유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

여기서의 전반적인 목표는 내생 식물의 VIGs를 달성하여 비기주 저항성에 관여하는 유전자를 식별하기 위한 바이러스 유도 유전자 침묵 방법론을 시연하는 것입니다. 표적 유전자를 위해 표적 유전자의 단편을 포함하는 tobacco rattle virus 벡터 구조물을 nicotiana hamama 식물에 접종하고, 녹색 형광 단백질을 발현하는 비기주 병원균 배양액을 준비하여 유전자가 침묵된 식물 잎에 접종합니다. 다음으로, 어두운 곳에서 UV 광원 아래 비기주 병원균의 녹색 형광 콜로니를 평가합니다.

비숙주 저항성을 약화시키는 유전자 침묵 식물을 식별하기 위해, 바이러스 벡터 내의 삽입물을 시퀀싱하여 표적 유전자를 확인합니다. 전반적으로, VIX 매개 순방향 유전 스크리닝 방법론을 통해 연구자들은 세균 병원체에 대한 식물의 비숙주 저항성에 관여하는 유전자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 짧은 기간 내에, 우리는 비-ST 저항성 책임 유전자를 식별하기 위해 바이러스 유도 유전자 침묵 매개 순방향 유전학과 GFP UV 발현 병원체를 결합하는 것의 중요성을 확인하였습니다.

이전 연구에서 우리는 과잉 반응 유도 세포 사멸 및 질병 유도 세포 사멸을 측정하여 지루한 전방 유전학적 스크리닝을 수행했습니다. 따라서 무토양 상토 혼합물에 nicotiana Ben 씨앗을 심고 성장 챔버에서 씨앗을 발아시킵니다. 3주 후, 묘목을 개별 화분에 옮겨 심고 tobacco rattle virus를 접종하기 전 최소 2~3일 동안 온실에서 재배합니다.

피그스 벡터 접종을 위해 cDNA 클론이 포함된 아그로박테리움의 냉동 줄기를 서서히 해동합니다. 멸균 조건 하에서 두 가지 벡터를 사용하여 개별 아그로박테리움 배양액을 Luria-Bertani 아그로 플레이트에 접종합니다. 플레이트를 28°C에서 최대 2일 동안 배양합니다.

두 개체에 접종할 수 있는 충분한 아그로박테리움 접종액을 확보하기 위해, 각 클론당 4개의 반복 콜로니를 배양합니다. TRV one을 Luria berti 액체 배지에 접종합니다. 하룻밤 동안 배양한 배양물을 원심분리하여 수확하고, 접종 버퍼에 박테리아를 재현탁한 후 50 RPM의 쉐이커를 사용하여 실온에서 3시간 동안 배양합니다.

원심분리를 통해 세포를 회수한 후, 광학 밀도를 측정하고 박테리아 펠릿을 5 mM MES 완충액(pH 5.5)에 재현탁합니다. 다음으로, OD 600이 0.3인 TRV1 박테리아 배양액을 바늘 없는 주사기를 사용하여 3~4장의 Nicotiana hamama 잎의 액축(axil) 부위인 TRV1 접종 위치에 접종합니다. 이후 2주 동안 이쑤시개를 사용하여 각각의 TRV2 콜로니 접종액으로 잎을 찌릅니다. PGS에 의한 효율적인 유전자 침묵을 위해서는 왕성한 성장이 중요하므로, 식물을 적절한 영양 공급과 함께 저온 상태에서 유지하십시오.

예를 들어, 본 실험에서는 pseudomonas senge PV tomato T one이 사용됩니다. 병원균은 GFP-UV를 발현할 수 있는 플라스미드를 보유해야 합니다. PGE 균주를 10 µg/mL의 Rifampicin과 50 µg/mL의 Kanamycin이 첨가된 King's B 액체 배지에서 28 °C로 12시간 동안 배양합니다.

원심분리를 통해 박테리아 배양액을 수확한 다음, 어두운 곳에서 장파장 UV 램프를 사용하여 녹색 형광의 존재를 확인합니다. 멸균수로 두 번 세척한 후, 원하는 농도의 멸균수로 세포를 재현탁하고 OD 600을 조정합니다. 그런 다음 각각의 병원균을 표적의 축 방향 측면에 접종합니다.

필요한 경우, 유전자가 억제된 잎을 약 1.5 cm 직경의 원형으로 자릅니다. 동시에, 표적 유전자가 억제된 식물에서 여러 비숙주 병원균의 성장을 테스트하며, 대조군 확인을 위해 벡터 대조군을 포함합니다. 2~5일 사이에 세균을 접종합니다.

접종한 잎을 어두운 곳에서 장파장 UV 광선에 노출시킵니다. 이때 반드시 피부 및 안구 보호구를 착용하십시오. 잎 표면에서 방출되는 적색 형광 배경에서 잎의 축면(axial side)에 나타나는 녹색 형광 반점 형태의 박테리아 콜로니를 관찰합니다.

양성 대조군으로 작용하는 숙주 병원체에서 방출되는 녹색 형광을 확인합니다. 접종 후 2일에서 5일까지 매일 병원체의 성장을 관찰합니다. 유전자 침묵(silencing) 결과, 하나 이상의 비숙주 병원체의 성장을 유도한 클론의 목록을 작성합니다.

1차 스크리닝에서 나타난 위양성을 제거하기 위해, 선택된 클론들에 대해 VIG를 반복하고 유전자 억제 식물의 비표적 병원균에 대한 반응을 다시 테스트합니다. 선택된 클론에 콜로니 PCR을 수행하여 T RV two 벡터의 A TTB one 및 TB two 프라이머 또는 클로닝 부위를 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 삽입물을 증폭합니다.

PCR 산물을 아가로스 겔에서 전기영동하여 단일 밴드의 증폭 여부를 확인합니다. 그 다음 ATTB 프라이머 또는 클로닝 부위 양옆의 프라이머를 사용하여 TRV2 벡터 내의 식물 유전자 삽입물을 시퀀싱합니다. 해당 시퀀스를 이용해 BLAST 분석을 수행하고 유전자의 상세 정보를 확인합니다.

Nicotiana hamana에서 담배 래틀 바이러스(tobacco rattle virus) 기반의 벡터를 사용하여 다수의 유전자를 침묵시키기 위한 일반적인 프로토콜이 이 흐름도에 제시되어 있습니다. 일부 유전자 침묵 식물은 성장 저해, 황화 현상 및 광백화 표현형을 포함하여 다양한 표현형 변화를 보였습니다.

이 데이터는 식물 접종 전 어둠 속에서 UV 광선에 노출된 병원체의 녹색 형광과 접종 3일 후의 성장 상태를 보여주며, 백색광 아래에 노출된 동일한 잎을 대조군으로 나타냅니다. 이 실험은 세 가지 비기주 식물 내에서 G-F-P-U-V를 발현하는 박테리아의 성장을 추적합니다.

면역력을 가진 야생형 비-침묵 nicotiana hamama 식물에서 비-기주 병원균에 감수성을 보이는 유전자 침묵 식물의 식별 과정을 입증하기 위해 병원균이 사용되었습니다. 이 병원균들은 성장하지 않았습니다. 그러나 최소 두 종류의 비-기주 병원균이 NB sgt에서 성장했습니다.

단일 유전자가 억제된 잎입니다. 박테리아 성장에 대한 정량적 데이터는 non-ST 저항성이 결여된 유전자 억제 식물을 식별하는 과정을 보여줍니다. 이러한 figs 매개 순방향 유전학 접근법을 사용하여, 약 1년 반 동안 nicotiana hamana의 약 5,000개 유전자를 억제하고 non-ST 저항성이 결여된 식물들을 식별하였습니다.

예시로, 본 스크리닝을 통해 확인된 두 가지 유전자 침묵 식물에서의 비숙주 병원균 증식 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 저희는 수백 개의 유전자에 대해 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS)을 수행하고, 이후 식물체 내에서 비숙주 병원균의 증식을 관찰함으로써 침묵된 식물을 평가하여 비숙주 저항성을 분석하는 방법을 전달해 드리고자 했습니다. 이 바이러스 유도 유전자 침묵 매개 프로토콜을 이용하면 약 2~3주의 기간 내에 수백 개의 유전자를 침묵시킬 수 있으며, 이후 GFP로 표지된 비숙주 병원균의 증식을 하루 약 2~3시간씩, 총 2~5일에 걸쳐 평가할 수 있습니다.