배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

본 절차의 전반적인 목표는 뇌혈관 생성 및 신경혈관 상호작용을 연구하기 위해 배아 뇌에서 혈관 내피세포의 순수 배양액을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 배아 뇌에서 외막을 벗겨내고 두부를 분리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 수확한 조직을 해리, 여과 및 소화를 통해 단일 세포 현탁액으로 만드는 것입니다.

세 번째 단계는 CD 31 마이크로비즈를 사용하여 세포를 자기적으로 표지하는 것입니다. 마지막 단계는 자기 분리법을 통해 CD 31 표지 세포를 정제한 후 이를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 관찰 및 혈관 형성 분석을 통한 추가 연구를 위해 순수한 뇌실 주변 내피세포 집단이 생성됩니다.

이 방법은 세포 및 분자 메커니즘에 집중하는 연구에 도움이 될 것입니다. 뇌 분석의 경우, 뇌실 주변 혈관 내피 세포 간의 상호작용 및 신경 세포 유형과의 교차 신호 전달을 규명하는 도구로 활용될 수 있습니다. 또한 치료 목적의 분석 미션에서도 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

이 방법의 시연은 뇌 배아에서 내피세포의 순수 집단을 분리하고 배양하는 것과 관련된 일부 기술적 어려움을 해결하는 데 매우 중요합니다. 본 프로토콜을 위해, CD1 모체로부터 얻은 E 15 태아의 머리를 얼음처럼 차가운 PBS에 담가 실체 현미경 하에 준비합니다. 미세 마이크로팁 가위와 미세 핀셋을 사용하여 뇌를 제거합니다.

정교한 해부는 매우 중요하며, 이는 충분한 연습과 도구의 최적 상태 유지를 통해 가능해집니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 뇌를 단단히 잡고 마이크로팁 가위를 이용해 껍질 막을 벗겨냅니다. 이 단계는 전체 과정 중 가장 까다롭지만, 필요한 기술은 연습을 통해 습득할 수 있습니다.

그 다음 중뇌(mesencephalon)와 후뇌(metencephalon)를 제거합니다. 머리 부분을 분리합니다. 이어서, 껍질 막이 없는 상태로 머리 부분을 PBS 2 mL가 들어 있고 얼음 위에 놓인 35 mm 배양 접시로 옮깁니다.

모든 발톱을 단일 접시에 수집합니다. 먼저 메스 날을 사용하여 발톱을 1~2mm 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 해당 조직을 2mL의 완전 배지 DMEM이 들어 있는 15mL 튜브에 수집합니다.

1mL 피펫으로 덩어리가 사라지고 우유 빛깔의 현탁액이 얻어질 때까지 부드럽게 하지만 철저하게 조직을 분리합니다. 현탁액을 800에서 1000 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상온에서 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 재현탁합니다.

팰릿을 DS one이 포함된 DMEM에 현탁합니다. 이제 가벼운 파이펫팅을 사용하여 세포를 다시 분리하고 원심분리 단계를 반복합니다. 그런 다음 팰릿을 따뜻하게 데운 완전 DMEM에 재현탁합니다.

부유 세포를 70 micron 나일론 메쉬로 여과하고, 메쉬에 남은 세포 부분을 수집하여 collagenase와 DNase I이 포함된 2 mL의 DMEM에서 추가로 소화시킵니다. 몇 분간 대기한 후, 원심분리를 사용하여 조직을 세척하고 펠렛을 DMEM으로 재부유시킵니다. 세척된 수집물과 얼음 위에 보관해 둔 여과액을 하나로 합칩니다.

그다음 원심분리를 이용하여 완전 DMEM으로 혼합물을 세척하고 재현탁합니다. 이제 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고 자기 표지를 진행합니다. 본 프로토콜의 부피는 최대 10 million cells까지 적합합니다. 세포 수가 더 많은 경우에는 그에 맞춰 비율을 높여 조정하십시오.

먼저 세포 현탁액을 상온에서 300 G로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 완전히 흡입 제거하고 세포 펠릿에 차갑게 유지한 정제 버퍼 90 µL와 CD 31 결합 마이크로비즈 10 µL를 순차적으로 첨가합니다. 200 µL 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합하고, 라벨링의 특이성을 유지하기 위해 냉장고에서 15분 동안 현탁액을 배양하되 이 시간을 초과하지 않도록 합니다. 차갑게 유지한 정제 버퍼 1~2 mL를 첨가하고 300 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.

상층액을 제거하고 냉각된 정제 버퍼 500 microliters로 세포를 재현탁합니다. 이제 max separator의 자기장 내에 MS 컬럼을 장착합니다. 다음으로, 실온에서 정제 버퍼 500 microliters로 컬럼을 헹굽니다.

그런 다음 세포 현탁액을 컬럼에 도포합니다. 최대 2,000만 개의 세포까지 처리가 가능합니다. 라벨링되지 않은 세포가 포함된 모든 통과액(flow through)을 수집하여 폐기하십시오.

정제 버퍼 500 µL로 컬럼을 3회 세척합니다. 다음 정제 버퍼 분량을 추가하기 전에 항상 컬럼 저장조가 비어 있는지 확인하십시오. 이제 max separator에서 컬럼을 제거하여 15 mL 튜브 위에 놓습니다.

컬럼에 정제 버퍼 1 mL를 첨가하고, 제공된 플런저를 컬럼 플레이트에 강하게 밀어 넣어 자기 표지된 세포를 즉시 씻어냅니다. 씻어낸 세포는 collagen type I이 미리 코팅된 35 mm 배양 접시에 담습니다.

이제 37°C, 95% 산소 및 5% 이산화탄소로 설정된 배양기에서 ECCM을 사용하여 세포를 배양합니다. 배지는 4일마다 교체하십시오. 매일 현미경을 통해 배양 접시에서 성장하는 세포를 관찰하십시오.

위상차 광학 현미경으로 관찰한 결과, 뇌실주위 내피세포(PVE CS)의 표현형 특성은 1일차부터 12일차까지 변화합니다. 1일차에 배양 접시에 부착된 세포들은 5~8일 사이에 세포 분열의 특징적인 형태를 보입니다. PVE CS는 cobblestone 형태에서 내피세포의 전형적인 특징이자 체내(in vivo) 상태와 더 유사한 방추형 형태로 전이됩니다.

12일 차가 되면 PVEC 배양액이 완전히 밀집됩니다. 계대 배양 후에는 콜로니를 확장하기 위해 p vs를 쉽게 계대 배양할 수 있습니다.

다음의 혈관 내피세포 마커를 사용하여 혈관 내피세포 배양물의 순도가 100%임을 확인하였습니다: ISO lectin, von Willebrand factor, CD 31, PE-CAM-1 및 VE-cadherin. CD1 배아와 혈관 내피세포에서 GFP를 발현하는 tie2-GFP 배아로부터 준비된 PVECs의 고배율 이미지에서, ISO lectin으로 표지된 세포들이 공통적인 cobblestone 및 방추형 형태뿐만 아니라 일부 콜라겐 코팅 배양 접시에서는 가느다란 돌기를 가진 다각형 형태를 나타냈습니다. Matrigel이 없는 환경에서 PVECs는 생체 내 뇌실 주변 혈관 네트워크의 독특한 특성과 유사한 격자 패턴을 형성하였습니다.

이는 pve의 높은 혈관 형성 능력을 반영합니다. matrix gel matrix가 코팅된 배양 접시에 20,000개의 PVE CS를 첨가하여 혈관 형성 분석을 수행하였습니다. 이 PV Cs는 18시간 이내에 강력한 관 형성 능력을 보였습니다.

CD1 배아에서 분리한 PV를 Q dot 나노 결정으로 표지함으로써 이동, 운동성 형태, 세포 기능 분석뿐만 아니라 in vivo 실험을 포함한 pve CS의 장기 연구가 가능합니다. 이러한 나노 결정은 살아있는 세포의 세포질에 강렬하고 안정적인 형광을 전달합니다.

Pve EECS는 Cell Light Plasma Membrane과 같은 세포 추적자로 형질전환될 수 있습니다. 살아있는 세포 이미징 실험에서 세포 형태를 명확하게 시각화하기 위해 RFP back MAM 2.0을 사용하였습니다. Pve CS를 여러 배지에서 배양하였으며, 염색 전 위상차 현미경과 ISO selectin을 통해 세포 형태를 비교하였습니다.

ECCM에서 배양된 PV CS는 방추형 형태를 보였으며 12일째에 합류(confluent)되었으나, 쥐 뇌 혈관 내피 세포 성장 배지에서 배양된 pve CS는 매우 길쭉한 형태를 보였으며 20일째에 합류되었습니다. 반면, D-M-E-M-F 12 배지에서 배양된 PV CS는 방추형 형성 없이 평평하고 다각형인 형태만을 보였으며, 매우 빠르게 성장하여 4일째에 합류되었습니다.

PVEC는 표현형과 기능의 손실 없이 ECCM에서 최대 3대까지 배양되었습니다. 따라서 ECCM은 PVEC 배양에 선호되는 배지입니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 과정은 3시간 이내에 완료될 수 있습니다.

뇌실 주변 내피세포를 신경 전구세포와 공동 배양하는 것은 성인 뇌나 다른 기원의 내피세포보다 신경 발생 및 신경 세포 이동을 훨씬 더 효과적으로 자극할 가능성이 큽니다. 따라서 이러한 세포들은 다양한 상황에서 신경 기능의 회복을 돕는 데 유용할 수 있습니다.