mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

이 절차의 전반적인 목표는 세포 미세환경의 다양한 매개변수를 독립적으로 제어하기 위해, 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 상에 임의의 표적 단백질을 고정하는 간단하고 효율적인 전략을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 스탬프 표면에 단백질 용액을 도포함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 고순도 질소 가스를 일정하게 흘려 PDMS 스탬프의 구조화된 표면을 조심스럽게 건조시키는 것입니다.

다음으로, 단백질이 코팅된 스탬프의 구조화된 표면을 건조된 하이드로겔 표면에 접촉시키고, PDMS 스탬프 상단에 짧게 압력을 가하여 스탬프의 마이크로 구조와 하이드로겔 표면이 잘 접촉되도록 합니다. 마지막 단계는 하이드로겔 표면에서 PDMS 스탬프를 조심스럽게 제거하고, 비인쇄 영역의 처리 후 스탬프를 세척하는 것입니다. BSA를 통해 세포를 마이크로 패턴이 형성된 하이드로겔 표면에 안착시킬 수 있습니다. 최종적으로, 도립 형광 현미경을 사용하여 단백질 마이크로 구조를 관찰합니다.

이 방법은 세포외 기질의 특성, 예를 들어 강성, 세포 리간드 밀도 또는 단백질의 성질과 같은 요소들의 상대적 기여도 등 기계적 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 아노트랜잭션 과정에서는 이 절차를 화학 흄 후드 내에서 수행하는 것이 권장됩니다. 먼저 지름 25 millimeter의 원형 유리 커버슬립을 페트리 접시에 놓고, 0.1 molar 수산화나트륨 용액을 5분 동안 도포하는 것으로 시작하십시오.

수산화나트륨 용액을 제거하고 커버슬립을 멸균된 DD H2O에 완전히 담근 후, 로킹 플레이트 위에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 멸균된 DD H2O를 따라내고 다시 멸균된 DD H2O를 추가하여 커버슬립이 완전히 잠기게 한 뒤, 다시 20분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 멸균된 핀셋으로 커버슬립을 꺼내어 새로운 페트리 접시에 옮깁니다. 활성화된 면이 위를 향하게 하여 고순도 질소 가스를 일정하게 흘려 커버슬립을 건조시킵니다.

커버 슬립이 마르면 다시 멸균 배양 후드로 가져가 각 커버 슬립의 활성화된 면에 3-trimethyl propyl acrylate를 얇게 도포합니다. 1시간 동안 방치한 후, 멸균된 DD H2O로 유리 커버 슬립을 충분히 세척합니다.

그런 다음 커버슬립을 새 페트리 접시의 멸균 DD H2O에 담급니다. 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하고 로킹 플레이트에 올려 10분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 마지막으로 끝이 가는 멸균 핀셋을 사용하여 커버슬립을 DD H2O에서 새 페트리 접시로 옮깁니다.

활성화된 면이 위로 향하게 합니다. 커버슬립에 먼지가 붙는 것을 방지하기 위해 접시를 알루미늄 호일로 덮고 건조한 곳의 실온에 보관하십시오. 이 절차를 시작하려면, 멸균된 hydroxy poly acrylamide 하이드로겔 용액 5 mL와 신선한 10% ammonium per sulfate 용액 100 µL를 준비하십시오.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로, 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 용액에 테트라메틸렌디아민 2.5 µL와 과황산암모늄 용액 25 µL를 첨가하십시오. 중합을 개시하기 위해, 멸균 후드 내의 멸균 조건에서 기포가 유입되지 않도록 세 번 연속으로 피펫팅하여 용액을 혼합하고, 25 mm 원형 커버슬립 위에 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 용액 25 µL 한 방울을 떨어뜨린 후, 즉시 22 mm 원형 유리 커버슬립을 액적 위에 올려 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 용액을 압착하십시오. 22 mm 유리 커버슬립은 사전에 UV 오존 세척기로 7분간 노출시켜 활성화한 것입니다.

멸균 핀셋을 사용하여 유리 커버슬립의 중심을 맞추고 기포를 제거합니다. 하이드록시 폴리아크릴아마이드 하이드로젤이 상온에서 15분 동안 중합되도록 둡니다. 튜브에 남은 하이드록시 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 용액을 수동으로 뒤집어 섞어줍니다.

중합 과정의 완료를 확인하려면 커버슬립을 멸균된 $\text{ddH}_2\text{O}$에 완전히 담그십시오. 면도날의 끝을 22 mm 유리 커버슬립과 hydroxy poly acrylamide 하이드로젤 층 사이에 넣어 22 mm 유리 커버슬립을 조심스럽게 분리하십시오. hydroxy poly acrylamide 하이드로젤을 멸균된 PBS로 3회 세척하고, 수분을 유지하기 위해 젤을 멸균된 PBS에 완전히 담가 두십시오.

본 절차에 사용된 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로 스탬프는 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 제작되었습니다. PDMS 마이크로 스탬프를 50:50 에탄올 수용액에 넣고 15분 동안 초음파 처리합니다. 질소 가스 흐름으로 스탬프를 건조시킨 후, 패턴 면이 위로 향하게 하여 UV 오존 세정기에 넣고 7분 동안 처리합니다.

멸균 후드 아래에서 A-P-D-M-S의 미세 구조 표면 위에 원하는 단백질 용액 150 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 본 시연에서는 FI nin 스탬프가 사용되었습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 단백질 용액을 스탬프의 각 모서리 방향으로 밀어내어 스탬프 표면 전체에 넓게 펴 바릅니다.

단백질 용액이 PDMS 스탬프에 흡착되도록 60분 동안 둡니다. 단백질 손상을 방지하기 위해 무균 후드 내의 램프를 끕니다. 그다음, hydroxy poly acrylamide 하이드로젤이 코팅된 커버슬립을 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.

멸균 조건 하에서 낮은 유량의 질소 스트림을 사용하여 하이드록시 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 기판 표면의 과잉 PBS를 제거합니다. 젤 표면에 고여 있는 물이 더 이상 보이지 않으면 즉시 절차를 중단하십시오.

이 단계에서 겔을 완전히 건조해서는 안 됩니다. 고순도 질소 가스를 일정하게 흘려 PDMS 스탬프의 구조화된 표면을 조심스럽게 건조하십시오. 드레싱 조직 포셉으로 단백질이 코팅된 스탬프를 잡고, 구조화된 표면을 건조된 하이드로겔 표면에 접촉시키십시오.

핀셋 끝으로 PDMS 스탬프 상단에 가볍게 압력을 가하여 스탬프의 미세 구조와 하이드로젤 표면이 잘 접촉되도록 한 뒤, 실온에서 1시간 동안 PDMS 스탬프를 하이드로젤 표면에 그대로 둡니다. 드레싱 조직 핀셋을 사용하여 하이드록시 폴리아크릴아마이드 하이드로젤에서 PDMS 스탬프를 조심스럽게 제거하고, 에탄올 수용액에서 15분 동안 흔들어 스탬프를 세척합니다. 스탬핑 처리된 하이드록시 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 멸균 조건에서 PBS로 3회 교체하며, 회당 10분씩 충분히 세척합니다.

마지막 PBS 세척 후, 멸균된 BSA 용액을 첨가하고 로킹 플레이트(rocking plate) 위에서 완만하게 흔들어주며 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이는 다음 날 비인쇄 구역을 차단하는 역할을 합니다. 스탬핑된 hydroxy poly acrylamide 하이드로겔을 멸균 조건에서 PBS로 3회 교체하여 세척하며, 각 교체 시마다 10분씩 충분히 세척합니다.

스탬핑된 hydroxy poly acrylamide 하이드로젤은 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 결과에 따르면 hydroxy poly acrylamide 하이드로젤의 강성 변화와 bis acrylamide 가교제의 양 사이에 선형 상관관계가 있음이 나타났습니다. 세 가지 서로 다른 강성의 hydroxy poly acrylamide 하이드로젤 위에 증착된 적층 직사각형 마이크로 패턴의 epi 형광 이미지는 마이크로 패턴의 기하학적 구조와 매트릭스 강성을 독립적으로 조절할 수 있음을 보여줍니다. 세포 리간드 밀도는 PDMS 스탬프를 배양하는 데 사용되는 단백질 용액의 농도를 변경하여 조절할 수 있습니다.

여기에 순차적인 마이크로 접촉 인쇄를 통해 얻은 두 개의 형광 이미지가 제시되어 있습니다. 25 kilo pascal 히드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 기판 위에 빨간색의 피브로넥틴 줄무늬와 초록색의 라미닌 줄무늬가 90도 각도로 교차하여 인쇄되었으며, 피브린 라미닌과 콜라겐 줄무늬가 순차적으로 마이크로 인쇄되었습니다. 일차 세포를 균일하게 코팅된 표면과 마이크로 패턴이 형성된 히드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 표면에 도말했을 때, 세포 생존율은 도말 후 최대 3일까지 최소 80%를 유지했습니다.

또한 세포가 부드러운 기질에 비해 단단한 기질에서 더 많이 증식하는 것이 관찰되었습니다. 세 가지 서로 다른 강도의 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로젤 위에 증착된 직사각형의 피브로넥틴 코팅 마이크로 패턴에 플레이팅했을 때, 일차 혈관 내피 세포는 부드러운 기질에서 낮은 액틴 섬유 밀도와 둥근 핵을 나타냈습니다.

더 단단한 기질 위의 기질에서 액틴 섬유는 더 직선적이고 두꺼워지며, 핵은 발달 이후 변형됩니다. 이 기술은 기계적 신호전달 분야의 연구자들이 일차 세포 또는 줄기세포, 조직 수준, 모델 생물, 형태, 인구 통계 또는 기관 시스템과 같은 광범위한 세포 시스템에서 세포 미세환경 파라미터의 개별적인 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.