장기 만성

이 실험 절차의 전체적인 목표는 마우스에서 지속적이고 장기적인 만성 Pseudomonas aerogen 기도 감염을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선택한 Pseudomonas aerogen 균주를 배양합니다. 두 번째 단계는 박테리아를 agar 및 mineral oil과 함께 50 °C에서 혼합한 후, 천천히 계속 교반하면서 4 °C로 냉각시켜 박테리아를 작은 agar 비드 내에 임베딩하는 것입니다.

다음으로, PBS로 여러 번 세척하여 미네랄 오일을 제거하고, 한정량의 한천 비드를 균질화하여 한천 플레이트에 도말합니다. 세균 함량을 결정하기 위한 마지막 단계는 한천 비드 현탁액 수 마이크로리터를 마우스의 기관으로 주입하여 만성 pseudomonas aerogen 폐 감염을 유도하는 것입니다. 최종적으로, 감염 후 서로 다른 시점에서 기관지 폐포 세척액과 폐를 회수하여 한천 플레이트에 도말함으로써 만성 감염된 마우스의 비율과 생존한 마우스의 기도 내 세균 부하를 검출할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이러한 한천 비트 방법의 주요 장점은 높은 비율의 마우스에서 안정적인 장기 만성 감염을 가능하게 하여 최대 한 달까지 안정적인 세균 부하를 유지시킨다는 점입니다.

AGA 비드 방법은 마우스 폐 내에서 박테리아가 미세 콜로니 형태로 성장할 수 있는 미호기성 조건을 제공합니다. 낭성 섬유증 환자의 점액 내 성장 방식과 유사하게, 이 방법은 연구자가 낭성 섬유증 및 기타 호흡기 질환의 병태생리에 관한 핵심 질문을 해결하고, 만성 폐 감염을 일으키는 Pseudomonas aeruginosa에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 이 방법은 Burkholderia cepacia 또는 Staphylococcus aureus를 포함한 다른 병원균의 만성 감염을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 서로 다른 병원균과의 공동 감염 또는 경쟁 실험도 가능합니다. 시연은 포스트닥터인 Pheno와 제 실험실의 박사과정 학생인 Camil Riva가 수행합니다. 마우스 접종 3일 전, -80 °C 보관 배양액으로부터 Pseudomonas aeruginosa를 루프로 가득 채워 트립토소이-아거(tryptone soy agar) 플레이트에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

다음 날, 37°C의 진탕 배양기에서 200 RPM으로 하룻밤 동안 배양한 5 mL의 Tryptic Soy Broth에 접종된 단일 콜로니를 선택합니다. 다음 날 아침, 하룻밤 배양한 박테리아 배양액의 소량을 인산염 완충 식염수(PBS)로 1:50 비율로 희석합니다. 그다음 600 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다.

다음으로, 새로운 튜브에 37°C에서 약 3~4시간 동안 배양한 신선한 TSB 20 mL를 넣고, 여기에 박테리아 현탁액 2 OD를 추가하여 희석합니다. 이후 200 RPM의 진탕 배양기에서 총 10~50 OD에 도달할 때까지 대수 성장기(log phase)까지 배양합니다. Pseudomonas aeruginosa가 대수 성장기에 도달하면, 4°C에서 2,700 ×g로 15분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수집하고 상층액은 제거합니다. 그 후.

세균 펠릿을 1 mL의 멸균 PBS에 현탁하고 볼텍싱하여 완전히 재현탁합니다. 그 다음 세균 현탁액 1 mL를 50 °C로 미리 평형시킨 액상 TSA 9 mL와 혼합합니다. 이 혼합물을 50 °C로 예열된 고밀도 미네랄 오일에 첨가합니다.

즉시 실온에서 6분 동안 교반합니다. 이때 교반으로 인해 오일 내에 눈에 보이는 와류가 형성되어야 합니다. 그 후 혼합물을 4°C로 냉각하며, 최소 속도로 35분 동안 교반합니다.

그런 다음 얼음 위에서 20분 동안 추가로 방치합니다. 이후 아가르 비드를 50 milliliter falcon tubes로 옮기고 4 °C에서 15분 동안 2,700 ×g로 원심분리합니다.

미네랄 오일을 정확하게 제거하고 멸균된 PBS로 아가로스 비즈 펠렛을 세척합니다. 세 번의 세척 후 이 과정을 6회 반복합니다. 마지막 세척 후에는 원심분리기를 사용하는 대신 중력을 이용하여 비즈를 펠렛화할 수 있습니다.

한천 비즈를 20 내지 30 mL의 PBS에 무균적으로 재현탁한 후, 비즈 0.5 mL를 균질화합니다. 다음으로, 균질화된 비즈 100 µL를 900 µL의 멸균 PBS에 희석하고, 이를 1:10 비율로 10⁻⁶까지 6회 연속 희석합니다.

그 다음, 희석하지 않은 시료를 포함하여 단계 희석액을 TSA 플레이트에 도말합니다. 시료를 10⁻⁶까지 희석하고 플레이트를 37 °C에서 배양합니다. 도립 광학 현미경을 사용하여 여러 시야에서 비드의 직경을 측정합니다.

마우스 공격 접종 전, 비드의 직경은 100에서 200 micron 사이여야 합니다. TSA 플레이트의 colony forming unit 수를 측정하여 한천 비드 현탁액의 mL당 CFU 수를 결정하십시오. 그 후, 50 µL 내의 최적 접종량인 1~2 × 10⁶ CFU에 도달할 수 있도록 한천 비드의 부피를 mL당 2~4 × 10⁷ CFU로 조정하십시오.

케타민과 자일라진으로 미리 마취시킨 6~8주령의 수컷 마우스를 가열 패드 위에 배측으로 눕힌 후, 70% ethanol로 털을 소독합니다. 피부를 수직으로 절개하여 기관을 노출시킵니다. 그다음, 핀셋을 사용하여 기관을 덮고 있는 근육들을 분리합니다.

그런 다음 1 mL 주사기로 아가 비드 현탁액을 최대 50 µL까지 흡입합니다. 그 후, 카테터를 사용하여 기관을 삽관하고 아가 비드 현탁액이 담긴 1 mL 주사기를 카테터에 연결합니다. 주사기의 플런저를 천천히 밀어 비드가 폐로 이식되도록 합니다.

그다음 봉합 클립을 사용하여 절개 부위를 닫습니다. 이 단계에서는 안락사시킨 마우스를 배와 닿게 눕힌 후(supine position), 70% ethanol로 털을 소독합니다.

다음으로, 피부를 수직으로 절개하여 기관과 흉곽을 노출시킵니다. 그 후, 횡격막을 절개하여 폐를 노출시킵니다. 핀셋을 사용하여 기관 아래에 봉합사를 삽입하고 카테터로 기관 내 삽관을 실시합니다.

그 다음, 봉합사의 양 끝을 당겨 카테터를 기관에 고정하되, 실이 기관을 압박하지 않도록 주의하십시오. 이제 1 mL 시린지를 사용하여 세포 배양액 1 mL를 취해 카테터에 연결합니다. 시린지의 플런저를 밀어 폐를 세척한 후, 즉시 액체를 회수하여 15 mL 튜브에 보관하십시오.

배지 총 3 mL를 사용하여 이 단계를 세 번 반복한 후, 폐의 수집 및 분석을 위해 기관지폐포 세척액을 얼음 위에 보관하십시오. 마우스에서 폐를 적출합니다. 멸균된 PBS로 세척하십시오.

그 다음 엽을 분리합니다. 2 mL의 멸균 PBS가 담긴 라운드 바텀 튜브에 넣고 얼음에 보관합니다. 무균적으로 폐를 균질화하고 연속적으로 처리합니다.

균질액을 PBS로 1:10 비율로 희석합니다. 그다음, 희석하지 않은 시료를 포함하여 단계별 희석액을 TSA 플레이트에 도말하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 얼음에서 BAL 액체를 꺼내 도립 광학 현미경 하에서 Turk 용액으로 1:2 비율로 희석합니다.

분획 세포 수를 측정하기 위해 Burker 세포 계수 챔버에서 전체 세포 수를 측정합니다. BAL 액을 4°C에서 330 ×g로 8분 동안 원심분리합니다. 그다음, 상층액을 제거하고 10% fetal bovine serum이 포함된 세포 배양 배지에서 1 million cells/mL 농도로 펠렛을 재현탁합니다. 카드보드 필터가 중심을 향하도록 하여 현미경 슬라이드와 필터를 사이토스핀(cyto spin)의 적절한 슬롯에 배치합니다.

각 시료 150 µL를 시토스핀용 웰에 분주하고, 세포 원심분리기(cyto centrifuge)를 사용하여 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 세포 점적을 관찰하고, 염색 후 현미경으로 차등 계수를 수행할 수 있습니다. 이 그림은 PAO1 표준 균주와 RP73을 이용한 Pseudomonas aerogenosa의 만성 감염 시간 경과를 보여줍니다.

각 시점별 임상 균주. 히스토그램의 빨간색은 균혈증으로 인한 사망률 백분율을, 회색은 생존율 백분율을 나타내며, 흰색은 감염이 제거된 동물의 백분율을, 녹색은 만성 감염이 형성된 동물의 백분율을 나타냅니다. pseudomonas aerogen RP 73 임상 균주는 PA oh one 실험실 균주에 비해 만성 감염을 형성하는 효율이 더 높습니다.

생존한 마우스는 표시된 시점에 안락사시켰으며, 폐를 적출하여 균질화한 후 TSA 플레이트에서 배양하여 세균 부하량을 측정하였다. 마우스 폐 내 P oh one 및 RP 73 균주의 성장 곡선을 보면, 감염 후 3일째의 세균 양은 RP 73에 비해 P oh one에서 더 높게 나타났다. 이후 만성 감염이 확립되는 7일째부터는 두 균주 모두 폐당 10⁴에서 10⁵ CFU 사이에서 세균 부하량이 안정화되었으며, RP 73 임상 균주로 7일간 만성 감염을 유도한 후 BAL 액 내의 염증 세포 모집을 평가하였다.

RP 73에 감염된 마우스는 감염되지 않은 마우스에 비해 총 백혈구 수가 상당히 높습니다. 가장 많이 관찰되는 세포는 호중구이며, 이는 만성 감염에 대한 선천 면역 체계의 상당한 반응을 나타냅니다. 아래 상자에서 화살표는 사이토스핀 후 슬라이드 상의 한 지점에서 관찰되는 호중구와 대식세포를 가리킵니다.

rp. 73 임상 균주로 7일간 만성 감염시킨 생쥐 폐의 조직 절편에 대해 헤마토실린 및 에오신 염색을 수행한 결과입니다. 화살표로 표시된 비드는 기관지 내강에서 관찰되며, 박테리아 세포의 미세 군집이 보입니다. 감염된 부위의 기관지와 폐 실질은 대규모의 염증 세포 모집이 특징적으로 나타납니다.

감염되지 않은 마우스의 기도는 염증 세포가 없이 깨끗했던 반면, BES의 직경과 최종 농도는 매우 중요한 세부 사항입니다. 좋은 결과를 얻기 위해서는 냉각 단계 동안의 교반 속도가 비드 크기에 영향을 미치며, 초기 박테리아 양이 비드의 최종 희석 농도에 영향을 줄 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 마우스의 사망률은 낮고 만성 감염률은 높은 적절한 pseudomona 균주를 선택함으로써 사용되는 마우스의 수를 최소화할 수 있습니다.

마우스 감염 후 세균 수 측정이 수행됩니다. 또한, 세균 감염에 대한 궤양 반응을 연구하기 위해 기관지 내 총 세포 수 및 분획 세포 수의 염증 반응, VIR 수준, 액체 사이토카인 분석, 멜로퍼옥시다제 분석 및 조직학적 분석을 수행할 수 있습니다. 슈도모나스와 같은 기회감염성 병원균을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 장갑 착용, 생물안전작업대 내에서의 세균 취급, 멸균 기술 사용과 같은 주의 사항을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

적절한 동물 모델의 개발을 통해 새로운 항균 및 항염증 분자의 전임상 시험이 가능해졌습니다. 이는 낭성 섬유증 또는 기타 호흡기 질환 환자의 폐 감염에 대한 향후 치료적 개입을 위한 중요한 단계입니다.