Name: 이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 쥐 망막 조직을 이용한 전체 마운트 준비 및 면역조직화학 염색법으로 시냅스 단백질 이미징을 위한 구조적 무결성을 보존하는 신경과학 연구 기법을 탐색하세요.

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이 연구는 NIH 보조금 R01-EY020535(B.T.S), 국제 망막 연구 재단 및 칼 키르히게스너 재단(B.T.S)의 지원을 받았습니다.

모든 실험 절차에서 동물은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 규정에 따라 Weill Cornell Medical College에서 승인한 프로토콜에 따라 치료되었습니다. 동물들은 이산화탄소와 그에 따른 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었다.
1. 전체산 망막 해부
<ol>
	<li>쥐를 안락사시킨 후, 눈을 적출하여 산소가 공급된 HEPES 완충 링거 용액에 넣습니다(표 1).</li>
	<li>작은 가위로 ora serrata를 따라 원형을 그리며 자르고 집게로 가장자리에서 눈을 잡아 각막을 제거합니다. 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다.</li>
	<li>뭉툭한 모서리 집게를 사용하여 가능한 한 많은 유리체를 제거하십시오. 이 단계는 볼루스 주사 및 전기생리학적 기록에 중요합니다. 면역조직화학을 단독으로 수행하는 경우에는 필요하지 않습니다.</li>
	<li>망막과 아이컵 사이에 집게를 배치하여 아이컵에서 망막을 분리하고 집게를 둘레를 따라 천천히 움직입니다. 두 번째 집게 세트로 공막을 단단히 잡아 아이컵을 고정합니다. 망막과 아이컵 사이의 시신경을 잘라 아이컵에서 망막이 쉽게 분리</li>되는 것을 용이하게 합니다.
	<li>망막은 조각(예: 4등분)으로 해부하거나 전체적으로 사용할 수 있습니다. 조각으로 자르려면 가위를 사용하여 망막 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 또는 망막 전체를 사용하려면 주변부에서 시신경의 중간까지 절개합니다. 절개 부위는 평평하게 준비하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>
2. 친수성 PTFE 멤브레인 인서트에 장착
<ol>
	<li>아래 설명된 대로 멤브레인을 준비합니다. 생리학적 기록 또는 염료 주입 실험을 수행할 때 선반이나 핸드쏘를 사용하여 홀더의 높이를 줄여 나머지 링의 높이가 1mm가 되도록 합니다. 
	참고: 배양 플레이트 인서트는 수정되지 않았거나 수정되었을 수 있습니다(그림 1A). 구성의 선택은 실험의 목적에 따라 결정됩니다. 면역 염색의 경우 변형되지 않은 인서트가 적합합니다.</li>
	<li>미세한(300방 이상) 사포로 거친 표면을 연마합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 가위로 링 아래의 발을 제거합니다.</li>
	<li>이물질을 제거하려면 멤브레인을 증류수에 2-3분 동안 헹구거나 초음파 처리합니다.</li>
	<li>조직을 멤브레인에 장착합니다(그림 1A). 플라스틱 이송 피펫으로 멤브레인 위에 용액이 든 조직을 놓습니다. 필요한 경우 피펫의 좁은 끝을 잘라 조직 샘플이 이송 중에 피펫에 부착되지 않도록 합니다.</li>
	<li>신경절 세포(GC)가 위로 향하게 망막을 부착합니다: 막에서 망막을 펼치고 집게로 주름을 펴면서 용액을 서서히 제거합니다.</li>
	<li>막의 반대쪽에 빈 주사기(1ml)를 조직 바로 아래에 놓습니다. 플런저를 0.2-0.3ml의 부피로 당겨 흡입을 적용합니다. 사용하기 전에 주사기의 고정 팁을 절단하여 흡입 표면적을 늘리십시오. 조직은 물리적으로 막 내에 얽혀 있기 때문에 접착을 위한 추가 처리가 필요하지 않습니다.</li>
</ol>
3. Isolectin Alexa 488의 볼루스 주사
<ol>
	<li>패치 피펫과 염색 용액을 준비합니다. Flaming/Brown 풀러를 사용하여 붕규산 모세관 유리에서 ~1MΩ의 저항으로 패치 피펫을 당깁니다. 피펫의 끝을 부드럽게 부러뜨립니다.</li>
	<li>1.2단계에서 설명한 10μl의 HEPES 완충 링거 용액에 0.3μl의 isolectin Alexa 488 원액을 첨가하여 염색 용액을 만듭니다.</li>
	<li>주입을 위해 샘플을 patch-clamp 설정으로 옮깁니다(그림 1C). 조직이 부착된 멤브레인을 가열된(37°C) 및 산소화된 HEPES 완충 Ringer's 용액으로 관류된 기록 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>염료가 포함된 피펫을 내부 제한 멤브레인(ILM, 그림 2A)에 대고 놓습니다. micromanipulator를 사용하여 ILM을 관통할 때까지 피펫을 ILM에 대해 더 전진시킵니다. 피코스프리처를 사용하여 10-20psi의 압력으로 염색 용액을 1초 동안 주입합니다. 단일 또는 여러 위치가 주입 대상이 될 수 있습니다(그림 2B). 피코스프리처를 사용할 수 없는 경우 10ml 주사기를 사용하여 주입을 위한 양압을 전달할 수 있습니다.</li>
	<li>주입된 조직을 10분 동안 배양합니다. 배양 중에 주입된 조직은 상피 형광 조명 아래에서 볼 수 있습니다.</li>
	<li>라벨링 후, 제제는 이미징을 위해 현미경으로 가져갈 수 있습니다. 삽입물을 유리 바닥 배양 접시로 옮기고 망막 면이 아래로 향하게 놓습니다(그림 1C).</li>
	<li>표본을 촉촉하게 유지하기 위해 HEPES 용액 한 방울을 첨가하십시오.</li>
	<li>플라스틱 링의 둘레에 진공 그리스 2-3점을 놓아 인서트를 배양 접시 바닥에 단단히 고정합니다.</li>
	<li>접시를 현미경 스테이지로 옮깁니다.</li>
</ol>
4. 파라포름알데히드 및 카르보디이미드 고정
<ol>
	<li>삽입물을 정착액에 15분 동안 옮겨 샘플을 고정합니다. 용도에 따라 더 길거나 더 짧은 고정 시간이 사용될 수 있습니다. 두 고정제 모두 GFP, 이소렉틴 또는 형광 Alexa 히드라지드를 고정하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다(예: 패치 클램프 기록에서 세포를 채우는 데 사용). 
	참고: 고정을 위해 4% 카르보디이미드 또는 4% 파라포름알데히드 용액을 사용할 수 있습니다. 순응도를 유지하려면 조직이 이미 멤브레인에 부착된 후에 고정을 수행해야 합니다. 조직은 장착 직후 또는 생리학적 기록 및/또는 볼루스 주입 후에 고정할 수 있습니다.</li>
	<li>조직을 인산염 완충액(PB)으로 30분 동안 헹굽니다. 그 후, 조직을 전체산(5단계)으로 가공하거나 수직 절편으로 절단한 후 가공할 수 있습니다(6단계 및 7단계).</li>
</ol>
5. 망막 전체산의 면역염색
<ol>
	<li>24웰 접시(그림 1D)에서 염색 용액으로 멤브레인의 망막 조각을 1시간 동안 차단합니다.</li>
	<li>염색액에 mouse anti-PSD-95 1차 항체를 1:300으로 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 48시간 동안 적용합니다. 조직과 함께 각 웰에 ~100-150μl 항체 용액을 추가합니다. 건조를 방지하려면 사용하지 않는 우물에 증류수를 채우십시오.</li>
	<li>PB로 20분, 3회 헹굽니다.</li>
	<li>염색 용액에 1:500 분으로 용해된 당나귀 안티 마우스 Alexa 568 2차 항체에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PB로 20분, 3회 헹굽니다.</li>
	<li>염색된 조직이 있는 삽입물을 PB 용액으로 채워진 표준 3cm 페트리 접시에 넣습니다. 작은 가위로 고리에서 망막을 포함하는 막 부분을 잘라냅니다.</li>
	<li>막의 망막을 위로 슬라이드하여 망막으로 옮깁니다. PB를 제거하고 장착 매체를 추가합니다. 망막이 광범위하게 조여지거나 손상되는 것을 방지하기 위해 슬라이드와 커버슬립 유리 사이에 깨진 커버 슬립 유리의 작은 조각을 놓으십시오. 커버슬립을 놓습니다.</li>
	<li>매니큐어로 커버슬립을 제자리에 밀봉합니다. 슬라이드를 어두운 곳, 냉장고에 보관하십시오.</li>
</ol>
6. 멤브레인 장착 조직의 수직 절편
<ol>
	<li>고정 후 멤브레인의 조직을 10%, 20% 및 30% 자당 구배 용액에 각각 30분, 1시간, 하룻밤 동안 담그십시오. 하룻밤 단계는 냉장고에서 4°C에서 수행되고 다른 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 플라스틱 삽입 링에서 조직이 있는 멤브레인을 제거합니다.</li>
	<li>절단된 멤브레인을 망막이 위로 향하게 하여 파라필름에 놓고 Kimwipes로 가능한 한 많은 용액을 제거합니다.</li>
	<li>조직이 있는 파라필름을 저온 유지 챔버에 넣고 OCT 배지 한 방울을 추가합니다. 급속 냉동고 장치를 사용하여 동결을 가속화하십시오.</li>
	<li>얼어붙은 샘플을 분리하고 뒤집습니다.</li>
	<li>여분의 냉동 OCT를 자릅니다.샘플 주위 3면에 약 2mm를 남겨두고 홀더에 부착할 면에서 5-6mm를 남겨둡니다.</li>
	<li>노출된 망막 쪽(멤브레인 쪽)을 OCT 한 방울로 덮습니다. 부착 영역을 비워 둡니다.</li>
	<li>망막 조직으로 막을 동결합니다. 이제 샘플을 절단 홀더에 놓을 준비가 되었습니다.</li>
	<li>콜드 홀더 링에 OCT 한 방울을 떨어뜨립니다. 즉시 얼어붙은 샘플을 드롭에 삽입하십시오.</li>
	<li>절편을 10-20μm 두께로 절단하고 저온 유지 온도를 -19°C로 설정합니다.따뜻한(실온) 폴리신 접착 슬라이드를 사용합니다. 섹션이 부착된 슬라이드를 어두운 곳에서 ~2-3분(41°C) 동안 가열 플랫폼에 그대로 두어 섹션의 견고한 접착을 보장합니다.</li>
	<li>슬라이드를 보관 상자에 넣고 사용할 때까지 -20 °C를 유지하십시오.</li>
</ol>
7. 망막 부분의 면역 염색
<ol>
	<li>섹션이 있는 슬라이드를 냉동실에서 꺼냅니다. 응축수를 제거하기 위해 1분 동안 실온에 두십시오.</li>
	<li>액체 차단제로 섹션을 둘러싸서 추가 배양을 위한 장벽을 만듭니다.</li>
	<li>슬라이드를 배양 상자에 넣습니다. 항체 용액의 증발을 방지하기 위해 상자 바닥을 물로 덮으십시오.</li>
	<li>PB로 5분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>동일한 염색 용액을 준비하고 5단계와 같은 단계를 따릅니다. 1차 항체를 사용한 배양은 하룻밤 동안, 2차 항체는 1시간 동안 배양합니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 깨진 유리를 사용하지 마십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

친수성 PTFE 멤브레인의 높은 생체 적합성과 용액의 투명성은 살아있는 조직으로 작업할 때 유리합니다. 이 준비는 빛 반응8-10의 패치 클램프 기록을 위한 이전 작업에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에서는 이 접근법이 전체 망막의 구조 분석에 어떻게 채택될 수 있는지 보여줍니다.
볼루스 로딩 기술은 살아있는 조직을 라벨링하는 데 효과적으로 사용될 수 있습니다. 이 기술은 멤브레인 인서트의 구조적 지지에 의해 도움이 됩니다. 응용 분야에는 칼슘 지시약(9)의 로딩, 형광 마커(11) 또는 표지된 리간드(12)로 조직을 염색하는 것이 포함됩니다.
고정 조직 처리는 지지 멤브레인을 사용하면 이점을 얻을 수도 있습니다. 시냅스 후 밀도 단백질의 모양의 차이는 고정 시간과 고정제의 특성에 따라 다릅니다5. 고정 시간이 길수록 조직 보존은 ...

섬세하고 손상되지 않은 조직에 면역조직화학을 수행하면 취급 및 이식 중에 손상될 위험이 있습니다. 이것은 뇌 절편이나 퇴행성 망막과 같은 다른 얇은 조직에서 발생할 수 있습니다. 또한 신경 세포의 면역 염색에 유리할 수 있지만 구조적 안정성이 손상되어 사용을 방해할 수 있는 특정 조직 고정 방법이 있습니다. 이에 대한 특별한 예로는 카르보디이미드 기반 고정이 있는데, 이는 수용체와 호르몬1-7을 염색하는 데 우수하지만 고정 조직의 불안정성으로 인해 일반적으로 피합니다.
여기에서는 친수성 PTFE 멤브레인을 사용하여 다양한 염색 기술을 위해 고정 또는 고정되지 않은 섬세한 조직을 구조적으로 지지하는 절차를 설명합니다. 지지 멤브레인은 고정 전후에 섬세한 조직을 조작할 수 있어 조직 손상의 위험을 최소화하면서 여러 단계의 가공을 가능하게 합니다. 전반적으로, 조직의 무결성을 보존하기 위한 이 간단한 방법은 다른 방법으로는 피할 수 있는 기술을 사용할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 절단 절차에 따라 취약해지는 뇌 절편과 같은 다양한 조직을 준비하는 데에도 성공적으로 사용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트, 12mm, 친수성 PTFE(Biopore), 0.4 & m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>해부</td></tr><tr><td>겸자, Dumont # 55, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>해부</td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 현미경 시스템</td><td>Nikon</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>모세관 유리</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 문화 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>일회용 눈금 이동 피펫</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 플레이트, 24-well</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리, #1</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>폴리사인 접착 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>글로브</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>액체 차단제</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 장착 매체</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT 미디엄</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라필름 실험실 필름</td><td>피셔</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>다우 코닝 고진공 그리스</td><td>시그마 알드리치</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 PSD95</td><td>밀리포어</td><td>MABN68</td><td>항체</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 알렉사 568</td><td>인비트로젠</td><td>A10037</td><td>항체</td></tr><tr><td>이소렉틴 알렉사 488</td><td>인비트로겐</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>케미블로커</td><td>케미콘</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>설포호다민</td><td>시그마-알드리치</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>카르보디이미드</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

면역 조직 화학적 평가를 수행 할 때 섬세한 조직으로 작업하는 것은 복잡한 요소가 될 수 있습니다. 여기서, 우리는 달리 조직의 손상을 야기 다양한 프로토콜의 사용을 허용 면역 처리 중에 거실 고정 조직 모두에 구조적지지를 제공하는 링 - 지원 수화 PTFE 멤브레인을 이용하는 방법을 제시한다. 첫째, 이것은 망막 조직 생활에 형광 마커의 알약로드와 함께 보여줍니다. 멤브레인 지원을 주입하는 동안 조직의 무결성을 유지하고 추가 영상 또는 처리를위한 준비를 쉽게 전송을 허용하는 동안이 방법은, 대상 구조를 신속하게 시각화 할 수 있습니다. 둘째, 카르 보디이 미드로 고정 조직에서의 항체 염색을위한 절차를 설명한다. 파라 포름 알데히드 고정이 일반적이지만, 카르 보디이 미드 고정 시냅스 단백질의 시각화를 위해 우수한 기판을 제공. 카르 보디이 미드의 제한으로 인해 발생하는 고정 된 조직이 상대적으로 약해이라고하고 있지만, 이것은지지 막의 사용하여 극복된다. 망막 조직은 이들 기술을 설명하기 위해 사용되지만, 그들은 어떤 깨지기 쉬운 조직에 적용될 수있다.

여기서는 염색 과정 중 전체 망막을 지지하기 위해 친수성 PTFE 막을 사용하는 것이 유용한 두 가지 대표적인 실험을 보여줍니다. 첫 번째 실험은 여러 망막 층에 걸쳐 뻗어 있는 정교한 혈관 네트워크인 망막 혈관계를 빠르고 간단하게 특성화하는 방법을 설명합니다(그림 2). 이 접근 방식은 isolectin의 볼루스 로딩(bolus loading)과 SRH를 이용한 침지 표지를 결합한 것입니다. 이는 살아있는 조직을 표지하여 거의 즉시 시각화하고 스캔할 수 있는 효율적인 방법입니다. 망막에서 혈관은 표층부터 심층까지 표지될 수 있습니다(그림 2E). 확산이 비교적 잘 되는 SRH와 달리, isolectin은 내경계막(ILM)을 잘 통과하지 못합니다. 이러한 제한은 유리 피펫을 사용하여 ILM 아래에 isolectin이 포함된 용액을 주입함으로써 해결할 수 있습니다. SRH 혈관 표지의 경우, 인서트에 장착하기 전에 조직을 염색하는 것이 더 좋습니다. SRH는 살아있는 조...

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

이 절차에서는 마우스 망막 조직을 사용하여 구조적 무결성을 유지하기 위해 섬세한 신경 조직을 안정화하는 방법을 시연합니다. 면역 조직 화학 염색의 여러 단계 동안, 먼저 안구를 적출하고 각막을 제거한 후 공막에서 망막을 분리하십시오. 망막 컵(eye cup)에 절개를 넣어 조직을 평평하게 펴십시오.그 다음, 조직의 무결성을 유지하기 위해 직접적인 조작 없이 흡입 전이(suction transfer) 방식을 이용하여 망막을 링 보강 막에 부착합니다. 이제 염색을 위해 링을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 연구 결과, 이 기술은 살아있는 조직에 효과적으로 적용될 수 있으며, 기존의 망막 박리 처리 방법들과 비교하여 시냅스 단백질 이미징을 위한 우수한 기질을 제공하는 것으로 나타났습니다.이러한 기술을 통해 물리적 조작을 최소화하면서 섬세한 조직을 옮길 수 있습니다. 이를 통해 변형 및 손상 가능성을 줄일 수 있습니다. 우리는 망막 변성 모델인 RD one 마우스의 평면 장착 조직(flat mounted tissue)에서 기록이 필요했을 때 처음으로 이 아이디어를 얻었으며, 이 마우스의 망막은 변이로 인한 광범위한 세포 손실로 인해 매우 얇고 취약합니다.저희 실험실의 박사후 연구원이 저와 함께 절차 시연을 진행하겠습니다. 먼저, 마취된 마우스의 안구를 적출하여 산소가 공급된 HEPES buffered ringer solution으로 옮깁니다. 각막을 제거하려면 핀셋으로 각막연(limbus) 부위의 안구를 잡고, 전톱니모양선(ora serrata)을 따라 원형으로 절개합니다.볼루스 주입 및 전기생리학적 기록을 위해 핀셋으로 수정체를 꺼냅니다. 블렌디드 엣지 핀셋을 사용하여 유리체를 최대한 제거하십시오. 이제 핀셋으로 공막을 단단히 잡아 안구 컵을 고정합니다.두 번째 포셉을 망막과 아이 컵(eye cup) 사이에 배치합니다. 포셉을 원주 방향을 따라 천천히 이동시킵니다. 망막과 아이 컵 사이의 시신경을 절단하고, 가위로 아이 컵을 제거합니다.망막 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 또는 망막 전체를 사용하려면, 홀더의 길이를 줄이기 위해 주변부에서 시신경 중간 지점까지 절개합니다. 과도한 부분은 선반을 사용하여 제거합니다.그다음 고운 사포로 거친 표면을 연마하십시오. 링 아래쪽에서 받침대를 제거하십시오. 플라스틱 피펫의 좁은 끝부분을 잘라내십시오.그런 다음 조직을 일부 용액과 함께 막으로 옮깁니다. 망막을 펼치면서 용액을 점진적으로 제거하고 조직을 폅니다. 이제 신경절 세포가 위를 향하도록 하여 망막을 막에 부착합니다.1 mL 주사기의 홀딩 팁을 잘라내고 조직 바로 아래에 배치합니다. 플런저를 약 0.3 mL 부피까지 당겨 조직이 막 내에 물리적으로 얽히게 합니다. 약 1 MΩ의 저항을 사용하여 붕규산 유리 모세관 피펫을 뽑아냅니다.그런 다음 각 패치 피펫의 끝부분을 조심스럽게 부러뜨립니다. 이어서, 10 µL의 HEPS 완충 링거 용액에 selectin stock 염색액 0.3 µL를 추가합니다. 이제 따뜻하게 가온되고 산소가 공급된 HEPS 완충 링거 용액이 흐르는 기록 챔버에 막을 넣습니다.마이크로 조작기를 사용하여 염색약이 담긴 피펫을 내경계막에 밀착시킵니다. 피펫을 더 전진시켜 내경계막을 관통합니다. 그다음, 단일 또는 다수의 표적 위치에 염색액을 주입합니다.이제 에피 형광 조명(epi fluorescence illumination) 하에서 관찰하며, 조직이 주입 상태에서 회복될 수 있도록 10분 동안 기다립니다. 필요한 경우, 인서트를 유리 바닥 배양 접시에 망막 면이 아래로 향하게 하여 옮깁니다. 시료의 습윤 상태를 유지하기 위해 HEP solution 한 방울을 추가합니다.또한, 플라스틱 링의 둘레를 따라 진공 그리스를 세 군데에 도포하여 인서트를 배양 접시에 단단히 고정합니다. 고정 후 접시를 현미경 스테이지로 옮기고, 막을 sucrose 기울기 용액에 담급니다. 플라스틱 인서트 링에서 막을 절제하여 분리합니다.Kim wipes를 사용하여 용액을 최대한 제거한 후, 망막이 위를 향하도록 파라필름 위에 놓습니다. 조직이 놓인 파라필름을 크라이오스탯 챔버로 옮기고 OCT 배지를 한 방울 첨가합니다. 급속 냉각 장치를 사용하여 동결 속도를 높입니다.냉동 시료를 떼어내어 뒤집습니다. 그다지 불필요한 냉동 OCT를 잘라냅니다. 시료 주변의 세 면은 약 2 mm 정도 남기고, 홀더에 부착될 면은 밀리미터 단위로 남겨둡니다.부착된 부위를 제외하고 노출된 망막 쪽에 OCT 한 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다. 망막 조직이 포함된 막을 동결시킵니다. 차가운 홀더 링 위에 OCT 한 방울을 떨어뜨립니다.냉동 시료를 즉시 드롭(drop)에 삽입하십시오. -19 °C에서 10 내지 20 µm 두께로 절편을 만든 후, 이를 가온된 폴리리신(polylysine) 접착 슬라이드 위에 배치하십시오. 절편이 부착된 슬라이드를 41 °C 가열 플랫폼 위에 올려놓고 암소에서 2~3분 동안 유지하십시오.그런 다음 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 이 실험은 망막 혈관계를 여러 망막 층에 걸쳐 뻗어 있는 정교한 혈관 네트워크로 빠르고 간단하게 특성화하는 방법을 보여줍니다. iso selectin의 볼러스 투여와 sulfa rumine 침지 라벨링을 결합함으로써, 살아있는 조직을 망막에서 거의 즉시 시각화 및 스캔할 수 있으며, 표층부터 심층까지의 혈관을 라벨링할 수 있습니다.상대적으로 확산이 잘 되는 SRH와 달리, 셀렉틴(selectin)은 내경계막을 잘 통과하지 못합니다. 시냅스 단백질을 라벨링할 때, 예를 들어 짧은 시간 동안 카르비미드(carbimide)로 고정한 후 시냅스 마커인 PSD 95에 대해 면역형광 염색을 수행하면, 기존의 파라포름알데히드 고정 방식보다 여러 가지 장점이 있습니다. IPL 내의 PSD 95는 개별 시냅스를 구별할 수 있는 밝은 점상 외관을 나타냈습니다.이와 대조적으로, 일반적인 파라포름알데히드 고정액을 사용했을 때는 시냅스 구성 요소의 식별이 덜 명확합니다. 망막 저온절편에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 이 막에 섬세한 조직을 마운팅하는 방법과 준비된 시료에 세포화학적 염색을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.망막을 필터에 부착하는 데 15분이 소요됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

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투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

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Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

이 프로토콜은 광학 투명화(optical clearing)와 면역 라벨링(immunolabeling)을 결합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 전체 볼륨 컨포칼 이미징을 제공합니다. 3D 구조를 보존하여 주요 신경 경로를 자세히 시각화할 수 있으며, 망막 성숙, 공간 조직, 질병 모델링 및 개인 맞춤형 의학에서의 잠재적 응용에 대한 연구를 개선합니다.

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

배우세요 쥐 망막 조직을 이용한 전체 마운트 준비 및 면역조직화학 염색법으로 시냅스 단백질 이미징을 위한 구조적 무결성을 보존하는 신경과학 연구 기법을 탐색하세요.

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