Name: 배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 배우세요 배아 전뇌에서 CD31 마이크로비드를 이용한 자기 분리법으로 순수 내피 세포를 분리하고 배양하는 방법입니다. 이 기술은 뇌혈관신생 및 신경혈관 상호작용 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 정신 분열증 연구에 대한 국가 연합과 우울증 (NARSAD) 젊은 연구자 상과 건강의 국립 연구소 AV에 R01NS073635을 부여에 의해 지원되었다.

1. 시약 및 솔루션의 준비 <ol><li> 35mm 문화 요리의 코팅 : 콜라겐 타입 1 용액은 20 mM의 아세트산 (~ 100 mg의 단백질 / 유리 병)의 수용액으로 공급된다. 무균 조직 배양 등급의 물을 사용하여 0.01 %의 작업 농도로 콜라겐 용액의 적절한 볼륨을 희석. 1 실온 (RT)에서 3 ~ 4 시간 동안 콜라겐 솔루션의 ML 37 ° C, 또는 밤새 2-8 ° C에서와 코트 요리 코팅 접시에서 여분의 용액을 제거하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 미디어를 추가하기 전에 조직 문화 등급 물 또는 PBS와 함께 요리를 씻어. 코팅 요리는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 완전한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. (, 1 ml/100 ML 1X 농도) 10 % FBS와 항생제 항진균 솔루션 DMEM (500 ㎖) 보완. 전체 DMEM는 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 분취 DNA 분해 효소 I (0.001 ㎎ / ㎖)과의 DMEM (50 ㎖)을 준비하고, (D라고도MEM-DNA 분해 효소 I). </li><li> 콜라게나 제와 디스 파제 (DMEM-collagenase/dispase라고 함) (1 ㎎ / ㎖)로 DMEM의 또 다른 분취 액 (10 ㎖)을 준비한다. </li><li> EGF (5 μg)로 보충 내피 세포 배양 매체 (ECCM, 500 ㎖), 준비, 심전도 (100 mg)을하고 항생제 항진균 솔루션의 5 μL. ECCM은 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 사용하기 전에 모든 미디어를 Prewarm. </li><li> 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA와 PBS, pH를 7.2 : 정화 버퍼를 준비합니다. 차가운 버퍼를 유지 (2-8 ° C). </li></ol> 2. Telencephalon의 태아 및 해부 제거 실험 동물을 사용하는 모든 실험은 맥린 병원의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침을 준수하고 있습니다. <ol><li> 시간이 초과 임신 CD1 마우스 (배아 일 15)를 사용합니다. 질 플러그 발견의 날은 배아 일 0 (E0)로 간주됩니다. CD1 댐은 일반적으로 큰 새끼를 생산, 그래서 10 ~ 12 배의는 임신 댐에서 예상된다. </li><li> 자궁 절개술의 경우, 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 임신 한 쥐를 마취. 쥐 20 ~ 30의 G, 10 ㎖ / kg 케타민 / 자일 라진 마취 솔루션의 0.3 ML를 제공하고 그 고통을 확인하고 조난 마취의 복강 내 주사시 최소한의 것입니다. 주사를 손 구속을 사용합니다. </li><li> 발가락 핀치에 의해 깊은 마취를 확인합니다. 깊이 마취 생쥐에서 배아를 제거합니다. 바로 어머니로부터 제거시 각각의 배아 목을 벨. 얼음 차가운 PBS의 멸균 페트리 접시에 배아 머리를 놓습니다. </li><li> 2013 판 : 마취제를 과다 복용 (130 ㎎ / ㎏ 펜토 바르 비탈, IP), 동물의 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인과 일치 안락사를위한 방법으로 즉시 안락사에 의해 자궁 적출술을 따르십시오. </li><li> 스테레오 현미경, 미세 마이크로 팁 가위와 미세 집게로 머리에서 뇌를 제거합니다. 참고 : 높은 품질의 해부를이온 성공적으로 배아 뇌에서 pial 막을 제거하는 것이 필수적입니다. 이것은 연습에 의해 달성된다. 미세 집게와 마이크로 팁 가위는 좋은 해부를 가져 오기위한 중요한 도구입니다. </li><li> pial 막을 벗겨하는 두뇌와 마이크로 팁 가위에 확고한 그립을 얻을 수있는 집게를 사용합니다. 중뇌와 metencephalon를 제거하고 telencephalon을 격리 할 것. 얼음에 2 ㎖의 PBS와 35mm 배양 접시에있는 모든 배아에서 pial없는 telencephalon을 전송합니다. </li></ol> 3. 세포 격리 <ol><li> 메스 블레이드 1-2 밀리 조각으로 telencephalon을 말하다하고 완전한 DMEM 2 ㎖를 포함하는 15 ML 팔콘 튜브에 조직을 수집합니다. </li><li> 수풀이 사라지고 유백색 현탁액을 얻을 때까지 1 ㎖ 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 조직을 떼어 놓다. </li><li> 원심 분리기는 RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 세포를 분해. </li><li> 조심스럽게 CE 해리 부드럽게 DME​​M-DNA 분해 효소 I.에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거LLS 다시 실온에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 1 ㎖ 피펫과 원심 분리기를 사용하여. </li><li> 따뜻한 완전한 DMEM에서 펠렛을 재현 탁. 멸균 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 세포. 필터링 된 세포를 수집하고 얼음에 보관. </li><li> 메시에 보관 세포 일부를 수집하고 실온에서 1 ~ 2 분 동안 DMEM-collagenase/dispase (2 ml)로 더 소화. RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 원심 분리를 통해 DMEM-DNA 분해 효소 나 세포 배를 씻으십시오. 단계 3.5에서 수집 한 필터링 된 세포와이 세포 해변. 완전한 DMEM에 한 번 전체 세포를 씻으십시오. 휴대폰 번호 및 자기 라벨 단계를 결정하기 위해 진행합니다. 주 : 자기 라벨링 전에 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요하다. </li></ol> 4. 자기 레이블 <ol><li> 이 프로토콜은 10 7 세포의 자기 라벨을 보여줍니다. 세포 수의 경우보다 낮은 10 7은 동일한 시약 볼륨을 사용하는 세포 수에 대한보다 큰 10 7, 모든 시약 볼륨과 전체 볼륨을 확장이에 따라 (예를 들어, 2 × 10 7 합계 셀에 대한 모든 지시 시약의 두 배 볼륨을 사용). 얼음의 모든 시약 및 세포를 유지합니다. </li><li> 혈구와 세포 수를 결정합니다. </li><li> RT에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. </li><li> CD31 마이크로 비즈의 10 μL 다음 세포 펠렛을 정화 버퍼의 90 μl/10 7 세포를 추가합니다. 제조사에 의해 제공된 마이크로 비드 항 마우스 CD31 항체 단클론 접합된다. </li><li> 잘 섞어 냉장고에 15 분 동안 품어. 참고 : 자기 라벨 동안 높은 온도 및 / 또는 더 긴 배양 시간이 비특이적 결합이 발생할 수 있습니다. </li><li> 10 분 300 XG에서 정화 버퍼와 원심 분리기의 1-2 ml/10 7 세포를 추가하여 세포를 씻으십시오. 정화 버퍼 500 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 자기 분리 또는 정제 단계로 넘어갑니다. </li></ol> 5. 푸rification <ol><li> MACS 분리기의 자기 분야에서 MS의 열을 놓습니다. </li><li> 정화 버퍼 500 μL에 열을 씻어. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 높은 세포 수는 열을 방해 할 수 있으므로 MS의 열을 셀의 해당 번호를 넣습니다. 주의 : 각 MS의 열은 열을 사용, 높은 세포 수에 대한 2 × 10 7 세포의 최대 수를 수용 할 수 있습니다. </li><li> 수집 및 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 정화 버퍼 500 μL로 3 회 열을 씻으십시오. 세척 단계에서, 열 저장 후속 정화 버퍼 분주을 추가하기 전에 비어 있는지 확인합니다. </li><li> MACS 분리기에서 열을 제거하고 15 ML 팔콘 튜브에 놓습니다. </li><li> 플런저는 MS의 칼럼과 함께 제공됩니다. 피펫 MS의 칼럼에 즉시 정화 버퍼의 1 ㎖를 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지 세포를 세척하십시오. </li><li> 플레이트 CEL콜라겐 1 형 프리 코트와 95 % O 2 5 % CO 2와 37 ° C로 설정 인큐베이터에 ECCM의 세포를 성장 35mm 배양 접시에 LS. </li><li> 4 일마다 매체를 변경합니다. 요리가 합류 할 때 10~12일 후 실험 또는 하위 문화에 대한 PVECs를 사용합니다. </li></ol> 6. PV ECS의 서브 컬쳐 <ol><li> ECCM을 제거하고 멸균 PBS의 1 ~ 2 ㎖로 PVECS의 단층을 씻어. </li><li> 조심스럽게 세포 단일 층을 포함하는 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 5-7 분 내에 세포 접시의 표면으로부터 분리된다. </li><li> 세포를 분리 한 후, 즉시 트립신 억제제의 동량을 추가하고 여러 번 씹다. </li><li> 멸균 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송합니다. 5 분 동안 500 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 예비 가온 ECCM의 1 ml의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 문화, 메신저를 확장하기위한 세포를 씨앗노화 또는 다른 분석. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
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<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

PVEC의의는 더 생리학 관련 신경 혈관의 상호 작용에 초점을 맞추고 연구를위한 다른 조직 소스에서 성인 뇌의 내피 세포와 내피보다도 치료 가능성이있다. PVEC 준비, 그것은 죽은 세포가 CD31 마이크로 비드에 비특이적으로 결합 할 수 있기 때문에 좋은 가능성을 달성하기 위해 빠른 작업 박리 중요한 시작입니다. 단일 세포 현탁액은 종래 자기 라벨링 단계에 도달하지 않은 경우 세포 덩어리가 열을 막는 것이므로 또, 이것은, 문제가 발생할 것이다. 이 방법의 장점은 자성 비드의 세포를 분리하는 트립신으로 인큐베이션 대한 필요, EC 제제 4,7 다른 마그네틱 비드 기반의 분리 방법에 사용되는 시간과 종종 어려운 공정이 없다는 점이다. 또,이 분리 방법은 배아 뇌 조직의 대량을 필요로하지 않는다. PVEC의 일관 입히는 Appr있는 단일 정해진 임신 마우스를 이용하여 제조 할 수있다oximately 십이일, 계대 배양하고, 시험관의 다양한 생체 내 실험에 사용 하였다. ...

혈관, 신경 및 신경 세포의 이주는 중추 신경계 (CNS) 개발, 수리 및 재생에 중요한 이벤트입니다. 여러 우아한 연구는 내피 세포 용해 인자의 방출을 통해 직접 접촉에 의해 신경 세포의 증식과 그 반대를 자극하는 것으로 나타났습니다. 우리는 호기심이 신경 전구 세포 / 신경 줄기 세포가 배아의 뇌에서 분리하는 동안 이러한 연구 1-3의 대부분에서, 그들은 성인의 뇌, 다른 성인 조직 소스, 또는 내피 세포 라인에서 내피 세포와 공 배양 된 것으로 나타났습니다. 이 부분에서 배아 뇌에서 혈관 내피 세포의 순수한 인구를 분리하고 배양과 관련된 기술적 인 문제로 인해 수 있습니다. 그러나, 혈관, 신경 및 신경 세포의 이동은 정상 성인의 뇌에 비해 배아 뇌의보다 강력한 규모의 명령에서 발생하는 동시 이벤트입니다. embryoni의 뇌실 주위 혈관 네트워크C의 전뇌 (telencephalon)는 기저핵 primordium 내에 위치한 용기에서 유래 및 배아 일 11 (E11) 4,5에 의해 telencephalon을 등쪽에 복부에서 질서 그라데이션의 형태로 개발하고 있습니다. 뇌실 주위 혈관 네트워크의 혈관이 혈관 따위의 기원, 해부학 적 위치, 성장 패턴 및 개발 규제 4.5에 따라 pial 혈관에서 구별된다. 뇌실 주위 혈관의 그라데이션의 전파 방향은 telencephalic 가로 neurogenetic 그라데이션과 일치합니다. telencephalon 내에서 뇌실 주위 혈관의 그라데이션 및 마이그레이션 GABA 신경 세포의 기울기가 접선 ​​방향으로뿐만 아니라 공간적으로 6 겹칩니다. 타이밍에 대하여, 혈관 신생 구배는 약 하루 neurogenetic 구배 및 GABA 뉴런 구배 앞서있다. 따라서, 뇌실 주위 내피 세포는 공간적이며 시간적 잘 telencephalic 신경을 지원하는 중요한 단서를 제공하는 위치 결정신경 세포의 이주 4,6. 따라서, 신경 전구 세포 및 / 또는 신경 세포와 공 배양 실험에서 배아 뇌실 주위 내피 세포의 사용은 뇌 혈관의 상호 작용을 공부하고 신경 퇴행성 질환이나 허혈성 / 외상성 뇌 손상의 치료를위한 새로운 수단을 개발하기위한보다 유리한 모델을 제공 할 것이다. 우리는 상피 세포의 오염을 제한 할뿐만 아니라, 분자 및 뇌실 혈관 네트워크 4,6 (pial되는 EC 구별하기 칭했다 PVECs)의 내피 세포에서 기능적으로 구별되는 pial 내피 세포를 분리하는 것뿐만 아니라, pial 막 제거의 중요성을 강조 . 여기에서, 우리는 우리가 일상적으로 PVECs의 풍부하고 순수한 수율을 얻을 수 있도록 실험실에서 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 내피 세포는 하나의 정해진 임신 마우스에서 분리 된 배아 forebrains에서 준비가되어 있습니다. 그들은 나중에 사용하기 위해 성공적으로 확장 계대 배양, 아래로 고정 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>시그마</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐, 쥐 꼬리에서 추출한 타입 1 용액&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>품질 생물학적 제제</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MS 칼럼</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD31 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS 멀티 스탠드</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 여과기 70 &micro; m</td><td>BD 생명과학</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>항생제 및 항진균 용액</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 / 디스 파제</td><td>로슈</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>론자</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35mm 배양 접시</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 팔콘 튜브&nbsp;</td><td>BD 생명과학</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50ml 팔콘 튜브</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ECCM 키트</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>키트는 내피 세포 성장 보충제, EGF 및 대두 트립신 억제제</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보충제 (ECGS)</td>를 포함합니다. <td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>셀 응용</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>조직 배양 등급 물</td><td>생명 기술</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% 트립신</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마트리겔</td><td>BD 바이오사이</td>언스 <td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 세포 라벨링 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight 플라즈마 멤브레인-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비오틴화 이소렉틴 B4 항체</td><td>시그마</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-폰 윌레브란트 팩터</td><td>시그마</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-CD31/PECAM-1</td><td>BD 파밍겐</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td>를 <td>사용한 VECTASHIELD 하드셋 마운팅 미디어</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>케타민</td><td>버틀러 Schein 동물 건강 공급</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>자일라진</td><td>로이드 연구소</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 펜치</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>세밀한 마이크로팁 가위</td><td>Roboz 수술 기구</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

배아 뇌 혈관 내피 세포는 혈관 및 신경 혈관 개발 및 상호 작용의 연구에 중요한 도구 역할을 할 수 있습니다. 배아 전뇌, pial 뇌실 주위 백질의 두 혈관 네트워크는 공간적 특징이며, 서로 다른 기원과 성장 패턴이 있습니다. pial과 뇌실 주위 혈관 네트워크에서 내피 세포는 고유의 유전자 발현 프로파일과 기능을 가지고 있습니다. 여기서 우리는 배아 전뇌 (telencephalon)의 뇌실 주위 혈관 네트워크 (PVECs)에서 내피 세포의 순수한 인구의 분리, 배양 및 검증을위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 이 방법에서는, 배아 일 15 쥐에서 얻은 pial 막의없는 telencephalon는, 다진 콜라게나 / 디스 파제로 소화, 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분산. PVECs은 강한 자석을 사용하여 마이크로 비드에 접합 anti-CD-31/PECAM-1 항체와 긍정적 인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정제된다분리 방법. 그들이 합류하고 추가 계대 배양 될 때까지 정제 된 세포는 내피 세포 배양 배지에서 콜라겐 1 코팅 된 배양 접시에서 배양한다. 위상차 광학 현미경과 형광 현미경에 의해 시각으로 PVECs,이 프로토콜 전시 조약돌 스핀들 모양의 표현형을 얻을. PVEC 문화의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다. 우리 손에,이 방법은 확실하고 일관되게 PVECs의 순수한 인구를 산출한다. 이 프로토콜은, 전뇌 혈관 신생에 기계적인 통찰력을 얻고 PVEC 상호 작용 및 신경 세포 유형과 상호 대화를 이해하고 치료 혈관 신생에 대한 엄청난 잠재력을 보유하기위한 연구를 도움이 될 것입니다.

하루 1-12 PVECs의 표현형 특성은 위상 대비 광학 현미경 (그림 2)으로 표시됩니다. 세포 분열 (그림 2A)의 1 일 쇼 형태 특성에 접시에 부착 된 세포. 5-8일 사이에 자갈 돌에서 PVECs의 전환은 내피 세포 (그림 2B 및 2C)의 생체 상태에 더 가깝다 전형적인 모양의 형태를 스핀들. 하루 12 PVEC 문화 전체 합류 (그림 2D)을 달성한다. PVECs 식민지 (그림 2E-G)를 확장하기 쉽게 계대 배양 할 수있다. 내피 세포 배양의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다 - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, 폰 빌레 브란트 인자 (vWF가) 및 VE-cadherin의와 하위 문화 (그림 2H-K) 후 백 %로 측정되었다. <p class="jove_co...

이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다.

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

본 절차의 전반적인 목표는 뇌혈관 생성 및 신경혈관 상호작용을 연구하기 위해 배아 뇌에서 혈관 내피세포의 순수 배양액을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 배아 뇌에서 외막을 벗겨내고 두부를 분리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 수확한 조직을 해리, 여과 및 소화를 통해 단일 세포 현탁액으로 만드는 것입니다.세 번째 단계는 CD 31 마이크로비즈를 사용하여 세포를 자기적으로 표지하는 것입니다. 마지막 단계는 자기 분리법을 통해 CD 31 표지 세포를 정제한 후 이를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 관찰 및 혈관 형성 분석을 통한 추가 연구를 위해 순수한 뇌실 주변 내피세포 집단이 생성됩니다.이 방법은 세포 및 분자 메커니즘에 집중하는 연구에 도움이 될 것입니다. 뇌 분석의 경우, 뇌실 주변 혈관 내피 세포 간의 상호작용 및 신경 세포 유형과의 교차 신호 전달을 규명하는 도구로 활용될 수 있습니다. 또한 치료 목적의 분석 미션에서도 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.이 방법의 시연은 뇌 배아에서 내피세포의 순수 집단을 분리하고 배양하는 것과 관련된 일부 기술적 어려움을 해결하는 데 매우 중요합니다. 본 프로토콜을 위해, CD1 모체로부터 얻은 E 15 태아의 머리를 얼음처럼 차가운 PBS에 담가 실체 현미경 하에 준비합니다. 미세 마이크로팁 가위와 미세 핀셋을 사용하여 뇌를 제거합니다.정교한 해부는 매우 중요하며, 이는 충분한 연습과 도구의 최적 상태 유지를 통해 가능해집니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 뇌를 단단히 잡고 마이크로팁 가위를 이용해 껍질 막을 벗겨냅니다. 이 단계는 전체 과정 중 가장 까다롭지만, 필요한 기술은 연습을 통해 습득할 수 있습니다.그 다음 중뇌(mesencephalon)와 후뇌(metencephalon)를 제거합니다. 머리 부분을 분리합니다. 이어서, 껍질 막이 없는 상태로 머리 부분을 PBS 2 mL가 들어 있고 얼음 위에 놓인 35 mm 배양 접시로 옮깁니다.모든 발톱을 단일 접시에 수집합니다. 먼저 메스 날을 사용하여 발톱을 1~2mm 크기의 조각으로 잘게 다집니다. 해당 조직을 2mL의 완전 배지 DMEM이 들어 있는 15mL 튜브에 수집합니다.1mL 피펫으로 덩어리가 사라지고 우유 빛깔의 현탁액이 얻어질 때까지 부드럽게 하지만 철저하게 조직을 분리합니다. 현탁액을 800에서 1000 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상온에서 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 재현탁합니다.팰릿을 DS one이 포함된 DMEM에 현탁합니다. 이제 가벼운 파이펫팅을 사용하여 세포를 다시 분리하고 원심분리 단계를 반복합니다. 그런 다음 팰릿을 따뜻하게 데운 완전 DMEM에 재현탁합니다.부유 세포를 70 micron 나일론 메쉬로 여과하고, 메쉬에 남은 세포 부분을 수집하여 collagenase와 DNase I이 포함된 2 mL의 DMEM에서 추가로 소화시킵니다. 몇 분간 대기한 후, 원심분리를 사용하여 조직을 세척하고 펠렛을 DMEM으로 재부유시킵니다. 세척된 수집물과 얼음 위에 보관해 둔 여과액을 하나로 합칩니다.그다음 원심분리를 이용하여 완전 DMEM으로 혼합물을 세척하고 재현탁합니다. 이제 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고 자기 표지를 진행합니다. 본 프로토콜의 부피는 최대 10 million cells까지 적합합니다. 세포 수가 더 많은 경우에는 그에 맞춰 비율을 높여 조정하십시오.먼저 세포 현탁액을 상온에서 300 G로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 완전히 흡입 제거하고 세포 펠릿에 차갑게 유지한 정제 버퍼 90 µL와 CD 31 결합 마이크로비즈 10 µL를 순차적으로 첨가합니다. 200 µL 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합하고, 라벨링의 특이성을 유지하기 위해 냉장고에서 15분 동안 현탁액을 배양하되 이 시간을 초과하지 않도록 합니다. 차갑게 유지한 정제 버퍼 1~2 mL를 첨가하고 300 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.상층액을 제거하고 냉각된 정제 버퍼 500 microliters로 세포를 재현탁합니다. 이제 max separator의 자기장 내에 MS 컬럼을 장착합니다. 다음으로, 실온에서 정제 버퍼 500 microliters로 컬럼을 헹굽니다.그런 다음 세포 현탁액을 컬럼에 도포합니다. 최대 2,000만 개의 세포까지 처리가 가능합니다. 라벨링되지 않은 세포가 포함된 모든 통과액(flow through)을 수집하여 폐기하십시오.정제 버퍼 500 µL로 컬럼을 3회 세척합니다. 다음 정제 버퍼 분량을 추가하기 전에 항상 컬럼 저장조가 비어 있는지 확인하십시오. 이제 max separator에서 컬럼을 제거하여 15 mL 튜브 위에 놓습니다.컬럼에 정제 버퍼 1 mL를 첨가하고, 제공된 플런저를 컬럼 플레이트에 강하게 밀어 넣어 자기 표지된 세포를 즉시 씻어냅니다. 씻어낸 세포는 collagen type I이 미리 코팅된 35 mm 배양 접시에 담습니다.이제 37°C, 95% 산소 및 5% 이산화탄소로 설정된 배양기에서 ECCM을 사용하여 세포를 배양합니다. 배지는 4일마다 교체하십시오. 매일 현미경을 통해 배양 접시에서 성장하는 세포를 관찰하십시오.위상차 광학 현미경으로 관찰한 결과, 뇌실주위 내피세포(PVE CS)의 표현형 특성은 1일차부터 12일차까지 변화합니다. 1일차에 배양 접시에 부착된 세포들은 5~8일 사이에 세포 분열의 특징적인 형태를 보입니다. PVE CS는 cobblestone 형태에서 내피세포의 전형적인 특징이자 체내(in vivo) 상태와 더 유사한 방추형 형태로 전이됩니다.12일 차가 되면 PVEC 배양액이 완전히 밀집됩니다. 계대 배양 후에는 콜로니를 확장하기 위해 p vs를 쉽게 계대 배양할 수 있습니다.다음의 혈관 내피세포 마커를 사용하여 혈관 내피세포 배양물의 순도가 100%임을 확인하였습니다: ISO lectin, von Willebrand factor, CD 31, PE-CAM-1 및 VE-cadherin. CD1 배아와 혈관 내피세포에서 GFP를 발현하는 tie2-GFP 배아로부터 준비된 PVECs의 고배율 이미지에서, ISO lectin으로 표지된 세포들이 공통적인 cobblestone 및 방추형 형태뿐만 아니라 일부 콜라겐 코팅 배양 접시에서는 가느다란 돌기를 가진 다각형 형태를 나타냈습니다. Matrigel이 없는 환경에서 PVECs는 생체 내 뇌실 주변 혈관 네트워크의 독특한 특성과 유사한 격자 패턴을 형성하였습니다.이는 pve의 높은 혈관 형성 능력을 반영합니다. matrix gel matrix가 코팅된 배양 접시에 20,000개의 PVE CS를 첨가하여 혈관 형성 분석을 수행하였습니다. 이 PV Cs는 18시간 이내에 강력한 관 형성 능력을 보였습니다.CD1 배아에서 분리한 PV를 Q dot 나노 결정으로 표지함으로써 이동, 운동성 형태, 세포 기능 분석뿐만 아니라 in vivo 실험을 포함한 pve CS의 장기 연구가 가능합니다. 이러한 나노 결정은 살아있는 세포의 세포질에 강렬하고 안정적인 형광을 전달합니다.Pve EECS는 Cell Light Plasma Membrane과 같은 세포 추적자로 형질전환될 수 있습니다. 살아있는 세포 이미징 실험에서 세포 형태를 명확하게 시각화하기 위해 RFP back MAM 2.0을 사용하였습니다. Pve CS를 여러 배지에서 배양하였으며, 염색 전 위상차 현미경과 ISO selectin을 통해 세포 형태를 비교하였습니다.ECCM에서 배양된 PV CS는 방추형 형태를 보였으며 12일째에 합류(confluent)되었으나, 쥐 뇌 혈관 내피 세포 성장 배지에서 배양된 pve CS는 매우 길쭉한 형태를 보였으며 20일째에 합류되었습니다. 반면, D-M-E-M-F 12 배지에서 배양된 PV CS는 방추형 형성 없이 평평하고 다각형인 형태만을 보였으며, 매우 빠르게 성장하여 4일째에 합류되었습니다.PVEC는 표현형과 기능의 손실 없이 ECCM에서 최대 3대까지 배양되었습니다. 따라서 ECCM은 PVEC 배양에 선호되는 배지입니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 이 과정은 3시간 이내에 완료될 수 있습니다.뇌실 주변 내피세포를 신경 전구세포와 공동 배양하는 것은 성인 뇌나 다른 기원의 내피세포보다 신경 발생 및 신경 세포 이동을 훨씬 더 효과적으로 자극할 가능성이 큽니다. 따라서 이러한 세포들은 다양한 상황에서 신경 기능의 회복을 돕는 데 유용할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

이 비디오는 밀도 구배 원심분리와 효소 소화 메호드의 조합을 사용하여 쥐의 뇌에서 미세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 미세혈관은 콜라겐과 피브로넥틴 매트릭스로 사전 코팅된 배양 플라스크에서 배양하여 내피 세포 콜로니를 얻을 수 있습니다.

쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포를 뇌 내피 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다.

유도 만능 줄기 세포에서 뇌 내피 세포 생성

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

배우세요 배아 전뇌에서 CD31 마이크로비드를 이용한 자기 분리법으로 순수 내피 세포를 분리하고 배양하는 방법입니다. 이 기술은 뇌혈관신생 및 신경혈관 상호작용 연구에 필수적입니다.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

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