엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

이 절차의 전반적인 목표는 세포 및 콜라겐 재구성을 연구하는 데 사용할 수 있는 피브린 기반 구조를 만드는 것입니다. 이는 먼저 인간 정맥 복재 세포를 기증자 조직에서 분리하고 배양에서 확장함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 벨크로 스트립을 유연한 멤브레인에 붙이는 것입니다.

6개의 우물 플레이트의 바닥에 구조물을 고정할 중앙에 정사각형 공간을 만듭니다. 다음으로, 피브리노겐 트롬빈 세포와 형광 표지된 비드의 혼합물을 벨크로 스트립 사이의 공간에 첨가하고 중합하여 겔을 형성하도록 합니다. 마지막 단계는 세포를 컨디셔닝하고 구조체에 단축 순환 변형을 적용하거나 정적 변형을 해제하여 배향 매트릭스 형성을 유도하는 것입니다.

벨크로 포스트에서 피브린 젤을 한 방향으로 트리밍합니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 시간 경과에 따른 구조물을 모니터링하여 세포 및 콜라겐 재조직의 변화를 설명하는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다양한 세포 유형에 의한 콜라겐 형성 및 재배향 속도와 관련된 콜라겐 리모델링 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우선, 물질의 2차 사용에 대한 지침에 따라 정맥 saana magna에서 인간 기증자 조직을 획득합니다. 그런 다음 Schnell 등의 프로토콜에 따라 인간 정맥 복재 세포 또는 H VSC를 조직에서 분리하고 액체 질소에 보관합니다. 필요한 경우, 250,000 빠른 해동 H VSC가 들어 있는 하나의 바이알을 15ml의 예열 성장이 가능한 T 75 플라스크에 넣어 세포를 확장합니다.

배지는 440 밀리리터의 고급 DMEM, 50 밀리리터의 소 태아 혈청으로 구성됩니다. 100 X 펜 연쇄상구균 5 밀리리터 및 최대 200 밀리몰 L 글럿 5 밀리리터. 세포가 합류할 때까지 약 2주 동안 2-3일마다 성장 배지를 교체하십시오.

일단 합류하면 세포를 수확하고 통로까지 분할합니다. 9. 계획된 실험을 위한 적절한 수의 세포가 있을 때까지 트립신을 사용합니다. 각 구성물에는 약 150만 개의 셀이 필요합니다.

적절한 수의 세포가 성장하면 90% co에서 유창하게 수확한 다음 밀리리터당 1,500만 개의 세포로 성장 배지에 세포를 현탁시킵니다. 필요할 때까지 얼음 위에 올려 놓으십시오. 엘라스토머와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다.

이 접착제를 사용하여 벨크로의 부드러운 면에서 걸린 7mm x 3mm 스트립을 플렉스 셀 플레이트의 유연한 멤브레인에 부착합니다. 중앙이 열린 십자 모양을 형성하려면 실리콘 접착제를 섭씨 60도의 오븐에서 밤새 건조시켜 접착제가 굳어지도록 합니다. 그런 다음 각 웰에 5ml의 70% 에탄올을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 플레이트를 살균합니다.

멸균 PBS로 우물을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 웰과 벨크로 스트립에서 PBS를 제거합니다. 덮개가 없는 플레이트를 조직 배양 후드의 UV 램프 아래에 30분 동안 놓고 표면을 살균합니다.

완료되면 접시를 덮고 사용할 때까지 멸균 상태로 유지하십시오. 다음으로, 배양 첫 7일 동안 500ml의 성장 배지에 130mg의 알산, 2개의 인산염을 첨가하여 조직 공학 배지를 준비합니다. 또한 피브린이 분해되는 것을 방지하기 위해 엡실론 아미노카프로산 밀리리터당 1밀리그램을 첨가하고, 피브리노겐을 조직 공학 밀리리터당 실제 단백질 10밀리그램의 농도로 용해시킵니다.

그런 다음 불임. 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 피브리노겐 용액을 여과하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 아미노카프로산이 보충된 조직 공학 배지에서 스톡 트롬빈을 밀리리터당 10 국제 단위의 최종 농도로 희석하여 트롬빈 용액을 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.

다음으로, 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 각 조직 구조체에 대한 마이크로 원심분리 튜브에 미리 준비합니다. 7 분 동안 350 시간 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 상등액을 버리고 트롬빈 용액 50 마이크로 리터에 세포를 재현탁시키고 내부 참조 마커로 사용할 파란색 형광 폴리스티렌 마이크로 스피어인 4 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 피브리노겐 용액을 피펫 팁에 주입합니다.

피펫의 부피를 100 microliter로 늘린 다음 50 microliter 용액의 피브리노겐 용액을 원심 분리기 튜브에 피펫으로 넣습니다. 트롬빈과 세포 혼합물과 함께 100마이크로리터의 혼합물을 끌어당겨 트롬빈과 피브리노겐을 부드럽게 혼합하여 기포 형성을 방지합니다. 용액이 완전히 혼합되면 벨크로 스트립 안팎으로 겔 혼합물을 피펫으로 삐

그런 다음 아미노카프로산이 함유된 조직 공학 배지 6ml를 각 웰에 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 처음 7일 동안은 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 일주일 후, 배지에서 아미노카프로산 보충제를 제거하고 조직 엔지니어링 배지로 겔을 계속 배양합니다.

여전히 배양에서 처음 5일 동안 2-3일마다 이를 교환하면 정적 조건에서 단일 방향으로 콜라겐 재구성을 유도하기 위해 섬유 제약으로 인해 축 방향으로 콜라겐 섬유를 형성하는 정적 변형 하에서 구조체가 압축되고 재조직될 수 있습니다. 먼저, 12일째에 추가로 일주일 동안 세포를 배양하고 두 개의 벨크로 스트립에서 조직 구조체를 한 방향으로 잘라냅니다. 이것은 피브린이 압축될 때 반대 방향으로 변형을 유발합니다.

또는 순환 하중의 경우, 6일째에 개스킷이 장착된 플렉스 셀 베이스 플레이트의 적재 포스트 세트 위에 플레이트를 배치하면 적재 포스트가 웰의 유연한 멤브레인을 지지하고 기둥 바닥을 아래로 당겨 한 방향으로 변형을 생성할 수 있습니다. 다음으로, 구성에 순환 변형을 적용하도록 소프트웨어 프로토콜을 설정합니다. 여기에 표시된 프로그램은 사인파와 유사한 간헐적 변형에 대한 것으로, 3시간 동안 3시간의 휴식과 번갈아 가며 1헤르츠에서 0에서 5% 변형으로 구조체를 변형시킵니다.

프로그램이 준비되면 진공 펌프를 켜고 프로그램을 시작합니다. 컨트롤러는 시스템의 진공 강도를 조절하며, 이는 프로그램에 따라 구조물에 주기적 변형을 가하기 위해 지지 기둥 주위의 멤브레인을 아래로 당깁니다. 일주일 동안 프로그램을 실행하고, 컨디셔닝 1주일 후 2-3일마다 배지를 교환하고, 직사각형 포스트를 90도 회전시켜 콜라겐 재구성을 유도하고, 3일 동안 변형 방향을 변경합니다.

활성 실시간 콜라겐 리모델링을 시각화하려면 세포 추적기 주황색을 추가합니다. 세포질과 CNA 35 OG 4 88을 염색하기 위해 4 마이크로 몰의 농도를 추가합니다. 콜라겐 섬유를 시각화하기 위해 1마이크로몰의 농도를 추가합니다.

이 프로브는 세포 생존력이나 콜라겐 형성을 방해하지 않습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 운반하여 세포와 콜라겐을 시각화합니다.

표면의 겔 이미지를 촬영하고 약 60미크론까지 골격에 삽입하여 시간 경과에 따른 이러한 수준의 조직 변화를 확인합니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터 내부의 기계 컨디셔닝 설정으로 되돌립니다. 며칠에 한 번씩 이 절차를 반복하여 자극에 대한 반응으로 세포 재편성의 진행 상황을 추적합니다.

중합 전에 피브리노겐 혼합물에 첨가된 형광 미세구는 피브린 네트워크에 갇히게 되고 참조 마커로 잘 작동하여 정적 조건에서 배양될 때 다른 시점에서 동일한 영역의 시각화를 보장하고 4개의 포스트 모두에 부착됩니다. 실제 광섬유 또는 세포 방향은 광섬유 포스트 연결 중 두 개를 트리밍한 후 3일 후에 볼 수 없습니다. 수축으로 인한 단일 축 변형은 녹색으로 표시된 콜라겐 섬유를 정렬했습니다.

일주일 동안 한 방향으로 주기적으로 변형된 인간 정맥 복재 세포가 여기에 표시되며, 이는 구축물의 표면과 겔 내로 60 미크론입니다. 변형 방향을 90도 회전시켰을 때, 3일 후의 세포 반응은 조직의 중심부보다 표면에서 더 빠른 것으로 나타났습니다. 엔지니어링을 마스터하면 이러한 FI 기반 조직 구조를 약 2시간 내에 수행할 수 있습니다.