Name: 막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경 폐렴 구균 형광 염료를 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 형광 염료를 사용하여 Streptococcus pneumoniae의 막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도 변화를 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 전통적인 전기생리학 기법의 한계를 극복하여 세균 생리학 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.

1. 세균 배양을 준비 <ol><li> 실험에 사용하기 위해 문화를 성장 <ol><li> 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진. </li><li> 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어. </li></ol></li></ol> 2. 막 탈분극과 파열을 검출 <ol><li> 준비 시약 <ol><li> DiBAC 4의 50 μm의 주식 (3) 100 % DMSO에서, 그리고 DDH 2 O.에서 PI의 2 ㎎ / ㎖ 재고를 준비 DiBAC 4 (3) 주식은 6 개월 이상 -20 ° C에서 안정적이다. PI의 주식은 6 개월 이상 4 ° C에서 안정적이다. </li><li> 빛으로부터 보호하기 위해 호일 주식을 감싸십시오. </li></ol></li><li> 로딩박테리아 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 2,400 XG에서 원심 분리 단계 1.2.2에서 박테리아 세포 펠렛 및 2400 XG에서 다시 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 및 원심 분리기 10ml에 펠렛을 재현 탁, 상청액을 제거하여 두 번 씻어 10 분. </li><li> 원래 볼륨에 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 밀리리터 당 세균의 약 10 8 집락 형성 단위에 제공 할 것입니다. 세척 세포 (5 샘플에 대한 충분한) 1 ㎖를 제거하고 microcentrifuge 관에 배치합니다. </li><li> 이 세포에 25 mM의 포도당의 최종 농도 포도당의 1 M 필터 살균 원액 (DDH 2 O에서 제조 및 0.45 μm의 필터를 통해 여과)의 25 μl를 추가하고 37 ° C 가열 블록에 품어 십오 분. 참고 :이 모든 ATP 의존 막 채널과 세포 성분을위한 에너지를 제공합니다. 이 단계에 대한 필요성은 실험에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 50 μM DiBAC 4 (3) 주식의 5 μL 및 2 ㎎ / ㎖ PI 주식의 10 μl를 추가합니다. 이 각각 250 nM의 최종 농도 20 ㎍ / ㎖를 제공한다. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래 철저하게 섞는다. 분명 96 - 웰 플레이트의 각 샘플 아니라이 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 형광 검출 <ol><li> 예비 가온 (37 ℃) 형광 검출 플레이트 리더의 장소 접시. </li><li> 적절한 필터 DiBAC 4 (3) (490 nm의 여기, 516 nm의 방출)와 PI (535 nm의 여기, 617 nm의 방출) 검출 위치에 있는지 확인합니다. </li><li> 독서가 안정 될 때까지 (3) 막에 약 30 ~ 40 분 동안 모든 분 형광 측정을 수행 할 수있는 리더를 설정하거나 DiBAC 4의 평형을 (그리고 동시에 모니터링)을 허용하기 위해,이는 &quot;전처리&quot;독서 역할을합니다. </li><li> 접시를 꺼내 선택의 실험 에이전트를 추가하고 IMMEDiately DiBAC 4 원하는 시간에 대한 (3) 및 PI 형광 모니터링을 계속 독자에 다시 접시를 놓습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하는 것은 모든 우물에 동시에 에이전트를 추가하는 것이 도움이 될 수 있다면. </li><li> Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 막 탈분극과 파열을 평가하는 시간에 플롯 형광. DiBAC와 PI의 증가 형광 탈분극과 파열이 발생하고 있음을 나타냅니다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 내 칼슘 2 + 또는 K + 농도의 변화를 감지 <ol><li> 준비 시약 및 로딩 버퍼 <ol><li> 다음과 같은 시약을 준비 이온에 민감한 형광 염료의 5 mM의 재고 (fura-2/AM을 또는 PBFI / AM는, 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가), &quot;100 배는&quot;프로 베네 시드 (추가 1 77 mg을 유리 병에 PBS의 ML). 가용화염료는 -20 ° C 한 번에 냉동과 프로 베네 시드 6 개월 -20 ° C에서 용액에 안정되어있는 반면, 3 개월, 솔루션에 안정 될 수있다. </li><li> 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에, 5 mM의 이온 2 μL 다음 (6 개월 2-8 ° C에서 안정적) 100X PowerLoad 농축의 20 μl를, 분배 직접 PowerLoad에 민감한 염료. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드 20 ㎕ 다음 PBS 960 μl를 추가합니다. 혼합 한 마지막 시간을 소용돌이. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸. </li></ol></li><li> 염료와 박테리아를로드 <ol><li> 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 박테리아 문화를 씻는다. &quot;2 배&quot;세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 5ml에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 배 로딩 버퍼에 2 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 최종 concentr을 제공합니다1X PowerLoad, 5 μm의 형광 염료 및 1X의 프로 베네 시드의 관리 포인트. 참고 : 측정을 위해 각 샘플도 200 μl를 포함하는 것이기 때문에이 정지 10 샘플에 대한 충분한 음량을 제공합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 75 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 주 : 염료가 임의의 당분 해 기판 ​​부재와 염료의 유출을 최소화하는 프로 베네 시드의 존재 하에서 박테리아 세포에로드된다. </li><li> WASH 1 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고, 2 ㎖의 PBS에 재현 탁은 1X 프로 베네 시드를 포함. WASH 2, 3 단계를 반복 3.2.4 배. 또 다른 30 ​​분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이 세균 에스 테라 제 시간 거리에 내면화 형광 염료의 AM 에스테르 그룹을 가수 분해 할 수 있습니다. </li><li> WASH 4 : 10 분 2,400 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고에 resuspend 1X 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 2 ㎖에. 참고 : experime에 따라NT, 포도당은 다시 활력을 불어 박테리아에 여기에 다시 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 형광 검출 <ol><li> 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm </li><li> 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 3.2.8에서)로드 셀 200 μl를 추가합니다. (한 번에 하나의 잘 / 샘플 완료 다음 단계를 수행). </li><li> 의 ( &quot;값 1&quot;과 &quot;값 2&quot;에 대한 380 nm의 여기 / 510 nm의 방출을 위해 340 nm의 여기 / 510 nm의 방출) 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더에 잘 장소 접시 독서 기준을 설정하려면 1 분간 모든 초. </li><li> 접시를 꺼냅니다 (약 5 μL의 작은 볼륨)이 아니라에 선택의 처리를 추가, 신속하게 피펫 몇 번 아래로 혼합하고, 즉시 원하는마다 초를 읽을 형광 검출 플레이트 리더에 다시 배치 시간의 길이. (만약에플레이트 리더와 관련된 젝터)이도 완벽하게 읽기를 중지하고 판을 배출 할 필요없이, 원하는 치료를 추가하는 데 사용할 수있는, 사용할 수 있습니다. </li><li> Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. 값이 값 1로 분할하여 각각의 시간 지점에 대한 형광 값의 비율을 계산하고, 그래프의 비율 값을 플롯. </li></ol></li></ol> 4. 세포 내 pH의 변화 감지 <ol><li> 준비 시약 및 교정 버퍼 <ol><li> 다음과 같은 시약을 준비 BCECF / AM의 5 mM의 주식은 (. 염료의 50 μg을 포함하는 튜브에 DMSO의 적절한 금액을 추가이 재고 3 개월 -20 ° C에서 안정), 100 배 프로 베네 시드 (1 ㎖의 추가 PBS 77 mg을 유리 병에). 에탄올 nigericin의 1 ㎜ 주식 준비는 주변 버퍼의 pH의 세포 (세포의 pH (산도 나는 평형 필수)이 주식들입니다6 개월 -20 ° C)에서 테이블;. DMSO (양성자 동기가되는 힘을 풀다하는 protonophore 카보 닐 시안화 3 chlorophenylhydrazone (CCCP)의 0.5 mM의 주식이 주식은 6 개월 -20 ° C에서 안정) </li><li> 135 밀리 KH 2 PO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (염기), 110 mM의 K 2 HPO 4 / 20 밀리미터의 NaOH (이염) : 다음과 같은 높은 칼륨 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. 필터는 0.45 μm의 필터를 사용하여 멸균. (이 버퍼를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.) </li><li> 6.5-8.0까지 적어도 5-6 pH 값과 높은 칼륨 버퍼를 생성하기 위해 필요한 비율에 높은 칼륨 버퍼를 섞는다. </li><li> 다음과 같이 2 배는 버퍼로드 1 ㎖를 준비 : 15 ML 플라스틱 원뿔 관의 바닥에 직접 PowerLoad에 5 mM의 이온 성 염료 20 ㎕ 다음에 100 배 PowerLoad의 40 μl를, 분배. 소용돌이 간략하게 혼합한다. 100 배 프로 베네 시드의 40 μL 다음 PBS 900 μl를 추가합니다. Vort예 혼합 한 마지막 시간. 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸. </li></ol></li><li> 염료와 박테리아를로드 <ol><li> 펠렛 및 2.2.1에 설명 된대로 중반 로그 단계 세균성 문화의 8 ㎖를 씻어. &quot;배&quot;세포 현탁액을 만들기 위해 PBS 2 ml의 상층 액에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 배 로딩 버퍼에 4 배의 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 이는 2 ㎖의 최종 부피, 배 세포의 최종 농도 2 배 PowerLoad, 50 μM 형광 염료 및 배 프로 베네 시드에 제공 할 것입니다. </li><li> 빛으로부터 보호 40 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 품어. NOTE : 염료가 30 ° C의 낮은 온도에서 염료의 유출을 최소화 할 수있는 당분 해 기판의 부재하에 세균 세포에로드된다. </li><li> WASH 1 : 펠렛 10 분 2,400 XG에 원심 분리하여 세포가 과잉 색소를 제거하는 상층 액을 제거하고, 4 ㎖의 PBS에 재현 탁 2 배 프로 베네 시드의를 포함차 1 mM의 포도당 (박테리아를 재 활성화하기 위해). WASH 2, 3 배 프로 베네 시드와 10 mM의 포도당을 함유하는 (1X 세포의 최종 농도) 4 ㎖의 PBS의 최종 재 부상과 두 단계를 반복합니다 4.2.7. </li><li> 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이것은 세포가 완전히 재충전 멀리 내재화 BCECF에서 AM 에스테르기를 절단하는 세균 에스 테라위한 시간을 허용하는 것을 허용 할 것이다. </li></ol></li><li> 배경 형광을 수립하고 생체 내 보정 곡선 <ol><li> 37 ° C.에 형광 검출 플레이트 리더 플레이트 리더를 Prewarm </li><li> 배경 형광을 확인하려면, 박테리아를 제거한다 (단계 4.2.7에서)로드 및 통전 세균 현탁액 500 μl를 필터 소독, 및 96 - 웰 플레이트의 웰에 여과 액을 200 μl를 추가합니다. </li><li> (490 nm의 여기 / 530 nm의 방출 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더의 판을 놓습니다&quot;값 1&quot;1 분 &quot;값 2&quot;)에 대한 440 nm의 여기 / 530 nm의 방출. 이 배경 형광이 검량선 및 실험 샘플 모두에 대한 비율을 계산하기 전에 감산한​​다. </li><li> 생체 내 보정 곡선을 얻으려면 (6.5-8.0까지) 다른 pH 값에서 높은 칼륨 버퍼에서 한 번에 resuspend 단계 4.2.7에서로드 및 통전 세포를 500 ㎕의 분취 액을 씻어. </li><li> 주변의 버퍼의 pH에​​ 세포의 세포 내 pH가 평형을 5 분 동안 37 ° C에서 배양 샘플에 20 μM의 nigericin를 추가합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 세균 / pH 완충 조합의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 대한 꾸준한 독서를 확립하기 위해 몇 분 동안 형광을 측정하는 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓습니다. Microsoft Excel과 같은 데이터 분석 프로그램으로 측정 값을 내 보냅니다. </li><li> 학사 학위를 뺀 후ckground 형광 값,이 값에 의해 값 1을 분할하여 형광 값의 비율을 계산한다. 검량선을 작성하기 위해 각각의 pH 완충액에 대한 비율 값을 플롯. (박테리아에로드되는 형광 염료의 양마다 다를 수 검량선은,로드 셀의 각 새로운 배치에 대해 생성되어야한다.) </li></ol></li><li> 세포 내 pH의 변화 측정 <ol><li> 원하는 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 우물 (단계 4.2.7에서)로드와 활력 세포를 200 μl를 추가합니다. </li><li> 형광 검출 플레이트 리더 접시를 놓고 5 분 동안 매 5 초마다 샘플의 형광을 측정합니다. </li><li> 접시를 꺼내서 잘 하나 (세포 내 산도를 감소시키는 긍정적 인 제어 역할을) 다른 우물에 관심있는 실험 에이전트 (들)에 10 μM의 CCCP를 추가합니다. 정확하게, 시간이 지남에 따라 자신의 효과를 비교 오전를 사용하여 동시에 CCCP 선택의 에이전트를 추가하려면ultichannel 피펫. </li><li> 즉시 플레이트 리더로 ​​판을 반환하고 형광 10 분 동안 매 5 초마다 측정을 계속합니다. 추가 컨트롤과 같은 접시를 꺼내 주변의 버퍼의 pH에 박테리아의 pH 나는 평형을 모든 샘플에 20 μM Nigericin을 추가하고 5 분 동안 읽습니다. </li><li> 배경 형광 값을 뺀 후, 각 샘플에 대한 형광의 비율을 계산합니다. 검정 곡선의 각 읽기의 pH 나 보간. </li></ol></li></ol>

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저자는 선언 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 이러한 이벤트들은 시간이 지남에 박테리아의 개별 모집단으로부터 검출 형광성 박테리아의 소형, 200 μL 부피의 샘플을 측정 할 수있다. 형광 강도의 반응 속도와 변화는 질적으로 극성 또는 무결성을 막에 무슨 일이 일어나고 있는지를 결정하는 데 사용 될 수있다, 또는 칼슘 2 +, K +, 또는 박테리아 내에서 H +의 수준. 정량적으로 말하면, 형광 강도 값도 DEP의 정도를 계산하는데 사용될 수있다olarization, 파열, 칼슘 흡수, 칼륨 유출, 또는...

우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다. 우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 10-16. 하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 - 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC 4라는 비스 - 옥소 놀 염료 (3) (비스 - (1,3 - dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 17 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다. 우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 - 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC (4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 - 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC 4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다. 세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 (18), (21)에 사용한 폐렴 구균 19, 20, 2 +. 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 2 + 22 ~ 24과 H + 16의 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다. 세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 2 +와 S.에도 K +와 H + 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K +을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca 2 +을 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 +를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 18, 21을 사용하여 (K + uncoupler)와 CCCP (H + uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 2 + uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt 육수</td><td>Bacto, BD Diagnostics</td><td>249240</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Bacto, BD Diagnostics</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2)</td><td>인비트로겐(GIBCO)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5879</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DiBAC4(3)(bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)트리메틴 옥소놀)</td><td>Molecular Probes</td><td>B-438</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Make up in deionized</td></tr> water <tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLoad</td><td>Molecular Probes</td><td>P10020</td><td>100x concentrate</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td>77mg 바이알 1개에 PBS 1ml를 첨가하여 100배 스톡 만들기</td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td>특수 포장(50 &마이크로; g 부분 표본)</td></tr><tr><td>PBFI/AM</td><td>Molecular Probes</td><td>P1267</td><td>Special packaging (50 &micro; g 분취)</td></tr><tr><td>니게리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker</td><td>3246-01</td><td>monobasic</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker</td><td>5565-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>JT Baker</td><td>4012-01</td><td>이염기성</td></tr><tr><td>BCECF/AM</td><td>분자 프로브</td><td>B1170</td><td>특수 포장(50 &마이크로; g 분취량)</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>시그마-알드리치 원시체(Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Protonophore)는 H+를 세포질로 유입시켜 전위와 H+ 구배를 소멸시킵니다.</td></tr><tr><td>문화 튜브&nbsp;</td><td>VWR</td><td>53283-802</td>는 <td>Spectronic 분광 광도계에 적합합니다. 붕규산 유리</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectronic 20D +</td></tr> <tr><td>15 ml 플라스틱 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>투명 96-웰 폴리스티렌 마이크로 타이터 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2 다중 모드</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 소프트웨어</td><td>BioTek</td><td>Gen5&trade; 소프트웨어</td><td></td></tr></tbody></table>

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.

모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있었다. 멤브레인의 극성을 탐색 할 때, 박테리아는 치료 전 꾸준한 감소 및도 1a에 형광 후속 수평으로 나타낸 바와 같이, 멤브레인 위에 염료의 평형을 허용하기 위해 약 40 분 동안 DiBAC 함께 배양 할 필요가있다. 그림 1B에서와 같이 자사의 형광 신호가 처음 40 분 배양, BU에 걸쳐 꾸준로, PI는 평형을 필요로하지 않습니다DiBAC과 함께 자신의 존재를 톤은 극성과 동시에 막 파열을 모니터링하는 것이 도움이된다. ...

진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 염료를 이용하여 박테리아 시스템 내의 막 역학 및 세포 내 이온 농도의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아의 성장 단계에서 관심 형광체를 처리하여 세포막 전반에 걸쳐 평형이 이루어질 때까지 배양함으로써 수행됩니다. 그 다음, 선택한 약제를 박테리아에 처리하고 형광 변화를 모니터링합니다.지표 염료의 형광 변화 관찰을 통해 막 탈분극, 막 무결성 및 세포 내 이온 농도의 변화를 확인할 수 있습니다. 진핵생물 시스템에서 사용되는 패치 클램핑과 같은 기존의 전기생리학적 기법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 형광을 이용하여 박테리아의 막 동역학 및 세포 내 이온 농도 변화를 모니터링할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 염료 농도를 최적화하는 데 다소 노력이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.로딩 조건 및 검출 설정 박테리아 세포로 시작합니다. 세척 용액에서 막 펠렛화된 세포 펠렛을 최소 1mL의 PBS에 다시 현탁하여 mL당 1억 CFU 농도로 만듭니다. 이는 5개 샘플에 충분한 양입니다. 세척된 세포 1mL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 1M 필터 25µL를 추가합니다.멸균된 포도당 스톡 용액을 처리한 후, 세포를 37 °C 가열 블록에서 15분 동안 배양합니다. 첨가하는 포도당의 양은 실험에 따라 다를 수 있습니다. 15분 후, 50 µM dieback 5 µL와 PI 용액 10 µL를 첨가합니다.피펫으로 여러 번 상하로 섞어 세포를 충분히 혼합합니다. 그런 다음 이 세포 현탁액을 투명한 96웰 플레이트의 5개 샘플 웰에 나누어 넣습니다. 다이백(dieback) NP 검출용으로 설정되어 예열된 플레이트 리더에 플레이트를 넣습니다.이제 30분에서 40분 동안 분당 한 번씩 측정하여 세포막의 다이백(dieback) 평형 상태를 모니터링하고, 측정값이 전처치 전 수치로 안정될 때까지 기다립니다. 그 다음 플레이트를 꺼내어 선택한 실험제를 첨가합니다. 즉시 플레이트를 리더기에 다시 넣고 원하는 시간 동안 다이백과 PI 형광을 계속해서 모니터링합니다.본 절차를 위한 로딩 버퍼를 준비할 때, PBS와 Probenecid를 추가하기 전에 짧게 볼텍싱하십시오. 해당 용액들을 추가한 후 다시 볼텍싱하고, 2x 세포 현탁액 1 mL에 알루미늄 호일을 감싸십시오. 2x 로딩 버퍼 1 mL를 추가하십시오.이는 샘플 10개 분량에 해당합니다. 모든 분석 과정 동안 빛을 차단한 상태에서, 혼합물을 37 °C 항온수조에서 75분 동안 배양하십시오. 특정 박테리아 종 및 기타 실험 시스템 변수에 따라 분석을 최적화하고 기저 형광 검출 수준을 조정하기 위해 염료의 농도와 배양 시간을 조절해야 할 수도 있습니다.배양 후, 세척 과정을 세 번 반복하여 세포를 씻어냅니다. 2,400 Gs에서 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 1x pronic이 포함된 PBS 2 mL에 다시 현탁합니다. 세 번의 세척 과정이 끝나면, 세포를 37 °C에서 30분 동안 추가로 배양합니다.이를 통해 박테리아 내부의 estro가 염료의 에스테르기를 가수분해하여, 세포 내에서 염료를 활성화할 수 있습니다. 다음으로 세포를 원심분리하여 펠렛화한 후 snat을 제거하고, 1x Probenecid가 포함된 2 mL의 PBS에 다시 부유시킵니다. 필요한 경우, 박테리아에 다시 에너지를 공급하기 위해 포도당을 첨가할 수 있습니다. 각 샘플당 200 µL의 세포를 96-웰 플레이트의 한 웰에 분주하고, 플레이트를 예열된 리더기에 넣어 측정합니다.먼저 적절한 파장에서 초당 1회의 측정 속도로 1분 동안 baseline 수치를 설정합니다. 그런 다음 플레이트를 제거하고 선택한 처리물을 약 5 µL 첨가합니다.처리액이 섞이도록 피펫으로 빠르게 수차례 상하 혼합한 후, 즉시 플레이트를 리더기에 다시 넣습니다. 원하는 시간 동안 측정을 계속합니다. 데이터를 분석하려면 각 시간 지점의 형광 값에 대해 값 1을 값 2로 나누어 비율을 계산하고, 이 비율 값을 그래프로 도식화합니다.준비 단계에서 pH 6.5에서 8.0 범위의 고농도 칼륨 완충액 5~6종을 제조하십시오. 이전 절차와 마찬가지로, mid log phase 배양액 세척 후 볼텍스를 사용하여 2x 로딩 버퍼를 준비하고 세포를 농축하십시오. 그 다음, SNAT를 2 mL의 BS로 교체하여 4x 세포 현탁액을 만드십시오.4x 세포 현탁액 1 mL와 2x 로딩 버퍼 1 mL를 혼합합니다. 그다음 세포를 30 °C 항온수조에서 40분 동안 배양합니다. 이때 빛으로부터 차단하십시오.이제 세포를 세 번 세척합니다. 앞서 설명한 대로 세포를 펠릿화합니다. 2x prop Benin과 1 mM glucose가 포함된 PBS 4 mL를 다시 첨가하고, 세 번의 세척 후 원심분리를 반복합니다.세포를 37 °C에서 5분 동안 더 배양합니다. 배경 형광 필터를 결정하기 위해, 활성화된 박테리아 현탁액 약 500 µL를 멸균하여 박테리아를 제거합니다. 그런 다음 여과액 200 µL를 96 웰 플레이트에 옮기고 해당 웰의 흡광도를 1분 동안 측정합니다.in vivo 검정 곡선을 얻으려면, 로딩 및 활성화된 세포의 500 µL를 원심 분리하여 가라앉히고 재현탁하십시오. 이들을 서로 다른 pH의 고농도 칼륨 완충액 시리즈에 현탁하고, 각 샘플에 20 µM의 리신을 첨가하십시오. 이렇게 하면 세포의 세포 내 pH가 주변 완충액의 pH와 평형을 이루게 됩니다.그런 다음 샘플을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 샘플을 플레이트 리더기의 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰의 측정값을 설정하기 위해 각 샘플의 형광을 몇 분 동안 측정합니다.이 데이터를 분석하려면 배경 형광 값을 뺀 다음, 값 1을 값 2로 나누어 형광 값의 비율을 계산하십시오. 각 pH 완충액에 대한 비율 값을 도식화하여 세포 내 pH 변화를 측정하기 위한 검정 곡선을 작성합니다. 활성화된 세포 샘플 200 µL를 플레이트에 분주하고 5분 동안 5초마다 형광을 측정하십시오.동시에, 한 샘플에는 10 µM CCCP를 추가하고 다른 샘플들에는 분석 대상 시약을 추가합니다. CCCP는 세포 내 pH 감소를 확인하기 위해 시간축을 맞춘 양성 대조군으로 사용됩니다. 즉시 플레이트를 리더기에 넣고 10분 동안 5초 간격으로 형광 측정을 계속합니다.추가 제어 장치로, 박테리아의 pH를 버퍼의 pH와 평형 상태로 맞추기 위해 모든 샘플에 20 µM NI garrison을 추가하고 5분 더 유지합니다. 막 극성을 조사할 때는 염료가 막을 통해 평형을 이룰 수 있도록 박테리아를 die back과 함께 약 40분 동안 배양해야 합니다. 이는 형광 강도가 지속적으로 감소하다가 일정 수준에서 유지되는 것으로 확인할 수 있습니다.PI는 평형화 과정이 필요하지 않으나, dieback과 마찬가지로 막 파열을 모니터링하는 데 유용합니다. 극성과 동시에, 박테리아의 탈분극 및 파열은 두 염료 모두의 형광 강도 상승으로 나타나며, 오전 2시 이전까지 두 형광 신호의 비율을 계산하며, 이 비율의 증가 또는 감소는 세포 내 칼슘 농도에 해당합니다. PBFI의 경우, 형광 비율을 통해 세포 내 칼륨 농도를 측정합니다.세포 내 수소는 B-C-E-C-F am의 형광 비율을 사용하여 측정합니다. 칼슘 이오노포어인 이오노마이신(ionomycin)을 첨가하면 칼슘이 세포 내로 유입되어 형광 비율이 증가합니다. 발리노마이신(valinomycin)을 첨가하면 이와 반대되는 효과가 나타나 칼륨이 세포 밖으로 유출되며, 이는 형광 비율의 감소로 나타납니다.B-C-E-C-F를 통해 세포 내 pH를 측정할 수 있으며, 먼저 pH가 알려진 다양한 완충액을 사용하여 검정 곡선을 작성합니다. 염료의 형광 비율 감소는 pH의 감소에 해당합니다. 이는 양성자 힘 CCCP를 첨가했을 때(검은색 선)와 양성자 구동력 소산제를 첨가한 후(파란색 선)에 확인할 수 있습니다.두 번째 화살표는 세포 내외부의 수소 농도를 평형 상태로 만드는 nissin의 첨가를 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 박테리아 세포의 막 탈분극, 막 무결성 및 세포 내 이온 농도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 이 프로토콜을 시작점으로 삼아 다른 특성 및 박테리아 세포를 연구하는 데 활용할 수 있을 것입니다.

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

여기에 우리가 그람 음성의 대장균 (대장균)를 생산 하는 프로토콜을 현재 spheroplasts 및 그람 양성 간 균 megaterium (B. megaterium) 명확 하 게 시각화 하 고 빠르게 특성 protoplasts 펩 티 드-박테리아의 상호 막 지역화 및 펩 티 드 translocating를 정의 하는 체계적인 방법을 제공 합니다.

생산 및 항균 성 펩 티 드 지역화 특성 세균 Spheroplasts Protoplasts의 시각화

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

배우세요 형광 염료를 사용하여 Streptococcus pneumoniae의 막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도 변화를 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 전통적인 전기생리학 기법의 한계를 극복하여 세균 생리학 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경

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