이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

이 절차에서는 마우스 망막 조직을 사용하여 구조적 무결성을 유지하기 위해 섬세한 신경 조직을 안정화하는 방법을 시연합니다. 면역 조직 화학 염색의 여러 단계 동안, 먼저 안구를 적출하고 각막을 제거한 후 공막에서 망막을 분리하십시오. 망막 컵(eye cup)에 절개를 넣어 조직을 평평하게 펴십시오.

그 다음, 조직의 무결성을 유지하기 위해 직접적인 조작 없이 흡입 전이(suction transfer) 방식을 이용하여 망막을 링 보강 막에 부착합니다. 이제 염색을 위해 링을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 연구 결과, 이 기술은 살아있는 조직에 효과적으로 적용될 수 있으며, 기존의 망막 박리 처리 방법들과 비교하여 시냅스 단백질 이미징을 위한 우수한 기질을 제공하는 것으로 나타났습니다.

이러한 기술을 통해 물리적 조작을 최소화하면서 섬세한 조직을 옮길 수 있습니다. 이를 통해 변형 및 손상 가능성을 줄일 수 있습니다. 우리는 망막 변성 모델인 RD one 마우스의 평면 장착 조직(flat mounted tissue)에서 기록이 필요했을 때 처음으로 이 아이디어를 얻었으며, 이 마우스의 망막은 변이로 인한 광범위한 세포 손실로 인해 매우 얇고 취약합니다.

저희 실험실의 박사후 연구원이 저와 함께 절차 시연을 진행하겠습니다. 먼저, 마취된 마우스의 안구를 적출하여 산소가 공급된 HEPES buffered ringer solution으로 옮깁니다. 각막을 제거하려면 핀셋으로 각막연(limbus) 부위의 안구를 잡고, 전톱니모양선(ora serrata)을 따라 원형으로 절개합니다.

볼루스 주입 및 전기생리학적 기록을 위해 핀셋으로 수정체를 꺼냅니다. 블렌디드 엣지 핀셋을 사용하여 유리체를 최대한 제거하십시오. 이제 핀셋으로 공막을 단단히 잡아 안구 컵을 고정합니다.

두 번째 포셉을 망막과 아이 컵(eye cup) 사이에 배치합니다. 포셉을 원주 방향을 따라 천천히 이동시킵니다. 망막과 아이 컵 사이의 시신경을 절단하고, 가위로 아이 컵을 제거합니다.

망막 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 또는 망막 전체를 사용하려면, 홀더의 길이를 줄이기 위해 주변부에서 시신경 중간 지점까지 절개합니다. 과도한 부분은 선반을 사용하여 제거합니다.

그다음 고운 사포로 거친 표면을 연마하십시오. 링 아래쪽에서 받침대를 제거하십시오. 플라스틱 피펫의 좁은 끝부분을 잘라내십시오.

그런 다음 조직을 일부 용액과 함께 막으로 옮깁니다. 망막을 펼치면서 용액을 점진적으로 제거하고 조직을 폅니다. 이제 신경절 세포가 위를 향하도록 하여 망막을 막에 부착합니다.

1 mL 주사기의 홀딩 팁을 잘라내고 조직 바로 아래에 배치합니다. 플런저를 약 0.3 mL 부피까지 당겨 조직이 막 내에 물리적으로 얽히게 합니다. 약 1 MΩ의 저항을 사용하여 붕규산 유리 모세관 피펫을 뽑아냅니다.

그런 다음 각 패치 피펫의 끝부분을 조심스럽게 부러뜨립니다. 이어서, 10 µL의 HEPS 완충 링거 용액에 selectin stock 염색액 0.3 µL를 추가합니다. 이제 따뜻하게 가온되고 산소가 공급된 HEPS 완충 링거 용액이 흐르는 기록 챔버에 막을 넣습니다.

마이크로 조작기를 사용하여 염색약이 담긴 피펫을 내경계막에 밀착시킵니다. 피펫을 더 전진시켜 내경계막을 관통합니다. 그다음, 단일 또는 다수의 표적 위치에 염색액을 주입합니다.

이제 에피 형광 조명(epi fluorescence illumination) 하에서 관찰하며, 조직이 주입 상태에서 회복될 수 있도록 10분 동안 기다립니다. 필요한 경우, 인서트를 유리 바닥 배양 접시에 망막 면이 아래로 향하게 하여 옮깁니다. 시료의 습윤 상태를 유지하기 위해 HEP solution 한 방울을 추가합니다.

또한, 플라스틱 링의 둘레를 따라 진공 그리스를 세 군데에 도포하여 인서트를 배양 접시에 단단히 고정합니다. 고정 후 접시를 현미경 스테이지로 옮기고, 막을 sucrose 기울기 용액에 담급니다. 플라스틱 인서트 링에서 막을 절제하여 분리합니다.

Kim wipes를 사용하여 용액을 최대한 제거한 후, 망막이 위를 향하도록 파라필름 위에 놓습니다. 조직이 놓인 파라필름을 크라이오스탯 챔버로 옮기고 OCT 배지를 한 방울 첨가합니다. 급속 냉각 장치를 사용하여 동결 속도를 높입니다.

냉동 시료를 떼어내어 뒤집습니다. 그다지 불필요한 냉동 OCT를 잘라냅니다. 시료 주변의 세 면은 약 2 mm 정도 남기고, 홀더에 부착될 면은 밀리미터 단위로 남겨둡니다.

부착된 부위를 제외하고 노출된 망막 쪽에 OCT 한 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다. 망막 조직이 포함된 막을 동결시킵니다. 차가운 홀더 링 위에 OCT 한 방울을 떨어뜨립니다.

냉동 시료를 즉시 드롭(drop)에 삽입하십시오. -19 °C에서 10 내지 20 µm 두께로 절편을 만든 후, 이를 가온된 폴리리신(polylysine) 접착 슬라이드 위에 배치하십시오. 절편이 부착된 슬라이드를 41 °C 가열 플랫폼 위에 올려놓고 암소에서 2~3분 동안 유지하십시오.

그런 다음 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 이 실험은 망막 혈관계를 여러 망막 층에 걸쳐 뻗어 있는 정교한 혈관 네트워크로 빠르고 간단하게 특성화하는 방법을 보여줍니다. iso selectin의 볼러스 투여와 sulfa rumine 침지 라벨링을 결합함으로써, 살아있는 조직을 망막에서 거의 즉시 시각화 및 스캔할 수 있으며, 표층부터 심층까지의 혈관을 라벨링할 수 있습니다.

상대적으로 확산이 잘 되는 SRH와 달리, 셀렉틴(selectin)은 내경계막을 잘 통과하지 못합니다. 시냅스 단백질을 라벨링할 때, 예를 들어 짧은 시간 동안 카르비미드(carbimide)로 고정한 후 시냅스 마커인 PSD 95에 대해 면역형광 염색을 수행하면, 기존의 파라포름알데히드 고정 방식보다 여러 가지 장점이 있습니다. IPL 내의 PSD 95는 개별 시냅스를 구별할 수 있는 밝은 점상 외관을 나타냈습니다.

이와 대조적으로, 일반적인 파라포름알데히드 고정액을 사용했을 때는 시냅스 구성 요소의 식별이 덜 명확합니다. 망막 저온절편에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 이 막에 섬세한 조직을 마운팅하는 방법과 준비된 시료에 세포화학적 염색을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

망막을 필터에 부착하는 데 15분이 소요됩니다.