Name: 장기 만성 녹농균기도 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 배우세요 아가 비즈법을 이용하여 마우스에서 Pseudomonas aeruginosa 만성 기도 감염을 유도하는 방법입니다. 이 기법은 안정적인 세균 부하 유지를 통해 만성 감염 연구에 활용됩니다.

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Bragonzi의 실험실에서 연구는 이탈리아 낭포 성 섬유증 재단 (CFaCore) 및 EU-F​​7-2009-223670에 의해 투자되었다. 이 작품의 일부는 증류기, 고급 현미경 실험실에서 실시하고, 마우스의 조직 병리학은 병리학 해부학 (산 라파엘 과학 연구소) 단위로 수행되었다.

1. 만성 감염에 대한 준비 박테리아 (이전 마우스 도전에 세 이틀) <ol><li> 해당 P.에게 선택 루기 노자 균주는 시험한다. </li><li> P.의 백금이를 접종한다 Trypticase 간장 한천 (TSA) 플레이트에 -80 ° C 주식 문화에서 녹농균과 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 하나의 식민지를 선택하고 15 ML 스냅 덮인 관에 5 ㎖ Trypticase 간장 국물 (TSB)에 접종, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 하룻밤 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 2. 만성 감염에 대한 한천 구슬에 박테리아를 포함 (이전의 감염에 한 일) <ol><li> 세균의 하룻밤 문화의 작은 나누어지는을 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 1:50 희석 및 600 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정한다. </li><li> 신선한 TSB 20 ㎖를 포함하는 새로운 스냅 덮인 관에서 2 OD를 추가하여 밤새 세균성 문화를 희석. </li><li> 약 3 ~ 37 ° C에서 알을 품다 -10-15 OD의 전체가 도달 될 때까지, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 위상을 기록하는 4 시간. </li><li> 한편, 1.5 % 한천, 오토 클레이브와 수조에서 50 ° C로 평형화와 TSB 이루어지는 TSA를 준비한다. 물을 욕조에 50 ° C에서 삼각 플라스크에 preautoclaved 무거운 미네랄 오일 150 ㎖를 평형. </li><li> 일단 P. 녹농균은 4 ° C에서 15 분 동안 2,700 XG에서 원심 분리하여 박테리아 세포를 수집하고 상층 액을 버린다, 로그 단계에 도달한다. </li><li> 철저하게 완전히 펠렛을 재현 탁 할 1 멸균 PBS ㎖의 소용돌이에 박테리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 액체 TSA 9 ㎖를 50 ℃에서 사전 평형과 혼합 1 ㎖의 세균 현탁액 </li><li> 10 ㎖ TSA-P를 추가 바로 녹농균 (50 ° C에서 데워진) 중광 오일 혼합물은 실온에서 6 분 동안 교반 하였다. 교반은 기름에 보이는 소용돌이를 생성한다. </li><li> 최소 SP에서 교반, 4 ° C에 혼합물을 냉각35 분 (그림 1)에 대한 EED. </li><li> 추가로 20 분 동안 얼음에 한천 비즈 - 오일 혼합물을 휴식. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 2,700 XG에서 (50) ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 한천 구슬로 이동 </li><li> 정확히 미네랄 오일을 제거하고 단계 2.11에 설명 된대로, 멸균 PBS로 여섯 번 씻는다. 세 세척 후, 비드 대신 원심 분리기를 사용하여 중력에 의해 펠릿 화 될 수있다. 마지막으로 세척 한 후, 20 ~ 30 ㎖의 PBS에서 한천 구슬을 재현 탁. </li><li> 구슬 (약 0.5 ㎖)의 분취 량을 가지고 무균 균질화. </li><li> 균질화 된 구슬의 100 μl를 타고 멸균 PBS 900 μL로 희석. 직렬 10-6까지 1:10 희석. </li><li> 아래로 10-6, 37 ° C에서 접시를 배양 원액 샘플을 포함 TSA 플레이트 접시에 시리얼 희석, </li><li> 여러 분야에 거꾸로 광학 현미경을 사용하여 구슬의 직경을 측정합니다. 구슬의 직경 (100 ~ 200 μm의 사이에 있어야합니다 <str사연&gt; 그림 1). </li><li> 4 ℃에서 밤새 구슬을 저장 </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. 한천 비즈 준비와 마우스 감염의 개요. P. 녹농균이라는 박테리아 세포는 PBS 1 ㎖에 재현 탁 액체 TSA (50 ° C)의 9 ML에 추가됩니다. 이 혼합물을 플라스크에서 50 ° C에서 150 ㎖의 무거운 미네랄 오일에 첨가하고 실온에서 10 분 동안 고속으로 교반 하였다. 플라스크를 35 분 동안 천천히 교반하면서 4 ° C로 냉각 될 때, 한천 비즈를 만들어 고화하고, 혼합물에 존재하는 박테리아 한천 비드에 포함된다. 박테리아 세포를 포함하는 한천 비드의 세부 사항은 (A) 표시됩니다. 멸균 PBS를 사용하여 몇 개의 세척하여 광유를 제거한 후, 한천 비드 현탁액 F 준비또는 기관 내 주사 (B)로 쥐의 허파 접종은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭</a> . 3. 한천 구슬 마우스 도전 윤리 성명 :이 프로토콜과 실험은 산 라파엘 과학 연구소의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침을 따르십시오. <ol><li> 한천 비즈 서스펜션에 CFU / ㎖의 수를 결정하기 위해 TSA 플레이트에 콜로니 형성 단위의 수 (CFU)를 계산합니다. 50 ㎕의 1 ~ 2 × 10 6의 최적 접종 도달하는 2 ~ 4 × 10 7 CFU / ml로 멸균 PBS로 한천 구슬을 희석. </li><li> C57Bl/6NCr에게 (6-8 주령 20~22g) 0.002 ㎖ / g 체중의 볼륨 관리 0.9 % 염화나트륨의 케타민 (50 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖)와 수컷 마우스를 마취 복강 내 주사. 참고 : 마취는 adeq 간주됩니다uate 동물이 조용히 계속 유지하면, 외부 자극에 응답하지 않는, 일정한 심장과 호흡 속도를 가지고 있습니다. </li><li> 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스의 코트를 소독. </li><li> 피부의 수직 절단하여 기관을 노출하고 기관에 아래로 이동하는 동안 stylette을 제거하기 위해 관심을 유지, 살균, 유연한 22 G 0.9 mm X 25mm의 IV 카테터와 기관을 삽관. 너무 깊은 기관에 카테터를 삽입합니다. 융기 (분기점)에 도달하기 전에 중지합니다. </li><li> 즉시 1 ML의 주사기에 의해 한천 구슬 현탁액 50 μL의 볼륨을 가지고 카테터에 연결합니다. 부드럽게 구슬이 폐에 이식 할 수 있도록, 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 봉합 클립을 사용하여 절개를 닫습니다. </li><li> 잠에서 깨어 때까지 가열 패드에 동물을 배치합니다. </li></ol> 4. 쥐 평가 <ol><li> 코트 품질, 자세 등의 임상 증상 매일 쥐를 관찰,보행 및 수화 상태. 매일 체중을 모니터링합니다. ≥ 20 %의 체중을 잃게 마우스는 안락사해야합니다. </li><li> 기관지 세척액 (BAL)과 폐의 수집 및 총 CFU의 분석, 조직 학적 분석, BAL, 사이토 카인 분석의 전체 및 차등 세포 수의 측면에서 염증 반응 및 포인트 6 또는 7의 수집을 위해 포인트 5에 따라 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 활동. </li></ol> 5. BAL 유체 수집 및 분석 <ol><li> CO 2 흡입 쥐를 안락사. </li><li> 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스의 코트를 소독. </li><li> 피부의 수직 컷으로 기관과 흉곽을 노출합니다. 다이어프램을 절단하여 폐를 노출합니다. </li><li> 핀셋을 사용하여 기관에서 봉합 나사를 삽입하고 멸균, 유연한 22g 0.9 mm X 25mm의 IV 카테터와 기관을 삽관. CA를 바인딩 할 봉합 실의 두 끝을 당겨기관에 theter 및 기관의 주위에 실을 매듭. </li><li> 1 ML의 주사기를 사용하여 RPMI 1640 1 ㎖의 볼륨을 가지고 카테터에 연결합니다. 폐를 씻어 낸 후 액체를 복구, 15 ML 튜브에 저장하기 위해 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 : 사이토 카인 분석 할 경우, RPMI 1640 프로테아제 억제제를 추가합니다. </li><li> RPMI 3 ㎖의 총이 과정을 세 번 반복합니다. 지금부터, 얼음 BAL 액을 저장합니다. 폐의 수집 및 분석을위한 6 단계로 이동합니다. 참고 : 모든 액체가 (2.8 ㎖의 최대) 검색됩니다주의하시기 바랍니다. </li><li> BAL 액에 존재하는 박테리아의 부량, 작은 나누어지는 (300 μl를) 샘플, 직렬 TSA 판에, 멸균 PBS에서 판을 1:10로 희석 밤새 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> Burker 세포 수 실 Tuerk 솔루션 BAL 유체 1:2 나누어지는 희석 거꾸로 빛을 광학 현미경을 사용하여 전체 세포를 계산합니다. </li><li> R을 원심 분리기4 ℃에서 8 분 330 XG에서 BAL 액을 emaining -80 ° C.에 그것을 저장, ELISA 사이토 카인 분석을위한 상층 액을 cytospin에 의해 차등 세포 수에 대한 5.10-5.13 단계를 따릅니다. </li><li> 펠릿이 빨간색 인 경우, RBC의 용해 버퍼의 250-300 μL에 펠렛을 재현 탁 적혈구가 3 분 동안 초순수 증류수에 1:10으로 희석 용해. 4 ℃에서 8 분 330 XG에 2 ㎖ PBS와 원심 분리기으로 중화 </li><li> 상등액을 버리고 RPMI 10 % 소 태아 혈청 (FBS)에서 펠렛을 재현 탁. 총 세포 수에 따라 1 × 10 6 세포 / ml을 제공하는 볼륨을 사용합니다. </li><li> cytospin의 중심을 향하도록 종이 필터를 cytospin에 해당 슬롯에 현미경 슬라이드 및 필터를 놓습니다. 5 분 300 XG에 cytocentrifuge의 cytospin 원심 분리기의 적절한 우물에 각 시료 150 μl를 피펫. </li><li> 엄마에 따르면, Romanowsky 상용 키트를 사용하여 염색하여 슬라이드를 얼룩nufacturer의 지시 이전 12 설명 된대로. 단계 MPO 활동 분석을위한 5.14-5.17을 따르십시오. </li><li> 4 ℃에서 5 분 380 XG에서 BAL의 남은 양을 원심 분리기 뜨는을 취소하고 세포를 용해하는 초 고순도 증류수 헥사 클로라이드 0.5 %의 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 서스펜션은 분석을 수행하기 전에 몇 일 동안 -20 ° C에서 얼 수있다. </li><li> 30 4 ° C에서 최소 및 샘플도 적절한 희석, 잘 경우 필요에 각각 중복에서 샘플을 추가, 96 - 웰 플레이트에 MPO 분석을 수행하는 상층 액을 사용하여 16,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 우물의 각 샘플에 추가 3,3 동량 &#39;, 5,5&#39;퍼 옥시다아제에 대한 기질로서 - 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). 컬러에 대한 발전이 없을 때까지 반응이 적어도 5 분 동안 어두운 데에서 일어날 수 있도록 허용하고. </li><li> 이 MH 2 SO 4를 첨가하여 반응을 정지ND 450 nm에서 OD를 측정합니다. OD 값은 퍼 옥시 다제 활성에 직접적으로 비례한다. </li></ol> 6. 폐 및 사이토 카인 분석에 세균 부하 측정 <ol><li> 즉시 BAL 유체 수집 한 후, 마우스에서 소비세 폐,,, 멸균 PBS에 별도의 엽 (叶)을 헹구어 멸균 PBS의 2 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 넣어 얼음에 저장합니다. 주 : 사이토킨 분석 할 경우에, 튜브를 PBS로 프로테아제 억제제를 추가한다. </li><li> 무균 폐를 균질화, 균질에서 작은 나누어지는 (300 μL)를 가지고, 직렬 TSA 판에, PBS 접시 1:10 희석 밤새 37 ° C에서 알을 품다. 총기도 세균 부하가 BAL 액과 폐에서 발견 된 CFUs의 합이되므로주의하시기 바랍니다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 나머지 균질를 원심 분리기 -80 ° C에서 ELISA 사이토 카인 분석을위한 뜨는 및 저장을 </li></ol> 7. 조직 학적 검사 &lt;올&gt; <li> 폐의 양상과 특성을 유지하기 위해, 단지 BAL 유체가 수집되고 있지 않은 폐의 조직 학적 분석을 수행합니다. </li><li> CO 2 흡입하여 마우스를 안락사. </li><li> 피부의 수직 절단하여 흉곽을 노출, 조리개를 절단하여 폐를 노출합니다. </li><li> 소비세 폐, PBS에 헹구어 엽 (叶)을 분리, 빛으로부터 보호 4 ° C에서 5 ~ 10 ㎖의 10 % 중성 포르말린 (4 % 포름 알데히드) 및 저장을 포함하는 튜브에 넣어. </li><li> 표준 절차를 사용하여 파라핀에 포함 된 폐. </li><li> 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 슬라이드 표준 절차에 따라, 커버 슬립으로 슬라이드 커버. </li><li> 거꾸로 명 시야 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사하고 카메라에 현미경을 연결하여 이미지를 획득. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

P.에있는 중요한 단계 녹농균 비즈 준비 및 마우스 문제는 아래에보고됩니다. 마우스 도전에 사용되는 녹농균 변형이 중요합니다. 사망, 만성 감염 또는 통관 도전에 사용되는 균주에 따라 크게 다를 수 있습니다. P. 그것은 비교적 낮은 사망률, 더 심한 병변, 높은 만성 감염의 결과 때문에 녹농균 RP73 임상 균주 PAO1 참조 실험실 변형 선호했다. 임상 연구에서 약물 테스트는 P. 수행해야 장기 만성 감염을 수립 높은 효율을 선택한 녹농균의 변종. 이는 과학적 검증 및 통계 분석 10,11의 요건과 일치하는 마우스의 수를 최소화한다. 개별 P. 녹농균 한천 비드 준비의 크기와 CFU / ㎖에 따라 다릅니다.150 μm의 2 × 10 7 CFU / ㎖의 ve...

낭포 성 섬유증 (CF)는 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 유전 질환이다. 이 유전자는 대부분의 상피 세포의 세포막에 발현 클로라이드 채널 인코딩한다. 기관지 확장증, 점액 플러그 및 실질 파괴는 점진적으로 심각한 폐병과 CF 환자 1의 대부분의 사망으로 이어질 녹농균 감염에 의해 주로 일으키는 원인이되었다. 이해 CF의 발병 기전과 새로운 치료법의 발전은 CF의 특징적인 기능을 동물 모델에 의존하고 있습니다. 유전자 CFTR 유전자에 대해 수정 몇몇 마우스는 생성되었지만, CF와 같은 폐 질환과 CF의 환자에서 본 여러 가지 다른 장기의 이상을 요점을 되풀이하는이 종의 능력에 한계가 널리 2 문서화되었습니다. 감염의 개발은 CF의 동물 모델에서 가장 중요한 문제 중 하나입니다. 문학 CL이른 쥐가 이러한 한천, 아가로 오스, 또는 해조류 알긴산 3-5로 고정 화제에 매립 균을 접종 한 경우에만 한 달 이상 지속되는 만성 감염이 달성 될 수 있다는 것을 시사한다. These 고정화 제제 박테리아 마찬가지로 CF 환자 6의 점액 성장에, microcolonies 형태 성장에 허용 호기성 / 혐기성 상태 제공. 만성 감염이 모델은기도 염증 손상 7을 일으키는 원인이되는 폐의 박테리아의 지속성에 이르게한다. 그러나, 사용 된 방법, 균주 및 폐 식균 복용량에 따라 서로 다른 시점에서 폐에서 회수 만성 감염된 마우스의 백분율 및 세균 부하는 상당히 다를 수있다. 특히, 장기 만성 감염의 주요 과제는 P.에 의해 낮은 세균 부담이 남아있다 녹농균 및 공격 후 감염된 쥐 주 동안의 낮은 비율을 나타내는 그쪽으로T 박테리아 세포는 점차적으로 호스트에 의해 삭제됩니다. P.를 선택함에 CF의 수집에서 녹농균 RP73 임상 균주는 우리가 성공적으로 C57Bl/6NCrl 쥐 한 달 안정적인 세균 부하쪽으로 낮은 사망률, 더 심한 병변, 만성 감염의 높은 비율을 얻은 8 분리합니다. 본 논문에서는 P.를 포함에 대한 방법을 자세히 설명 한천 구슬 녹농균, 우리는, 기관 내 점적으로 쥐를 감염 폐에 세균 하중과 사이토 카인을 측정, BAL 유체를 수집하고 조직 학적 검사를 수행했습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 병인의 8,9에 근본적으로 중요한 문제를 해결하고 P.에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 연구자 도움이됩니다 녹농균 만성 감염 10, 11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptic 콩 국물</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, 과립</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>중유</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-케타민 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기 25 G 5/8 in&nbsp; 0.5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>카테터 22 G 0.9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게 - 0.5 mm 팁 곡선</td>형 <td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>가위, 아이리스, 11 cm, 직선</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>봉합 클립</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 실</td><td>, Fine Science Tools</td><td>, 18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI, 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>, 완전한 프로테아제 억제제 칵테일</td>, <td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker 일회용 챔버</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk 용액</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ 사이토퍼넬</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky 염색 세트</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96-well EIA/RIA 플레이트</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>해리스 헤마톡실린 논 파파니콜라</td>우 <td>바이오 옵티카</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin 플러스 알코올 용액</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>세포원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>저비용 가열 패드</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>균질화 프로브</td><td>Ystral</td><td>2366925(소형)</td><td></td></tr><tr><td>도립 광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>카메라(현미경)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>로터리 마이크로톰</td><td>라이카</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

모델 자체에 관한 관심의 개수가 있지만 만성기도 감염의 마우스 모델은 낭포 성 섬유증 (CF)의 연구에서 중요한 자산이다. 단지 소수의보고가 생체 내에서 장기간의 만성 감염에 집중 반면 염증과 감염의 초기 단계는 광범위하게, 녹농균 한천 비즈 마우스 모델을 이용하여 연구 하였다. 장기 만성 감염의 주요 과제는 P.에 의해 낮은 세균 부담이 남아있다 녹농균이라는 박테리아 세포가 점진적으로 호스트에 의해 취소 된 것을 나타내는 공격 후 감염된 쥐 주의 낮은 비율. 이 논문은 생쥐에서 효율적으로 장기 만성 감염을 얻기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 P.의 매립에 기초 C57Bl/6NCrl 마우스에서 기관 내 점적 한 다음 체외 한천 구슬 녹농균 임상 균주. 양측 폐 감염 SEV와 관련된체중 감소, 사망률, 만성 감염 및 염증 반응 등의 ERAL 측정 판독을. P. 그것은 비교적 낮은 사망률, 더 심한 병변, 높은 만성 감염의 결과 때문에 녹농균 RP73 임상 균주 PAO1 참조 실험실 변형 선호했다. P. 녹농균의 식민지 세 개월 이상 폐에 지속될 수 있습니다. 쥐의 폐 병리 고급 만성 폐 질환을 가진 CF 환자의 그것과 유사합니다. 이 뮤린 모델은 가장 밀접 인간 질병의 과정을 모방 및 병인에 대한 연구 및 신규 한 치료의 평가를 모두 사용할 수있다.

프로토콜은 P. 제대로 완료되면 녹농균 한천 - 구슬은 100 ~ 200 사이의 μm의를 측정하고 슬라이드에 한천 비즈 현탁액의 작은 볼륨을 피펫 팅에 의해 거꾸로 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 도 1에 상세히 도시 된 바와 같이 하나의 균체는, 한천 구슬에 표시됩니다. P.의 선택 한천 비즈 제조에 사용 루기 노자 균주가 중요하다.도 2 및 표 1은 데이터 P. 가진 마우스를 감염 다음 수득 보여 녹농균 PAO1 참조 실험실 변형 RP73 임상 분리에 비교했다. 사망률, 감염의 처음 3 일 이내에 관찰 (그림 2A와 2B) 모두 긴장 낮은, 그러나 PAO1에 대한 높은 수준이다. 살아남은 생쥐의 만성 감염의 비율의 측면에서 상당한 차이가 PAO1 및 RP7...

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 마우스에서 지속적이고 장기적인 만성 Pseudomonas aerogen 기도 감염을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선택한 Pseudomonas aerogen 균주를 배양합니다. 두 번째 단계는 박테리아를 agar 및 mineral oil과 함께 50 °C에서 혼합한 후, 천천히 계속 교반하면서 4 °C로 냉각시켜 박테리아를 작은 agar 비드 내에 임베딩하는 것입니다.다음으로, PBS로 여러 번 세척하여 미네랄 오일을 제거하고, 한정량의 한천 비드를 균질화하여 한천 플레이트에 도말합니다. 세균 함량을 결정하기 위한 마지막 단계는 한천 비드 현탁액 수 마이크로리터를 마우스의 기관으로 주입하여 만성 pseudomonas aerogen 폐 감염을 유도하는 것입니다. 최종적으로, 감염 후 서로 다른 시점에서 기관지 폐포 세척액과 폐를 회수하여 한천 플레이트에 도말함으로써 만성 감염된 마우스의 비율과 생존한 마우스의 기도 내 세균 부하를 검출할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이러한 한천 비트 방법의 주요 장점은 높은 비율의 마우스에서 안정적인 장기 만성 감염을 가능하게 하여 최대 한 달까지 안정적인 세균 부하를 유지시킨다는 점입니다.AGA 비드 방법은 마우스 폐 내에서 박테리아가 미세 콜로니 형태로 성장할 수 있는 미호기성 조건을 제공합니다. 낭성 섬유증 환자의 점액 내 성장 방식과 유사하게, 이 방법은 연구자가 낭성 섬유증 및 기타 호흡기 질환의 병태생리에 관한 핵심 질문을 해결하고, 만성 폐 감염을 일으키는 Pseudomonas aeruginosa에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 이 방법은 Burkholderia cepacia 또는 Staphylococcus aureus를 포함한 다른 병원균의 만성 감염을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 서로 다른 병원균과의 공동 감염 또는 경쟁 실험도 가능합니다. 시연은 포스트닥터인 Pheno와 제 실험실의 박사과정 학생인 Camil Riva가 수행합니다. 마우스 접종 3일 전, -80 °C 보관 배양액으로부터 Pseudomonas aeruginosa를 루프로 가득 채워 트립토소이-아거(tryptone soy agar) 플레이트에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 37°C의 진탕 배양기에서 200 RPM으로 하룻밤 동안 배양한 5 mL의 Tryptic Soy Broth에 접종된 단일 콜로니를 선택합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 박테리아 배양액의 소량을 인산염 완충 식염수(PBS)로 1:50 비율로 희석합니다. 그다음 600 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다.다음으로, 새로운 튜브에 37°C에서 약 3~4시간 동안 배양한 신선한 TSB 20 mL를 넣고, 여기에 박테리아 현탁액 2 OD를 추가하여 희석합니다. 이후 200 RPM의 진탕 배양기에서 총 10~50 OD에 도달할 때까지 대수 성장기(log phase)까지 배양합니다. Pseudomonas aeruginosa가 대수 성장기에 도달하면, 4°C에서 2,700 ×g로 15분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수집하고 상층액은 제거합니다. 그 후.세균 펠릿을 1 mL의 멸균 PBS에 현탁하고 볼텍싱하여 완전히 재현탁합니다. 그 다음 세균 현탁액 1 mL를 50 °C로 미리 평형시킨 액상 TSA 9 mL와 혼합합니다. 이 혼합물을 50 °C로 예열된 고밀도 미네랄 오일에 첨가합니다.즉시 실온에서 6분 동안 교반합니다. 이때 교반으로 인해 오일 내에 눈에 보이는 와류가 형성되어야 합니다. 그 후 혼합물을 4°C로 냉각하며, 최소 속도로 35분 동안 교반합니다.그런 다음 얼음 위에서 20분 동안 추가로 방치합니다. 이후 아가르 비드를 50 milliliter falcon tubes로 옮기고 4 °C에서 15분 동안 2,700 ×g로 원심분리합니다.미네랄 오일을 정확하게 제거하고 멸균된 PBS로 아가로스 비즈 펠렛을 세척합니다. 세 번의 세척 후 이 과정을 6회 반복합니다. 마지막 세척 후에는 원심분리기를 사용하는 대신 중력을 이용하여 비즈를 펠렛화할 수 있습니다.한천 비즈를 20 내지 30 mL의 PBS에 무균적으로 재현탁한 후, 비즈 0.5 mL를 균질화합니다. 다음으로, 균질화된 비즈 100 µL를 900 µL의 멸균 PBS에 희석하고, 이를 1:10 비율로 10⁻⁶까지 6회 연속 희석합니다.그 다음, 희석하지 않은 시료를 포함하여 단계 희석액을 TSA 플레이트에 도말합니다. 시료를 10⁻⁶까지 희석하고 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 도립 광학 현미경을 사용하여 여러 시야에서 비드의 직경을 측정합니다.마우스 공격 접종 전, 비드의 직경은 100에서 200 micron 사이여야 합니다. TSA 플레이트의 colony forming unit 수를 측정하여 한천 비드 현탁액의 mL당 CFU 수를 결정하십시오. 그 후, 50 µL 내의 최적 접종량인 1~2 × 10⁶ CFU에 도달할 수 있도록 한천 비드의 부피를 mL당 2~4 × 10⁷ CFU로 조정하십시오.케타민과 자일라진으로 미리 마취시킨 6~8주령의 수컷 마우스를 가열 패드 위에 배측으로 눕힌 후, 70% ethanol로 털을 소독합니다. 피부를 수직으로 절개하여 기관을 노출시킵니다. 그다음, 핀셋을 사용하여 기관을 덮고 있는 근육들을 분리합니다.그런 다음 1 mL 주사기로 아가 비드 현탁액을 최대 50 µL까지 흡입합니다. 그 후, 카테터를 사용하여 기관을 삽관하고 아가 비드 현탁액이 담긴 1 mL 주사기를 카테터에 연결합니다. 주사기의 플런저를 천천히 밀어 비드가 폐로 이식되도록 합니다.그다음 봉합 클립을 사용하여 절개 부위를 닫습니다. 이 단계에서는 안락사시킨 마우스를 배와 닿게 눕힌 후(supine position), 70% ethanol로 털을 소독합니다.다음으로, 피부를 수직으로 절개하여 기관과 흉곽을 노출시킵니다. 그 후, 횡격막을 절개하여 폐를 노출시킵니다. 핀셋을 사용하여 기관 아래에 봉합사를 삽입하고 카테터로 기관 내 삽관을 실시합니다.그 다음, 봉합사의 양 끝을 당겨 카테터를 기관에 고정하되, 실이 기관을 압박하지 않도록 주의하십시오. 이제 1 mL 시린지를 사용하여 세포 배양액 1 mL를 취해 카테터에 연결합니다. 시린지의 플런저를 밀어 폐를 세척한 후, 즉시 액체를 회수하여 15 mL 튜브에 보관하십시오.배지 총 3 mL를 사용하여 이 단계를 세 번 반복한 후, 폐의 수집 및 분석을 위해 기관지폐포 세척액을 얼음 위에 보관하십시오. 마우스에서 폐를 적출합니다. 멸균된 PBS로 세척하십시오.그 다음 엽을 분리합니다. 2 mL의 멸균 PBS가 담긴 라운드 바텀 튜브에 넣고 얼음에 보관합니다. 무균적으로 폐를 균질화하고 연속적으로 처리합니다.균질액을 PBS로 1:10 비율로 희석합니다. 그다음, 희석하지 않은 시료를 포함하여 단계별 희석액을 TSA 플레이트에 도말하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 얼음에서 BAL 액체를 꺼내 도립 광학 현미경 하에서 Turk 용액으로 1:2 비율로 희석합니다.분획 세포 수를 측정하기 위해 Burker 세포 계수 챔버에서 전체 세포 수를 측정합니다. BAL 액을 4°C에서 330 ×g로 8분 동안 원심분리합니다. 그다음, 상층액을 제거하고 10% fetal bovine serum이 포함된 세포 배양 배지에서 1 million cells/mL 농도로 펠렛을 재현탁합니다. 카드보드 필터가 중심을 향하도록 하여 현미경 슬라이드와 필터를 사이토스핀(cyto spin)의 적절한 슬롯에 배치합니다.각 시료 150 µL를 시토스핀용 웰에 분주하고, 세포 원심분리기(cyto centrifuge)를 사용하여 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 세포 점적을 관찰하고, 염색 후 현미경으로 차등 계수를 수행할 수 있습니다. 이 그림은 PAO1 표준 균주와 RP73을 이용한 Pseudomonas aerogenosa의 만성 감염 시간 경과를 보여줍니다.각 시점별 임상 균주. 히스토그램의 빨간색은 균혈증으로 인한 사망률 백분율을, 회색은 생존율 백분율을 나타내며, 흰색은 감염이 제거된 동물의 백분율을, 녹색은 만성 감염이 형성된 동물의 백분율을 나타냅니다. pseudomonas aerogen RP 73 임상 균주는 PA oh one 실험실 균주에 비해 만성 감염을 형성하는 효율이 더 높습니다.생존한 마우스는 표시된 시점에 안락사시켰으며, 폐를 적출하여 균질화한 후 TSA 플레이트에서 배양하여 세균 부하량을 측정하였다. 마우스 폐 내 P oh one 및 RP 73 균주의 성장 곡선을 보면, 감염 후 3일째의 세균 양은 RP 73에 비해 P oh one에서 더 높게 나타났다. 이후 만성 감염이 확립되는 7일째부터는 두 균주 모두 폐당 10⁴에서 10⁵ CFU 사이에서 세균 부하량이 안정화되었으며, RP 73 임상 균주로 7일간 만성 감염을 유도한 후 BAL 액 내의 염증 세포 모집을 평가하였다.RP 73에 감염된 마우스는 감염되지 않은 마우스에 비해 총 백혈구 수가 상당히 높습니다. 가장 많이 관찰되는 세포는 호중구이며, 이는 만성 감염에 대한 선천 면역 체계의 상당한 반응을 나타냅니다. 아래 상자에서 화살표는 사이토스핀 후 슬라이드 상의 한 지점에서 관찰되는 호중구와 대식세포를 가리킵니다.rp. 73 임상 균주로 7일간 만성 감염시킨 생쥐 폐의 조직 절편에 대해 헤마토실린 및 에오신 염색을 수행한 결과입니다. 화살표로 표시된 비드는 기관지 내강에서 관찰되며, 박테리아 세포의 미세 군집이 보입니다. 감염된 부위의 기관지와 폐 실질은 대규모의 염증 세포 모집이 특징적으로 나타납니다.감염되지 않은 마우스의 기도는 염증 세포가 없이 깨끗했던 반면, BES의 직경과 최종 농도는 매우 중요한 세부 사항입니다. 좋은 결과를 얻기 위해서는 냉각 단계 동안의 교반 속도가 비드 크기에 영향을 미치며, 초기 박테리아 양이 비드의 최종 희석 농도에 영향을 줄 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 마우스의 사망률은 낮고 만성 감염률은 높은 적절한 pseudomona 균주를 선택함으로써 사용되는 마우스의 수를 최소화할 수 있습니다.마우스 감염 후 세균 수 측정이 수행됩니다. 또한, 세균 감염에 대한 궤양 반응을 연구하기 위해 기관지 내 총 세포 수 및 분획 세포 수의 염증 반응, VIR 수준, 액체 사이토카인 분석, 멜로퍼옥시다제 분석 및 조직학적 분석을 수행할 수 있습니다. 슈도모나스와 같은 기회감염성 병원균을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 장갑 착용, 생물안전작업대 내에서의 세균 취급, 멸균 기술 사용과 같은 주의 사항을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.적절한 동물 모델의 개발을 통해 새로운 항균 및 항염증 분자의 전임상 시험이 가능해졌습니다. 이는 낭성 섬유증 또는 기타 호흡기 질환 환자의 폐 감염에 대한 향후 치료적 개입을 위한 중요한 단계입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 드 브리스, C. R., et.al. 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 투명 필름 드레싱으로 덮인 두 개의 전층 등 피부 상처를 가진 쥐에 발광성 Pseudomonas aeruginosa 를 지연 접종하는 과정을 보여줍니다. 이로 인해 바이오필름 형성과 만성 감염 형성이 촉진됩니다. 정기적인 생물발광 모니터링을 통해 박테리아 부담을 정량화하고 감염 진행 상황을 시간에 따라 추적할 수 있습니다.

만성 Pseudomonas aeruginosa 피부 상처 감염의 마우스 모델 개발 

우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.

녹농균 유발 폐 손상 모델

이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

이 원고는 생쥐에서 폐렴의 전염성 모델을 확립하고 손상 해결의 각각의 특성과 함께 박테리아 성장 및 기관 내 점안 방법을 설명합니다. 고차원 유세포 분석을 사용하여 면역 환경을 평가하는 새로운 접근 방식도 설명합니다.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

생쥐는 일반적으로 Mycobacterium abscessus에 의한 감염에 내성이 있으며, 이는 폐 감염에 대해 절실히 필요한 항생제의 발견 및 개발을 복잡하게 만듭니다. 여기에서는 면역 능력이 있는 마우스에서 지속적인 감염을 전달하는 것으로 나타난 접종 준비 및 기관 내 감염 방법에 대해 설명합니다.

면역 능력이 있는 마우스를 기관내로 접종하기 위한 한천 비드 내장 마이코박테리움 농양의 제조

배우세요 아가 비즈법을 이용하여 마우스에서 Pseudomonas aeruginosa 만성 기도 감염을 유도하는 방법입니다. 이 기법은 안정적인 세균 부하 유지를 통해 만성 감염 연구에 활용됩니다.

장기 만성

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