Name: 피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 배우세요 피부 샘플에서 타입 I 콜라겐을 3시간 이내에 신속하게 분리하는 개선된 방법을. 이 기술은 기존 10일 소요 방식을 대체하여 생화학 및 세포생물학 연구에 효율성을 제공합니다.

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이 작품은 국립 보건원 (DBC에 HL068915), (CAP로) 채찍질 연구 기금에서 새 연구원 수상에서 연구 보조금, 보조금의 에이드 (DBC에 12GRNT11910008) 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서보기에 의해 지원되었다 , 어린이 심장 재단 (DBC에), 그리고 보스턴 아동 병원 심장 전도 기금, 라이언 가족 성기 사이즈, 그리고 데이빗 풀먼에 의해 기부에서 연구 보조금.

여기에서 우리는 어린 양의 피부에서 COL1의 분리를 보여줍니다. 서면으로,이 프로토콜은 또한 성공적으로 토끼와 인간의 피부로부터 COL1를 분리하는데 사용될 수있다. 1. 피부 샘플을 준비 <ol><li> 사용하기 전에 4 ° C에 모든 시약을 평형. </li><li> 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O의 피부 샘플 (25~50g)을 씻어 제모 크림 어떤 울, 모피, 또는 머리를 제거합니다. </li><li> 결합 조직과 지방의 샘플 깨끗하게 긁어 단일 에지 면도날을 사용합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O.에서 샘플을 씻어 </li><li> 단일 에지 면도날 1cm X 1cm 조각으로 피부 샘플을 조각. </li></ol> 2. Noncollagenous 가용화 물질을 제거 <ol><li> 샘플 50 ㎖ 당 원뿔 튜브의 5g을 달아 얼음처럼 차가운 0.5 M 아세트산 나트륨 30 ㎖를 추가합니다. </li><li> 벤치 탑 균질의 50 ML 튜브 어댑터를 사용하여 6m / 초 설정으로 1 분 동안 튜브를 섞는다. </li><li> SUP 폐기7 아세트산 나트륨 세척주기의 총 ernatant를 반복합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O에서 샘플을 씻어 잔류 아세트산 나트륨을 제거하기 위해 한 번 섞는다. </li><li> 물기를 제거하고 신선한 50 ML 원뿔 튜브로 전송 튜브의 측면에 대한 샘플을 압축하기 위해 주걱을 사용합니다. </li></ol> 3. I 콜라겐 추출을 입력 <ol><li> 샘플을 압축하고 각 세척 후 상층 액을 버리고 벤치 탑 균질 6 M / 초에서 1 분에 대한 ㎖ / g의 2 배의 샘플을 씻어 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액. </li><li> 샘플에 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액의 새로운 2 ㎖ / g 나누어지는을 추가합니다. </li><li> 각주기 사이의 버퍼를 제거하지 않고 6 연속 1 분, 교반 6m / 초 벤치 탑 균질 혼합주기를 수행합니다. </li><li> 포집 관에 두꺼운, 상등액을 전송합니다. </li><li> 샘플 ㎖ / g (1 건) 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액을 추가하고 마지막으로 벤치 탑 균질화 AGITA을 수행기의 순환. </li><li> 포집 관이 최종 뜨는을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 3,200 XG에서 포집 관을 원심 분리기 </li><li> 100,000 분자량의 톱 수 납부에 뜨는을 전송 원심 필터 장치를 잘라. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 3,200 XG에 원심 분리기 </li><li> 4 ° C에서 깨끗한 원뿔 관 및 저장에 상부 구획으로부터 정제 된 COL1 이동 </li></ol>

<ol><li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag%C3%A8ne+dissous+dans+un+acide+dilu%C3%A9%5BTitle%5D)+AND+%22CR+hebd.+s%C3%A9ances+Acad.+Sei%22%5BJournal%5D)">Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué.</a> CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

이 방법의 중요한 구성 요소는 물기를 제거하는 피부 샘플의 반복 효율적인 압축입니다. 이 샘플을 압축하여 단계 2.5에 극력 아세트산 나트륨을 제거하는 것이 중요하다. 우리는 튜브의 측면에 대해 피부를 압축 주걱을 사용하지만, 무명천도 사용될 수, 이것은 튜브에서 샘플의 제거를 필요로하고이 단계를 수행하는 데 필요한 시간을 증가시킬 것이지만. 마찬가지로, 시트르산 나트륨의 양이 후속 추출 단계에서 정확하도록 단계 3.1에서 샘플을 압축하는 것이 중요하다. 적절하게 다음 단계 중 하나의 샘플에서 액체를 제거하지 않으면 최종 COL1 수율에 해로운 영향을 미칠 것입니다. 이 프로토콜에 대한 또 다른 주요 구성 요소는 4 ℃에서 모든 시약을 유지하는 것입니다 이 산 가용화 COL1의 효율적인 추출을 보장하고 콜라겐의 응고를 방지 할 수 있습니다. 게다가, 프로 시저 모두를 사용하여 수행 될 수있다무균 환경에서 멸균 시약. 이것은 인간에 사용하기 위해 COL1을 분리하는이 방법을 사용하고자하는 사람들을 위해 특히 중요하다. COL1의...

수십 년 동안, 연구자 및 상업 벤더 사용할 수 있습니다 조직 COL1 원 섬유의 매트릭스의 재 부유 결과 중화 다음에 간단한 산 추출 프로토콜의 일부 변화를 이용하여 피부와 힘줄 등의 조직 소스의 구색에서 용해 COL1을 격리했다 생물 의학 응용 프로그램 1-4의 다수를위한. COL1에 대한 임상 응용의 많은 사례가 있지만이 단백질의 준비 5-7을 수행하는 일 또는 주를 복용 긴 추출을 필요로하기 때문에, 이들 중 몇몇은 autologously 파생 COL1를 사용합니다. 그 결과, 연구 조사와 의사는 일반적으로 쥐, 소 또는 돼지의 진피와 같은 인간이 아닌 조직을 사용하거나 시체에서 제거 스킨을 사용하거나 남성 할례에 따라 제조하는 COL1의 비용, 상업 준비를 사용합니다. 재생 응용 프로그램의 경우, 자신의 능력에 대한 이러한 제품의 전시 변화의 대부분은 고체 형성매트릭스 또는 세포 부착 및 성장을 지원할 수있는 조직 구조. 따라서, 신속하게 접근 할 수 있고 충분한자가 조직 소스에서 COL1를 추출하기 위해 디자인 된 새로운 표준화 된 방법에 대한 구별이 필요하다. 이러한 방법은 COL1은 또한 동물 모델에서 추출 콜라겐 계 지지체에 조립 설계 조직의 전임상 시험에 사용될 수 연구 설정에 시간과 비용을 절약한다. 동시에, 병원에서 급속 절연 autologously 유래 COL1를 사용하는 옵션을 갖는, 그렇지 않으면 동종 또는 이종 제제를받을 환자의 전체적인 안정성을 증가시킬 것이다. autogeneic 제제를 투여받은 환자의 경우,이 간소화 된 방법은 크게 생검 수집 및 콜라겐 애플리케이션 간의 간격을 줄일 것이다. 이러한 이유로, 우리는 고속 AG를 사용하여 노포 COL1 분리 및 정제 방법을 개선하고자itation 및 크기 배제 원심 분리. 이 방법은 많은 실험실에서 발견 된 표준 버퍼 및 장비를 사용하여 수행하는 것이 간단합니다. 고속 교반을 사용함으로써, 우리는 프로토콜 미만 3 시간 (8)에 대략 10 일 ~ 용해, 경피 COL1을 분리하는 데 필요한 시간을 감소시킨다. 중요한 것은,이 방법은 쉽게 절차의 단일 세트 동안 환자에 사용 autologously 유래 COL1을 준비하기 위해 임상 환경에서 수행 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>FastPrep-24 System</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman</td><td>J6-MI</td><td>스윙 버킷 로터는 3,200 x g의 50ml 코니컬 튜브를 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

피부에서 타입 i 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

용해 1 형 콜라겐 (COL1)는 세포 배양을위한 접착제 기판으로 회생 응용 프로그램을위한 세포 지지체로 광범위하게 사용됩니다. 임상 적으로,이 단백질 널리 성형 수술, 피부 주사, 골 이식 및 재건 수술에 사용됩니다. 이러한 절차에 대한 COL1의 소스는 염증과 거부에 대한 가능성뿐만 아니라 생체 이물 질병의 전송을 증가하는, 일반적으로 인간이 아닌 있습니다. 이러한 관점에서, 효율적이고 신속 autologously 유래 조직의 한정된 양에서 COL1을 정화하는 방법은 많은 문제점을 회피 할하지만, 표준 격리 프로토콜 긴이며 종종 콜라겐 조직의 대량을 요구한다. 여기서, 우리는 이하의 3 시간에 약 10 일에서이 단백질을 분리 및 정제하는 데 필요한 시간을 줄여 효율적인 COL1 추출 방법을 설명한다. 우리는 많은 수술 과정 중에 있기 때문에 가능 여부에 대한 우리의 조직​​ 소스로 진피를 선택했다. 티그의 방법은 진피의 적은 양의 고순도, 수용성 COL1을 얻기 위해 강력한 교반 및 원심 여과와 함께 기존의 추출 버퍼를 사용합니다. 간단히, 피부 조직 검사는 지방, 결합 조직, 그리고 머리를 제거한 후 얼음처럼 차가운 dH보다 2 O 철저히 세척. 피부 샘플은 0.5 M 아세트산 나트륨 및 고속 벤치 탑 균질화기를 사용하여 단백질 및 다당류 noncollagenous 스트리핑된다. 잔류 고형물로부터 콜라겐이어서 균질화기를 사용하여 0.075 M 시트르산 나트륨 완충액으로 추출 하였다. 이 추출물을 비교하거나 우수한 상용 제품에 대한 품질이나 기존의 프로 시저를 사용하여 얻은 결과의 COL1 준비를 얻을 수 100,000 MW 컷 - 오프 원심 필터를 사용하여 정제된다. 우리는이 방법은 연구와 임상 응용 프로그램의 다수에 대한 autologously 파생 COL1의 활용을 용이하게 기대하고 있습니다.

이 COL1 격리 프로토콜은 완료하는 데 약 2 시간 15 분을 필요로한다. 그림 1은이 절차의 주요 단계를 요약 한 개략도를 보여줍니다. 샘플 준비 및 고속 동요의 12 사이클을 수행하고 아세트산 나트륨 헹굼은 약 35 분 (도 1a-C)가 소요된다. 한 교반을 수행하고 dH보다 2 O와주기를 씻어은 약 5 분 (그림 1D 및 1E)가 소요된다. 구연산 나트륨을 추가 한 교반에 샘플을 쓰는 교반의 6 회 반복주기가 약 45 분 (그림 1 층 및 1G)가 소요 씻어. 액체 추출물에서 남아있는 고형물을 원심 분리하면 15 분 (그림 1H)가 소요된다. 최종적으로, 필터 장치에 샘플을 전송하고, 정제, 가용화 COL1 농축 작은 단백질을 제거하는 또 다른 원심 분리 단계를 수행하는 단계30 분 소요됩니다 (그림 1I<...

수용성 제 1 형 콜라겐 (COL1)의 분리에 대한 기존의 절차 때문에 긴 버퍼 배양 및 섬유의 힘든 resuspensions의 처음부터 끝까지 약 10 일이 필요합니다. 여기, 우리는보다 3 시간에 작은 피부 생검에서 COL1을 정화 할 수있는 방법을 설명합니다.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

이 절차의 전반적인 목표는 피부 샘플에서 1형 콜라겐을 신속하게 분리하는 것입니다. 이는 먼저 피부 샘플을 작은 조각으로 절단함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 피부 샘플을 아세트산 나트륨 내에서 빠르게 교반하여 콜라겐이 아닌 가용성 단백질과 다당류를 제거합니다.다음으로, 아세트산 나트륨의 모든 흔적을 제거하기 위해 시료를 물로 헹굽니다. 마지막 단계에서는, 시료에 남아 있는 모든 고형물을 제거하기 위해 시트르산 완충액 원심분리를 사용하여 진피 시료로부터 1형 콜라겐을 추출하고, 이후 일회용 원심분리 장치를 사용하여 여과함으로써 최종 생성물을 농축합니다. 최종적으로, 이 농축물로부터 1형 콜라겐을 추가로 중합시킬 수 있습니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 콜라겐 분리 시간을 단축한다는 것입니다. 진피 샘플에서 제1형 콜라겐을 분리하는 시간을 1주일 이상에서 3시간 미만으로 줄였습니다. 먼저 25~50 g의 진피 샘플을 얼음처럼 차가운 증류수로 헹군 다음, 제모 크림을 사용하여 양모, 털 또는 모발을 제거하십시오.다음으로, 단면 면도날을 사용하여 샘플에서 결합 조직과 지방을 긁어내어 제거하고, 샘플을 매우 차가운 증류수로 다시 헹굽니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 피부 샘플을 1x1 cm 크기로 자릅니다. 비콜라겐성 가용성 물질을 제거하기 위해, 먼저 50 mL 원심분리관당 5 g의 샘플을 정밀하게 측정하여 넣고, 각 샘플에 0.5 M의 매우 차가운 아세트산 나트륨 30 mL를 첨가합니다.그 다음 50 milliliter 튜브 어댑터를 사용하여 벤치탑 호모게나이저의 6 meters per second 설정에서 튜브를 혼합합니다. 1분 후, 상층액을 버리고 얼음처럼 차가운 sodium acetate를 추가하여 샘플을 다시 혼합하며, 총 7회의 세척 사이클을 수행합니다. 마지막 세척 후, 샘플을 얼음처럼 차가운 증류수로 헹구고 샘플을 다시 한 번 혼합하여 잔류 sodium acetate를 제거합니다.그다음 스패튤라를 사용하여 각 튜브의 벽면으로 샘플을 압축해 과잉 액체를 제거하고, 콜라겐을 추출하기 위해 각 샘플을 새로운 개별 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 이어서 벤치탑 균질기에서 6 meters per second의 속도로 1분간, 그램당 2 milliliters의 0.075 molar sodium citrate 완충액으로 샘플을 2회 세척하며, 각 세척 후에는 방금 시연한

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

방법은 콜라겐 유형 I 및 기본 인간 섬유 아세포로 구성된 3 차원 매트릭스의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 이 조직 기질의 기본 기능을 모방하고 현미경의 여러 형태의 의무이기 때문 organotypic 젤은 침입 세포 마이그레이션을 평가하는 유용한 기판 역할을합니다.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

미세유체 소자 내에서 기능적 미세조직을 생성하려면 미세장치의 제한된 공간 차원에 전통적인 세포 배양 기술을 적용하여 세포 표현형을 안정화해야 합니다. 콜라겐의 변형은 간세포와 같은 일차 세포를 미세유체 조직 모델로 안정화할 수 있는 초박형 콜라겐 어셈블리의 층별 증착을 가능하게 합니다.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

여기, 우리는 두 가지 다른 형태의 문화 기판의 준비에 대 한 프로토콜 제시 활용 유형 I 교원 질. 콜라겐, 처리 하는 방법을 따라 콜라겐 분자 2 차원, 비-섬유 형태를 유지 하거나 3 차원, fibril 형태로 재조립 합니다. 세포 증식에 유형 I 교원 질 크게 fibril 형성에 의해 영향을.

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

이 프로토콜의 목표는 장기 문화를 위한 접근가능하고 간단한 기술을 사용하여 혈관화된 인간 피부 등가물의 생성 및 체적 분석을 설명하는 것입니다. 가능한 한, 단계에 대한 근거는 연구원이 연구 요구에 따라 사용자 정의 할 수있는 능력을 허용하기 위해 설명된다.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

여기에서는 세포 배양 실험실에서 일상적인 연구를 위해 다양한 3D 피부 모델을 소개하는 저렴하고 간단한 절차를 제시합니다. 연구원은 상업적으로 이용 가능한 모델에 의존하지 않고 필요에 맞는 모델을 만들 수 있습니다.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

배우세요 피부 샘플에서 타입 I 콜라겐을 3시간 이내에 신속하게 분리하는 개선된 방법을. 이 기술은 기존 10일 소요 방식을 대체하여 생화학 및 세포생물학 연구에 효율성을 제공합니다.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

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