mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

이 절차의 전반적인 목표는 세포 미세환경의 다양한 매개변수를 독립적으로 제어하기 위해 폴리아크릴아미드 하이드로겔에서 관심 단백질을 고정하기 위한 간단하고 효율적인 전략을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS 스탬프 표면에 단백질 용액을 펴서 수행됩니다. 두 번째 단계는 고순도 질소 가스의 꾸준한 흐름으로 PDMS 스탬프의 구조화된 표면을 조심스럽게 건조시키는 것입니다.

다음으로, 단백질 코팅된 스탬프를 건조된 하이드로겔 표면과 접촉하는 구조화된 표면으로 배치하고, 스탬프 마이크로 피쳐와 하이드로겔 표면 사이의 양호한 접촉을 보장하기 위해 PDMS 스탬프 상부에 간단한 압력 지점을 적용하고, 마지막 단계는 하이드로겔 표면에서 PDMS 스탬프를 부드럽게 제거하고 비인쇄 영역의 인쇄 후 스탬프를 청소하는 것입니다. BSA를 사용하면 세포를 마이크로 패턴 하이드로겔 표면에 장착할 수 있습니다. 궁극적으로 도립 형광 현미경은 단백질 미시적 특징을 관찰하는 데 사용됩니다.

이 방법은 메카노 형질도입 분야의 핵심 질문, 예를 들어 강성, 세포 리곤 밀도 또는 단백질 특성과 같은 세포 외 기질 특성의 상대적 기여도에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. ano 거래 프로세스에서는 이 절차를 화학 흄 후드에서 수행하는 것이 좋습니다. 먼저 25mm 직경의 원형 유리 커버 슬립을 페트리 접시에 넣고 0.1몰 수산화나트륨 용액을 5분 동안 바르십시오.

수산화나트륨 용액을 제거하고 커버 슬립을 멸균 DD H2O에 완전히 담그고 흔들 판에 20 분 동안 부드럽게 흔들고 멸균 DDH 2 O를 배출하고 멸균 DDH 2 O를 더 추가하여 커버 슬립을 완전히 담그고 또 다른 20 분 동안 부드럽게 흔들립니다. 멸균 핀셋으로 커버 슬립을 제거하고 새 페트리 접시에 넣었습니다. 활성화된 면이 위를 향하게 하여 건조시키면 덮개가 고순도 질소 가스의 일정한 흐름으로 미끄러집니다.

커버 슬립이 건조되면 멸균 배양 후드로 다시 가져가 각 커버의 활성화된 면에 3개의 트리메틸 프로필 acrl의 얇은 층을 바르십시오. 1시간 후 1시간 동안 미끄러집니다. 유리 커버 슬립을 멸균 DD H2O로 광범위하게 세척하십시오.

그런 다음 덮개 슬립을 멸균 DD H2O에 담그고 새 페트리 접시에 담급니다. 페트리 접시를 파라 필름으로 밀봉하고 10분 동안 부드럽게 저어주면서 흔들 접시에 놓습니다. 마지막으로, 끝이 미세한 멸균 핀셋을 사용하여 DDH two O의 커버 슬립을 새 페트리 접시로 옮깁니다.

활성화된 면이 위로 향하게 합니다. 덮개 슬립에 먼지가 달라붙지 않도록 접시를 알루미늄 호일로 덮고 건조한 곳에서 실온에서 보관하십시오. 이 절차를 시작하려면 5ml의 멸균 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 용액과 황산염 용액당 100마이크로리터의 새로운 10% 암모늄을 준비합니다.

프로토콜 텍스트에 설명된 대로 2.5마이크로리터의 테트라 메틸렌 디아민과 황산염당 25마이크로리터의 암모늄을 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 용액에 추가합니다. 중합을 시작하려면 멸균 후드 아래에서 멸균 상태에서 기포가 유입되지 않도록 3회 연속 피펫팅으로 용액을 혼합하고, 25mm 원형 커버 슬립에 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 용액 25마이크로리터 방울을 떨어뜨린 다음 즉시 액적 위에 22mm 원형 유리 커버 슬립을 올려 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 용액을 짜냅니다. 22mm 유리 커버 슬립은 이전에 UV 오존 클리너에 7분 동안 노출되어 활성화되었습니다.

유리 덮개를 중앙에 놓고 멸균 핀셋으로 미끄러지고 거품을 매끄럽게 제거합니다. 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 실온에서 15분 동안 중합시킵니다. 튜브에 남아 있는 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔 용액을 수동으로 뒤집습니다.

중합 과정이 완료되었는지 확인하려면 커버 슬립을 멸균 D DH 2 o로 완전히 담그십시오. 22mm 유리 커버 슬립과 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 층 사이에 면도날 가장자리를 삽입하여 22mm 유리 커버 슬립을 조심스럽게 분리합니다. 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 멸균 PBS로 세 번 세척하고 젤을 멸균 PBS에 완전히 담가 두어 수분을 유지합니다.

이 절차에 사용된 폴리 디메틸 소안 또는 PDMS 마이크로 스탬프는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 제작되었습니다. PDMS 마이크로 스탬프를 50-50 에탄올 수용액에 넣고 15분 동안 초음파 처리합니다. 질소 흐름의 증기로 스탬프를 건조시키고 UV 오존 클리너에 7 분 동안 패턴화하여 놓습니다.

멸균 후드 아래에서 원하는 단백질 용액을 150마이크로리터의 방울을 A-P-D-M-S의 미세 구조 표면에 떨어뜨립니다. 이 데모에서는 Stamp FI nin이 사용됩니다. 멸균 피펫 팁으로 단백질 용액을 스탬프의 각 모서리 쪽으로 움직여 스탬프 표면을 가로질러 펼칩니다.

단백질 용액이 PDMS 스탬프에 흡수되도록 60분 동안 그대로 둡니다. 이 멸균 후드 아래에서 단백질 손상을 방지하기 위해 램프를 끕니다. 다음으로, 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 코팅 커버 슬립을 새 페트리 접시에 옮깁니다.

멸균 조건에서 낮은 질소 흐름으로 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 기질 표면에서 과도한 PBS를 제거합니다. 절차를 중지합니다. 젤 표면에 고인 물의 증거가 관찰되지 않는 즉시.

이 단계에서 젤을 완전히 건조시켜서는 안 됩니다. PDMS 스탬프의 구조화된 표면을 고순도 질소 가스의 꾸준한 흐름으로 조심스럽게 건조시킵니다. 드레싱 조직 겸자로 단백질 코팅된 스탬프를 잡고 건조된 하이드로겔 표면과 접촉하는 구조화된 표면을 놓습니다.

PDMS 스탬프 상단의 핀셋 끝으로 간단한 압력 지점을 적용하여 스탬프 마이크로 기능과 하이드로겔 표면 사이의 양호한 접촉을 보장하고 1시간 후 실온에서 1시간 동안 하이드로겔 표면에 PDMS 스탬프를 그대로 둡니다. 드레싱 조직 집게로 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔에서 PDMS 스탬프를 부드럽게 제거하고 에탄올 수용액에서 15분 동안 간음하여 스탬프를 청소합니다. 스탬핑된 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 멸균 상태에서 10분 동안 멸균 상태에서 PBS를 3회 교환하여 광범위하게 세척합니다.

마지막 PBS 세척 후 BSA의 멸균 용액을 추가하고 흔들판에서 부드럽게 교반하여 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 이것은 다음 날 인쇄되지 않는 영역을 먹게 될 것입니다. 스탬핑된 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 멸균 상태에서 10분 동안 멸균 상태에서 PBS를 3회 교환하여 광범위하게 세척합니다.

스탬프가 찍힌 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔은 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 결과는 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔의 강성 변화와 비스 아크릴아미드 가교제의 양 사이의 선형 상관관계를 보여주며, 세 가지 다른 강성의 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔에 증착된 라미네이트 직사각형 마이크로 패턴의 에피 형광 이미지는 마이크로패턴 기하학 및 매트릭스 강성의 독립적인 조정을 보여줍니다. 세포 리간드 밀도는 PDMS 스탬프를 배양하는 데 사용되는 단백질 용액의 농도를 변화시켜 조절할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 순차적 마이크로 접촉 인쇄에서 가져온 두 개의 형광 이미지입니다. 빨간색의 피브로넥틴과 녹색의 라미닌 줄무늬는 90도에서 교차하고 피브린 라미닌과 콜라겐 줄무늬는 25kg 파스칼 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔 기판에 순차적으로 마이크로 인쇄되었습니다. 균일하게 코팅된 마이크로 패턴의 하이드록시 폴리아크릴아미드 하이드로겔 표면에 일차 세포를 도금한 경우, 도금 후 최대 3일까지 세포 생존율이 80% 이상이었습니다.

또한 세포가 부드러운 기질에 비해 뻣뻣한 기질에서 더 많이 증식하는 것이 관찰되었습니다. 직사각형 피브로넥틴 코팅된 마이크로 패턴에 도금할 때 세 가지 다른 강성의 하이드록시 폴리 아크릴아미드 하이드로겔에 증착됩니다. 1차 내피 세포는 낮은 액틴 섬유 밀도와 연질에 둥근 핵을 나타냅니다.

더 단단한 기질의 기질, 액틴 섬유는 더 곧고 두꺼우며 핵은 발달 후 변형됩니다. 이 기술은 기계적 형질전환 분야의 연구자가 1차 또는 줄기 세포, 조직 수준, 모델 유기체, 패션, 인구 통계 또는 장기 시스템과 같은 광범위한 세포 시스템에서 세포 미세환경 매개변수의 개별 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.