SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 합성 미세혈관 네트워크를 사용하여 단일 실험으로부터 세포 입자 접착의 전단 접착 맵(shear adhesion map)을 얻는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 장치를 이번 실험의 대상 단백질인 avadon으로 코팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 생체 내 전단 속도에서 비오틴화된 입자들을 장치 내로 주입하며, 이 입자들은 국소 전단 속도에 따라 서로 다른 패턴으로 avadon이 코팅된 장치에 결합합니다.

다음으로, 네트워크 내의 전단 속도 값에 대해 컴퓨터로 생성된 데이터베이스를 사용하여 입자의 전단 접착 맵을 생성하기 위해 결합된 입자의 수를 측정합니다. 결과에 따르면, 단 한 번의 실험으로 전단 접착 맵을 얻을 수 있어 기존의 평행 플레이트 흐름 챔버(parallel plate flow chambers)와 비교하여 시간과 시약을 크게 절약할 수 있음을 보여줍니다. 선형 흐름 채널과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 단일 실험에서 전단 접착 맵을 생성할 수 있어 비용과 시간을 대폭 절감할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 약물 전달체가 원하는 표적과 결합하는 능력과 같이, 약물 전달 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저희는 유체 조건 하에서 세포의 특정 병변을 이해하기 위해 패들 플레이트 유동 챔버(paddle plate flow chambers)를 사용하던 중에 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 다만, 이 분석법의 주된 목적은 입자와 세포 접착에 대한 기본적인 통찰을 제공하는 것입니다.

syn vivo 플랫폼은 암 및 중추신경계(CNS) 전달, 감염 및 염증, 혈전증 및 미세혈류 기능 장애와 같은 다양한 다른 시스템에 적용될 수 있습니다. 미세유체 장치 단계는 학습하기 어렵고, 적은 샘플 부피에 익숙해져야 하며, 기포 형성을 방지하기 위한 최선의 방법들을 시각적으로 전달하는 것이 더 효과적이므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차 시연은 저희 연구실의 연구원인 Ashley Smith가 진행하겠습니다.

SynVivo SMN 미세유체 장치는 두 세트의 평행 포트로 구성되어 있으며, 하나는 표면 코팅제, 작용기 또는 안착시킬 세포를 흘려보내기 위한 것이고, 다른 하나는 분석을 수행하기 위한 것입니다. 우선 장치를 멸균 탈이온수가 담긴 페트리 접시에 완전히 담근 후, 접시를 진공 챔버에 넣습니다. 장치의 채널 내에서 모든 공기가 제거될 때까지 건조 공정을 수행하십시오.

장치를 물에서 꺼내기 전까지 약 15분 정도 소요됩니다. 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 물로 프라이밍된 tigon 튜빙을 장치의 각 포트에 삽입하십시오. 튜빙의 길이는 약 1인치여야 합니다.

이제 피펫이나 주사기를 사용하여 장치를 물에서 꺼낼 수 있습니다. 하나의 유입 포트 튜브 하단 주변에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 튜브를 조심스럽게 제거합니다.

물방울이 장치 내부로 공기가 유입되는 것을 방지할 것입니다. 다음으로, 20 µg/mL 농도의 avadon이 충전된 1 mL 주사기를 준비하십시오. 주사기를 24 gauge 스테인리스 스틸 바늘 및 튜빙에 연결하십시오. 사용하지 않는 입구 포트는 조 클램프(jaw clamp)로 고정하십시오.

튜브를 장치의 유입구 포트에 삽입하십시오. 장치 전체에 완전히 관류될 수 있도록 avadon을 1 µL/min의 유속으로 10분 동안 주입하십시오. 유량 흐름 시간이 종료되면.

모든 튜브를 조 클램프로 고정하고 장치를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 장치가 상온에 도달하도록 둡니다. 그 다음, 전동 스테이지와 고성능 카메라가 장착된 도립 형광 현미경 위에 장치를 놓으십시오.

인산염 완충 식염수(PBS)에서 2 µm 비오틴화 입자가 mL당 500만 개 농도로 포함된 용액을 준비합니다. 해당 입자를 1 mL 주사기에 충전합니다. PBS가 담긴 두 번째 1 mL 주사기를 준비합니다.

각 시린지를 시린지 펌프에 장착한 다음, 피페터 시린지를 사용하여 니들과 튜빙에 연결합니다. 유입구 포트 튜빙의 하단 주변에 물 한 방울을 떨어뜨리고, 장치 코팅에 사용된 튜빙을 조심스럽게 제거합니다. 비오틴화 입자용 튜빙과 PBS용 튜빙을 각각의 유입구 포트에 조심스럽게 삽입합니다.

그런 다음 2.5 µL/min의 유속으로 비오틴화된 입자를 주입하기 시작합니다. 입자가 처음 나타나는지 현미경의 입구 포트를 모니터링하십시오. 타이머를 시작하고 3분 동안 흐름을 유지합니다.

3분이 지나면 비오틴화 입자의 흐름을 멈춤과 동시에 PBS를 2.5 µL/min의 유속으로 흘려줍니다. 결합되지 않은 입자들을 씻어내기 위해 PBS가 장치 내에 3분 동안 흐르게 합니다. 이미지 획득을 시작하려면, 이미징 소프트웨어의 광범위 이미지 스캔(scan large image) 기능을 사용하여 장치 전체의 이미지를 획득한 다음, 장치 내의 분기점에 순차적으로 번호를 매기고 채널 직경의 2배 크기로 원형 관심 영역(area of interest)을 설정합니다.

이 경우, 채널 직경이 100 microns이므로 관심 영역(area of interest)의 직경을 200 microns로 설정하십시오. 이미징 소프트웨어의 자동 계수 기능을 사용하여 각 관심 영역 내의 입자 수를 스프레드시트로 내보내십시오. 마찬가지로, 자동 계수 기능을 사용하여 장치 전체의 입자 수를 내보내십시오.

CFD 시뮬레이션을 수행하고 그 결과를 데이터베이스에 저장하여 추가 분석에 활용합니다. 결과에 포함된 정보에는 벽 전단율, 입자 플럭스 속도 및 장치 부착 여부가 포함됩니다. 여기의 정보는 정의된 입자 농도 입력값에 따라 관심 영역별로 부착되는 입자의 수를 결정하는 데 사용됩니다.

전단 접착 맵(shear adhesion map)을 생성하려면, 마지막 단계로 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 접착 백분율을 계산하십시오. 네트워크의 각 분기점에서의 전단 속도와 접착 백분율 값을 사용하여 전단 접착 맵을 도식화하십시오. 이 이미지는 2 µm 비오틴화 입자가 결합된 후의 전형적인 avidan 코팅 syn vivo SMN 장치를 보여줍니다.

입자들이 네트워크의 분기점 근처에 우선적으로 부착된다는 점에 유의하십시오. syn vivo SMN 네트워크 내의 번호가 매겨진 분기점들은 여기에서 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 장치의 CFD 모델을 통해 생성된 샘플 벽 전단 응력 맵입니다.

장치 내의 전단율(shear rate)은 생체 내 미세혈관에서 관찰되는 것과 같이 250 inverse seconds에서 15 inverse seconds까지 다양하게 나타납니다. 선형 미세유체 채널은 각 유량에 대해 일정한 전단율을 제공하므로, 이러한 가변적인 전단율을 동시에 구현할 수 없다는 점에 유의하십시오. 네트워크의 각 분기점에서 전단율 값을 나타낸 여기 그래프를 보면, 전단율 패턴이 복잡하며 선형 유동 채널과 달리 단순한 해석적 관계로 얻을 수 없음을 알 수 있습니다.

또한, 동일한 전단 빈(sheer bin)에 속하는 여러 분기점이 네트워크 내에 존재하며, 이는 제시된 데이터의 통계적 신뢰도를 높여줍니다. 다음은 네트워크 내 입자 플럭스에 대한 CFD 분석의 샘플 결과이며, 이는 실험 네트워크의 가지와 분기점에서 입자 플럭스를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 syn vivo SMN 실험에서 계산된 전단 접착 맵(sheer adhesion map)은 선형 채널 실험에서 얻은 전단 접착 맵에서 관찰된 것과 동일한 역관계(inverse relationship)를 따릅니다. 하지만 SynVivo 어세이를 사용하면 단 한 번의 실험만으로 이러한 전단 맵을 생성할 수 있는 반면, 선형 채널의 경우에는 여러 번의 실험 실행이 필요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 실험을 통해 전단 접착력을 생성하기 위해 SynVivo SMN 장치를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 실험을 수행할 때, SynVivo SMN 미세유체 장치가 개발된 이후 기포가 유입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 기술은 염증 분야의 연구자들이 단일 실험에서 다양한 전단 속도에 따른 백혈구-내피세포 상호작용을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 차세대 장치에서는 현재로서는 불가능한 백혈구의 롤링, 접착 및 이동을 단일 분석법으로 연구할 수 있을 것입니다.

이 절차에 따라 약물, 약물 전달체 및 세포의 부착을 조사하는 다른 방법들을 수행하여, 세포-세포, 세포-약물 및 약물 전달체 부착에 미치는 흐름의 생리학적 영향과 같은 질문들을 조사할 수 있습니다.