통해 박테리아 내부의 estro는 염료의 에스테르 그룹을 가수분해하여 염료를 세포 내에서 활성화할 수 있습니다. 다음 펠릿, 세포는 snat를 제거하고 1 개의 x Probenecid를 포함하는 2 밀리리터의 PBS에 현탁시킵니다. 필요한 경우, 이제 포도당을 다시 추가하여 박테리아에 재활성화하고, 200마이크로리터의 세포를 각 샘플에 대해 96웰 플레이트의 한 웰에 로드하고, 플레이트를 하나의 샘플의 예열 리더에 로드할 수 있습니다.
글쎄, 먼저, 적절한 파장에서 기준선 판독값을 설정하고 1분 동안 초당 한 번의 판독 속도로 판독합니다. 그런 다음 플레이트를 제거하고 선택한 치료법을 약 5 마이크로 리터 첨가하십시오. 그것에.
글쎄, 빠르게 위아래로 몇 번 피펫팅하여 치료제를 혼합하고 즉시 플레이트를 리더기에 되돌려 놓습니다. 원하는 시간 동안 측정을 계속하십시오. 데이터를 분석하려면 value를 1로 값 2로 나누어 각 시점에 대한 형광 값의 비율을 계산하고 ratio 값을 그래프에 플로팅합니다.
준비 과정에서 pH 값이 6.5에서 8.0 사이인 5개 또는 6개의 고칼륨 완충액 범위를 만듭니다. 이전 절차에서와 같이 와류를 사용하여 중간 로그 상 배양 세척에서 두 개의 x 로딩 버퍼를 준비하고 세포를 세척하고 농축합니다. 그런 다음 SNAT를 2밀리리터의 BS로 교체하여 4개의 x 세포 현탁액을 만듭니다.
1 밀리리터의 4 x cell 현탁액과 1 ml의 2 x 로딩 버퍼를 결합하십시오. 이제 섭씨 30도의 수조에서 40분 동안 세포를 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
이제 세포를 세 번 씻으십시오. 이전에 표시된 대로 셀을 펠릿화합니다. 2 x prop Benin과 1 밀리몰 포도당을 포함하는 PBS 4 밀리리터를 다시 추가하고 3 회 세척 후 원심 분리를 반복합니다.
섭씨 37도에서 5분 더 세포를 배양합니다. 배경 형광 필터를 결정하려면 약 500마이크로리터의 에너지가 공급된 박테리아 현탁액을 살균하여 박테리아를 제거합니다. 그런 다음 여과액 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮기고 1분 동안 해당 웰의 흡수를 측정합니다.
in vivo calibration curve를 얻으려면 로드되고 에너지가 공급된 세포를 500마이크로리터 ALI 와트의 스핀다운하고 소생시킵니다. 각 샘플에 pH가 다른 일련의 고 칼륨 완충액에 현탁시키고 20 마이크로 몰의 리신을 첨가하십시오. 이는 세포의 세포 내 pH를 주변 완충액의 pH와 평형을 이룹니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 샘플을 플레이트 리더의 96 Well 플레이트로 옮깁니다. 각 샘플의 형광을 몇 분 동안 측정하여 각각에 대한 연구 판독값을 설정합니다. 잘.
이 데이터를 분석하려면 배경 형광 값을 뺀 다음 값을 나누어 형광 값의 비율을 계산합니다. 1 x 값 2에서 각 pH 버퍼의 비율 값을 표시하여 세포 내 pH의 변화를 측정하기 위한 보정 곡선을 생성합니다. 에너지가 공급된 세포의 샘플 200개를 플레이트에 넣고 5분 동안 5초마다 형광을 측정합니다.
동시에 한 샘플에 10마이크로몰 CCCP를 추가하는 동시에 다른 샘플에 관심 물질을 추가합니다. CCCP는 세포 내 pH를 감소시키기 위한 시간 정렬 양성 대조군입니다. 즉시 플레이트를 리더기에 다시 놓고 10분 동안 5초마다 형광 측정을 계속합니다.
추가 대조군으로, 모든 샘플에 20개의 마이크로 어금니 NI garrison을 추가하여 박테리아의 pH를 완충액의 pH와 5분 더 평형을 이룹니다. 멤브레인 극성을 탐색할 때 박테리아는 염료가 멤브레인 위에서 평형을 이룰 수 있도록 약 40분 동안 다이백으로 배양해야 합니다. 이것은 형광이 꾸준히 감소하는 것으로 나타납니다.
PI는 평형을 필요로 하지 않지만 다이백과 함께 막 파열을 모니터링하는 데 도움이 됩니다. 극성과 동시에 박테리아의 탈분극 및 파열은 오전 2:00 미만 동안 두 염료의 형광 강도가 상승하는 것으로 표시되며, 두 형광 신호의 비율이 계산되고이 비율의 증가 또는 감소는 세포 내 칼슘에 해당합니다. PBFI의 경우 세포 내 칼륨은 형광 비율로 측정됩니다.
세포 내 수소는 B-C-E-C-F am의 형광 비율을 사용하여 측정됩니다. 칼슘 iono 4 이온 마이신을 첨가하면 칼슘이 세포로 흘러 들어가 형광 비율을 증가시킵니다. valmy를 첨가하면 칼륨이 세포 밖으로 흘러나오는 반대 효과가 있으며, 이는 형광 비율의 감소로 나타납니다.
B-C-E-C-F를 사용하면 세포 내 pH를 측정할 수 있으며, 먼저 알려진 pH의 다양한 버퍼에서 보정 곡선이 만들어집니다. 염료의 형광 비율의 감소는 pH의 감소에 해당합니다. 이것은 힘의 양성자 CCCP의 추가, 검은 선, 그리고 양성자 원동력 소멸자가 추가 된 후 파란색 선에서 볼 수 있습니다.
두 번째 화살표는 세포 내 및 세포 외 수소 농도를 평형화하는 nissin의 첨가를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 박테리아 세포에서 멤브레인 탈분극, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 이 프로토콜을 다른 특성과 박테리아 세포를 연구하기 위한 시작점으로 사용할 수 있어야 합니다.
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개요
본 연구는 형광 기술을 사용하여 그람 양성 세균 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)에서 막 역학 및 세포 내 이온 농도를 모니터링하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 막 탈분극 및 이온 농도 변화를 관찰할 수 있는데, 이는 세균의 작은 크기 때문에 측정하기 어려운 변화입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 형광 영상
- 세포 막 역학
배경
- 세균에서 진핵생물에 비해 막 탈분극 및 이온 농도 변화 연구는 덜 이루어졌습니다.
- 전통적인 측정 기술은 종종 세균의 크기로 인해 효과가 없습니다.
- 형광 염료는 이러한 변화를 모니터링하는 비침습적 방법을 제공합니다.
- 폐렴구균은 중요한 병원체이므로 이 연구는 세균 생리학을 이해하는 데 관련이 있습니다.
연구 목적
- 세균에서 막 역학을 모니터링하기 위해 형광 염료를 활용합니다.
- 다양한 처리 시 세포 내 이온 농도를 평가합니다.
- 전통적인 전기 생리학 기술의 한계를 극복하는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 세균의 성장 단계 동안 형광 염료와 함께 배양합니다.
- 특정 제제로 처리한 후 형광 변화를 모니터링합니다.
- 형광 데이터를 기반으로 막 무결성 및 이온 농도를 분석합니다.
- 정확한 측정을 위한 염료 농도를 최적화합니다.
주요 결과
- 형광 변화는 막 탈분극 및 이온 농도 변화를 나타냅니다.
- 이 방법은 세균 막 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 합니다.
- 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해서는 염료 농도 최적화가 중요합니다.
- 이 기술은 이전에 얻기 어려웠던 세균 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론
- 형광 기술은 세균에서 막 역학을 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 세균 행동 및 생리학에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
- 이 방법의 추가 최적화 및 적용은 미생물학 분야의 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Monitoring membrane polarity, integrity, and intracellular ion concentrations in bacterial pathogens like Streptococcus pneumoniae addresses a critical gap in antimicrobial target validation. Fluorescent dye-based methods enable real-time, non-invasive assessment of membrane dynamics, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on bacterial physiology, informing go/no-go decisions in antibiotic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking membrane depolarization and ion flux changes to compound mechanisms of action.
- Operational Value: Enables functional target validation in Gram-positive pathogens where electrophysiology is infeasible due to size and cell wall complexity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying early physiological responses that correlate with bactericidal or bacteriostatic activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated bacterial systems for high-throughput screening using fluorescence plate readers, ensuring standardized, reproducible readouts.
- Scalability: Optimized loading and washing protocols allow consistent preparation of Streptococcus pneumoniae for multi-well plate assays.
- Quantitative Outputs: Ratiometric measurements of Ca2+, K+, and H+ via AM-ester dyes enable precise tracking of intracellular ion fluctuations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying pneumococcal pathogenesis, where membrane integrity and ion homeostasis are key virulence factors.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical evaluation by providing translatable biomarkers of membrane stress.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions on compound progression based on dose-dependent membrane depolarization or ion dysregulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay readiness for lead identification campaigns against Gram-positive pathogens.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of how compounds disrupt membrane potential, rupture, or ion homeostasis in Streptococcus pneumoniae.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized dye loading (e.g., DiBAC4(3), PI) and detection settings on fluorescence plate readers.
- Analytics: Generates ratiometric fluorescence readouts (value/value) that allow comparison across conditions and time points for Ca2+, K+, and H+ dynamics.
- Translational Research: Connects early mechanism data to preclinical relevance by monitoring ion fluxes tied to pneumococcal survival and virulence.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable fluorescent platform applicable to other bacterial species, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in membrane-related mechanisms of action.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability via optimized protocols for dye equilibration, washing, and detection in 96-well formats.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds with unfavorable membrane effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, mechanism-linked physiological readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, plate reader operation, and bacterial culture handling.
- Dependent on access to fluorescence plate readers capable of excitation/emission switching for ratiometric dyes (e.g., Fura-2, PBFI, BCECF).
- Necessitates cross-team standardization of loading conditions (e.g., glucose pre-incubation, AM-ester hydrolysis) to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for varying bacterial species, including dye concentration optimization and incubation time adjustments.
- Practical limitations include signal interference from autofluorescence and the need for careful controls to distinguish specific dye responses from artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Detecting Membrane Depolarization and Rupture
2:58
Detecting Changes in Intracellular Ca2+ or K+ Concentrations
5:31
Detecting Changes in Intracellular pH
8:56
Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations
10:49
Conclusion
