Name: 형광 현장에서 혼성화 (FISH) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 배우세요 형광 현장에서 혼성화(FISH) 기법으로 곤충과 식물 조직 내 바이러스 및 박테리아를 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 전체 마운트와 미세절단에서 mRNA 시각화에도 적용 가능하여 병원체 동역학 연구에 활용됩니다.

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Ghanim 실험실에서 연구는 더 연구 보조금에 의해 지원되지 않았다. 독일 - 이스라엘 재단 (GIF)에서 908-42.12/2006는, 아니 부여합니다. IS-4062-07 미국 - 이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금 (BARD), 연구 보조금 아니요. MG 이스라엘 과학 재단 (ISF)에서 884 / 07

1. FISH 분석을위한 일반 가루이, 식물, 그리고 바이러스의 준비 <ol><li> 후면 B와 Q 생물 형면 모종 (고십 피움 히르 수툼 L. 이력서. 동명왕)에 가루이 및 25 ± 2 ° C, 상대 습도 60 %의 표준 조건 하에서 곤충 방지 케이지와 성장 객실 내부에 유지하고, 14 시간 조명 / 10 시간 어두운 광주. </li><li> 앞에서 설명한 15-19로 endosymbiont 특정 프라이머를 이용하여 endosymbionts 감염을 테스트하기 위해 PCR을 수행합니다. </li><li> 상업 보육 또는 식물 토마토 씨앗에서 토마토 모종 (까 esculentum 이력서. 비프 스테이크)를 구입. </li><li> 식물이 TYLCV 15 가루이 매개 접종에 가장 적합한 연령 (섹션 아래 4.1 참조), 네 사실 잎의 단계에 도달 할 때까지 상기 한 바와 같은 사육 조건에서 유지한다. </li></ol> 2. 엔도 해충 처리, 고정, 프로브 디자인, 하이브리드 및 시각화공생 물고기 <ol><li> 면 공장에서 흡입 10 성인 가루이를 수집, 또는면 잎에서 10 제 3 또는 제 4 령 약충을 선택합니다. </li><li> 즉시 에펜 도르프 튜브 내부 Carnoy의 정착 (클로로포름 에탄올 빙초산 6:3:1 권 / 권)에 몰두. (바람직 야간) 야간 2 시간 동안 수정. </li><li> 완전히 정착을 제거하고 2 시간 동안 에탄올에 6 %의 H 2 O 2의 탈색. </li><li> 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 샘플을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다. </li><li> 디자인 프로브 각 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자를 기반으로 보완 역 DNA 프라이머. 프로브를 설계 할 경우, 계정에 PCR 프라이머를 설계 같은 고려 사항을. 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용 BTP1 5&#39;-Cy5에-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, 5&#39;-Cy3가 사포닌 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-Cy3가 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;및 5&#39;-Cy3가 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;를 각각 Portiera, 리케차, Hamilonella 및 Arsenophonus, 특정 타겟팅. </li><li> ML 당 하이브리드 버퍼에 어둠 속에서 하룻밤 샘플을 교배 (20 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 0.9 M의 NaCl, 0.01 % [중량 / 부피 나트륨 도데 실 황산, 30 % [권 / 권] 포름 아미드) 10 pmol의를 포함하는 형광 프로브 . 필요한 경우 다른 형광 염료로 하나 이상의 프로브를 결합합니다. 대상 세균없이 프로브 샘플 부정적인 컨트롤과 비감염 가루이를 사용합니다. </li><li> 액체 차단제와 함께 포함 된 하이브리드 버퍼에, 현미경 슬라이드에, 전체 샘플을 장착 커버 슬립 커버, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 밀봉. </li></ol> 3. 가루이 기관 해부, 고정, 하이브리드 및 TYLCV 물고기에 대한 시각화 <ol><li> 지속적으로 흡입과 고대 근동에서 TYLCV에 감염된 토마토 식물에 사육 성인 가루이 수집아세톤 함침 종이 타월에 노출 sthetize. 아세톤에 너무 오래 노출 가루이 조직을 고칠 수있는 것 1 ~ 2 분 동안 가루이 노출. 특정 하이브리드를 확인하는 비감염 토마토 식물 및 컨트롤 대한 조사 샘플에 사육 nonviruliferous 가루이를 사용합니다. </li><li> 우울증 현미경에 장착 가루이 스테레오 현미경을 사용하여 장기의 해부에 대한 슬라이드. </li><li> 앞가슴에서 곤충의 머리를 당깁니다 및 1X PBS의 침샘을 해부는 그들의 작은 크기, 더 나은 시각화를 위해 1 % 톨루이딘 블루 염색으로 보충. 2 ~ 3 분 동안 얼룩의 흡수를 허용합니다. </li><li> 흉부와 관찰하고 중장을 추방하기 위해 복부 사이의 시점에서 떨어져 곤충을 잡아 당깁니다. 복부 끝에 집게로 눌러 복부의 내용을 추방. </li><li> 조심스럽게 성공 해부에서 PBS와 톨루이딘 블루를 제거하고 부드럽게 5 분 동안 장기를 해결하기 위해 Carnoy의 정착의 300 μl를 추가합니다. </li><li>해부 기관의 제어되지 않은 이동을 방지하기 위하여 오목 웰의 일측으로부터 아니라 위에서 정착액 인 dd. 일단 정착을 터치, 기관은 유리에 부착하고, 그 과정을 통해 그들은 이동하지 않습니다. </li><li> 정착액을 제거하고 TYLCV 외피 단백질 유전자의 서열에 상보적인 형광 DNA 프로브 Cy5에-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, 10 pmol의 보충 하이브리드 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 바닥에 젖은 수건 종이로 작은 플라스틱 상자로 구성된 작은 습기 챔버 내부의 표본으로 슬라이드를 배양하여 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 하이브리드. </li><li> 하이브리드에 이어, 미세 해부 도구를 사용하여 기관을 선택하고 신속하게 DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단제와 함께 포함 된 새로운 하이브리드 화 버퍼 30 μl를 포함하는 신선한 현미경 슬라이드로 이동합니다. </li><li> 커버 슬립과 표본을 커버, 재치를 밀봉형광 또는 공 초점 현미경 H 매니큐어와보기. </li></ol> 4. 공장 처리, TYLCV의 물고기를 손으로 절편, 고정 및 하이브리드 <ol><li> viruliferous 가루이 매개 접종을 사용 TYLCV와 토마토 묘를 접종한다. 바이러스 symptomless 식물이 FISH 방법 접종 후 1 주간을 이용하여 검출 할 수있다. 일반적인 질병의 증상은 눈에 보이는 3 주 후 접종입니다. 특정 하이브리드를 확인하기 위해 컨트롤에 감염되지 토마토 식물없이 프로브의 샘플을 사용합니다. </li><li> 토마토의 손으로 잘라 2-4센티미터 긴 길이 또는 단면을 제조하는 날카로운 조직 학적 면도날을 사용하여 줄기와 잎. </li><li> 에펜 도르프 튜브에서 2 시간에 실온에서 밤새에 Carnoy의 정착의 섹션을 수정합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 섹션을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다. </li><li> 섹션을 씻으하이브리드 버퍼에 세 번, 1 분마다. </li><li> TYLCV 코트 단백질 유전자의 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 형광 프로브를 Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;10 pmol의 보충 된 혼성화 완충액 500 μL와 섹션 혼성화. </li><li> 하이브리드 버퍼에, 절에 세 번, 1 분마다 씻으십시오. </li><li> DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단기에 포함 된 하이브리드 버퍼의 전체 마운트 섹션은, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 인감, 커버 슬립 커버. </li></ol>

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</ol>

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그 공장 주인과 곤충 벡터 식물 바이러스의 현지화 및 특정 가루이 호스트에 endosymbiotic 박테리아 여기에 설명 된 프로토콜은, 식물, 심지어는 동물 조직에서 다른 바이러스의 현지화에 적용 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 endosymbiotic 병원성 박테리아와 식물과 동물의 시스템에서 다른 미생물을 지역화하는 데 사용할 수 있습니다. 기술 된 방법은 짧은, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브와 DNA 셀 표적 DNA 또는 RNA 분자 간의 혼성화의 간단한 개념에 의존한다. 결과는 최소한의 배경을 가진 특정 하이브리드, 형광 또는 공 초점 현미경을 이용하여 검출 신호이다. 하나 이상의 유전자를 타겟팅 다른 형광 염료 여러 프로브가 동시에 사용될 수있다. 이는 단일 세포 또는 조직에서 하나 이상의 타겟을 시각화 가능하게한다. 이러한 프로토콜에 설명 된 절차는 간단하고 시료 처리 시간 아르최소이다. 이러한 높은 백그라운드 신호, 시험편 긴 처리 시간 및 분석을 위해 다수의 값 비싼 재료의 사용과 같은 다른 프로...

감염된 식물들은 호스트와 식물 바이러스 및 기타 병원체 간의 상호 작용을 연구 할 때, 그것은 그들이 호스트에 부정적인 영향을 야기하는지 여부를 불문하고, 동일 반응계에서 병원균 및 각각 핵산을 시각화하는 것이 중요하다. 식물 세포 내와 사이에 병원균의 움직임을 연구 할 때이 가장 중요하다. 병원체의 유전자 제품의 현장 현지화에서 병원성 과정을 연구하기위한 다른 방법을 보완하는 필수적인 단계이다. 많은 식물 병원체, 특히 바이러스는 자신의 벡터를 복잡하고 친밀한 상호 작용을 갖는 곤충에 의해 전달된다. 자신의 그림에있는이 바이러스의 현지화 전송 경로를 연구하는데 중요하고, 벡터 내부의 가능한 상호 작용 사이트. 일부 곤충 벡터가 식물 바이러스의 전송은 이들 곤충에 상주 endosymbiotic 박테리아에 의해 도움을 받는다. 더 나은 이러한 식물 바이러스 B의 전송을 연구하는자신의 벡터, 그것은 일반적으로 endosymbiotic 박테리아를 시각화, 특히 바이러스의 전송에 관련된 사람들, 또한 필수적입니다 Y. 바이러스와 endosymbiotic 박테리아의 colocalization을 따라서 자신의 곤충 호스트 이내에 생물 사이의 가능한 관계를 조사를 위해 요구된다. 이외에도 바이러스 전송에서, endosymbiotic 박테리아가 곤충 벡터의 생물학의 여러 측면에 영향을 미치는, 곤충 이내에 세균 따라서 공간 현지화 높은 관심과 중요하다. 토마토 노란 잎 말림 바이러스 (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae)는 전 세계적으로 1-4 재배 토마토의 가장 중요한 바이러스 성 질병의 복잡합니다. TYLCV는 사부 제한 바이러스 독점적 가루이 담배가 담배가 루이 5,6에 의해 벡터가된다. 자신의 가루이 벡터의 begomoviruses의 전위를 설명하는 모델은 6-9 제안되었다. 두 가지 특정 장벽을 적극적으로 DUR 교차중장 / 체액과 체액 / 침샘 장벽이이 순환 전송을 보내고. 이 송신 처리는 바이러스 캡시드를 인식 불명 수용체에 의해 매개되는 것으로 가정된다. TYLCV는 B를 교차 생각된다 이 식물에 주입되기 전에 담배가 루이의 중장 6,10, 그리고는 기본 침샘 (6)을 통해 흡수된다. 가루이 체액에서 TYLCV는 곤충 보조 endosymbiotic 박테리아 Hamiltonella에 의해 생산의 GroEL 단백질과 상호 작용합니다.이 상호 작용은 체액에서 TYLCV의 안전한 전송을 보장하고, 곤충의 면역 체계 11. Hamiltonella 및 Portiera, 기본 endosymbiont의 공격으로부터 보호 가루이의, bacteriocytes에 보관되어, 체액 및 집 endosymbiotic 박테리아 11. B.에서 발견 된 곤충 세포 담배가 루이는 리케차, Arsenophonus, Wolbachia 및 프리쉬 등의 추가 endosymbiotic 박테리아를 항구bacteriocytes 내부 또는 외부에 현지화 할 수 있으며, EA는, 곤충의 생물학 (12)에 다양한 영향을 미친다. 여러 보고서가 미세한 두께 섹션 10, 13에 현장에서 이러한 투과 전자 현미경 (TEM), 항체 및 RNA 등 많은 시간과 비용이 많이 드는 프로토콜을 사용하여 식물과 가루이의 TYLCV의 현지화를 연구하려고했습니다, 최근의 연구는 지역화를 설명 간단한 프로토콜 14을 사용하여 자신의 공장 및 벡터 호스트 내부의 식물 바이러스의. 여기에서 우리는 B에서 TYLCV의 지역화를위한 간단한 프로토콜을 설명 담배가 루이가 인 midguts과 침샘을 해부하고, 절에서 TYLCV에 감염된 식물에서 준비했습니다. 우리는 더 Portiera, B의 기본 endosymbiont의 현지화를 설명 담배가 루이, 그 차 endosymbionts Hamitonella, 리케차 및 Arsenophonus은.이 프로토콜은 짧은 DNA 프로브를 사용을 기반으로하는찬란하게 자신의 5 &#39;말단에 표시하고, 특히 바이러스 성 또는 세균성 유전자 서열에 상보적인 서열에 하이브리드된다. 샘플 처리는 비교적 쉽게 얻어진 신호는 매우 다릅니다. 기술 된 프로토콜은 식물, 동물 및 곤충 호스트에서 바이러스, 세균 및 기타 병원체를 집중하는 데 사용될 수 있고, 추가로 임의의 주어진 조직에서 mRNA를 지역화하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>형광 라벨링&nbsp; 프로브</td><td>: Metabion</td><td>20 bp HPLC 정제</td><td>서열 고객</td></tr><tr><td>Toluidine 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>320099</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>액체 차단제</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr></tbody></table>

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (fish)

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 일반적으로 진핵 세포의 유전자 사본을 시각화하고 추가 바이러스 나 세균 감염과 같은 세포의 다른 구성 요소를 시각화하기 위해 수정 될 수 있습니다에 사용되는 다양한 기술에 주어진 이름입니다. 공간 현지화 및 감염 과정에서 바이러스와 박테리아의 시각화는 다른 자극에 대한 응답으로 이러한 마이크로 어레이 및 RNAseq로 표현 프로파일 링 실험을 보완하는 필수 단계입니다. 이러한 에이전트와 시공간 감염을 이해하는 세포 구성 요소와의 상호 작용을 이해하기위한 생물학적 실험을 보완합니다. 이러한 리포터 유전자 시스템이나 면역 조직 화학적 방법으로 바이러스와 박테리아를 시각화하는 몇 가지 기술은 시간이 많이 소요되어, 일부는 모델 생물로 작업하고 복잡한 방법을 포함하도록 제한됩니다. 세포 내에서 RNA 또는 DNA 종을 대상으로 FISH는 상대적으로 쉽고 빠른 날입니다유전자의 시공간 현지화을 연구 및 진단 목적으로 THOD. 이 방법은 강력하고 프로토콜이 비싸지 않다 짧은 혼성화, 시중에서 구입 한 프로브를 사용하면 비교적 쉽게 구현할 수 있습니다. 샘플 준비, 고정, 하이브리드, 현미경 시각화 복잡한 단계를 포함하지 않는 경우에 특히 강력합니다. 여기에서 우리는 곤충과 식물 조직에서 박테리아와 바이러스의 현지화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 자신의 5 &#39;또는 3&#39;에 형광 염료에 접합 된 짧은 DNA 프로브가 종료 20 염기쌍 간단한 준비, 고정, 곤충 전체 마운트 및 해부 기관 또는 손으로 만든 플랜트 섹션의 하이브리드 화에 기반하고있다. 이 프로토콜은 성공적 곤충 및 식물 조직의 개수에인가되었으며, 셀에서의 mRNA 또는 기타 RNA 또는 DNA 종의 발현을 분석하기 위해 사용될 수있다.

이 원고에서 공부 시스템은 그림 1과 TYLCV와 감염된 식물, 성인 및 가루이 B의 요정이 포함되어 있습니다 담배가 루이, 그리고 곤충에 TYLCV 전좌의 경로를 보여주는 가루이의 내부 해부학. 2 차 공생 Portiera와 보조 공생을위한 성인 가루이에 두 번 생선을 보여줍니다 Arsenophonus. 그림 3은 Portiera 및 Hamiltonella에 두 번 생선을 보여 주며, 그림 4는 Portiera 및 리케차, B의 두 인물에 두 번 생선을 보여줍니다 담배가 루이 제 4 령 요정. 5 가루이 해부 중장에서 TYLCV와 DAPI 염색을 위해 ...

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

fluorescence-situ-hybridizations-fish-for-localization-viruses

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

출처: Ng, K. M., Tropini, C. 장내 미생물-숙주 상호작용의 형광 제 자리 하이브리다이제이션, 렉틴 염색 및 영상 촬영을 통한 시각화. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 형광 프로브를 박테리아 rRNA(리보솜 리보뉴클산)로 하이브리다이징하여 미세 분석을 위해 숙주 구조를 대염색하여 쥐 장 내 장내 미생물군을 염색하는 형광 현장 잡종화(FISH) 과정을 시연합니다.

쥐 장 절편에서 장내 박테리아의 형광 제자리 하이브리드화

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

절제된 곤충 내장에서 식물 바이러스 단백질과 벡터 곤충 단백질 모두의 면역형광 표지를 위한 이 프로토콜은 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용, 곤충 단백질 기능 및 바이러스 전파의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

배우세요 형광 현장에서 혼성화(FISH) 기법으로 곤충과 식물 조직 내 바이러스 및 박테리아를 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 전체 마운트와 미세절단에서 mRNA 시각화에도 적용 가능하여 병원체 동역학 연구에 활용됩니다.

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