유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

여기서의 전반적인 목표는 내인성 식물의 VIG를 달성하기 위해 비숙주 내성에 관여하는 유전자를 식별하기 위해 바이러스 유도 유전자 침묵을 사용하는 방법론을 입증하는 것입니다. 표적 유전자는 니코티아나 하마마 식물에 담배 딸랑이 바이러스를 접종하고, 표적 유전자의 단편을 운반하는 무화과 식물을 생성하고, 유전자 침묵 식물 잎에 녹색 형광 단백질을 발현하는 비 숙주 병원체 배양을 준비하고 접종합니다. 다음으로, 어둠 속에서 자외선 아래에서 비숙주 병원체의 녹색 형광 집락을 평가합니다.

non host resistance를 손상시키는 유전자 침묵 식물을 식별하려면 바이러스 벡터에 삽입물을 염기서열분석하여 표적 유전자를 식별합니다. 전반적으로, VIX 매개 전방 유전자 스크리닝의 이 방법론을 통해 연구자들은 박테리아 병원체에 대한 식물의 비숙주 저항성에 관여하는 유전자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 단기간에 우리는 비ST 내성 책임 유전자를 식별하기 위해 바이러스 유도 유전자 침묵 매개 전방 유전학과 GFP UV 발현 병원체를 결합하는 것이 중요하다는 것을 깨달았습니다.

이전에는 과잉 반응 유도 세포 사멸 및 질병 유발 세포 사멸에 대한 점수를 매겨 지루한 전방 유전자 검사를 수행했습니다. 그래서 토양이 없는 화분 혼합물에 있는 nicotiana Ben 씨앗은 성장 챔버에서 씨앗을 발아시킵니다. 3 주 후, 묘목을 개별 화분에 이식하고 담배 딸랑이 바이러스가 발생하기 전에 적어도 2-3 일 동안 온실에서 자랍니다.

무화과 벡터 접종은 cDNA 클론을 포함하는 아그로박테리움의 얼어붙은 줄기를 점차적으로 해동합니다. Intv 2 벡터는 무균 조건에서 개별 agrobacterium 배양액을 Luria에 접종합니다. Berti 농업 플레이트는 최대 2일 동안 섭씨 28도에서 플레이트를 배양합니다.

각 클론에 대해 4개의 복제 콜로니를 성장시켜 2개의 식물에 접종할 수 있는 적절한 agrobacterium inoculum을 사용할 수 있도록 합니다. TRV 1을 Luria berti 액체 배지에 접종합니다. 하룻밤 동안 성장한 배양액을 원심분리로 수확하고, 박테리아를 접종 시 재현탁시키고, 완충액을 주입하고, 50RPM의 쉐이커에서 실온에서 3시간 동안 배양합니다.

원심분리로 세포를 채취한 후, 광학 밀도를 측정하고 박테리아 펠릿을 5밀리몰 MES 완충액 pH 5.5에 현탁시킨 다음 T RV 1회 접종 부위에서 바늘 없는 주사기를 사용하여 3-4개의 니코티아나 하마마 잎의 축면에 OD 600 0.3의 T RV 1개 세균 배양액을 접종합니다. 2 주 동안 이쑤시개를 사용하여 각각의 T RV 두 식민지의 접종물로 잎을 찌릅니다. 돼지의 효율적인 유전자 침묵을 위해서는 활발한 성장이 중요하기 때문에 적절한 영양과 함께 식물을 저온에서 유지하십시오.

예를 들어, 슈도모나스 센게 PV 토마토 T one이 이 실험에 사용됩니다. 병원체는 G-F-P-U-V를 발현할 수 있는 플라스미드를 운반해야 하며, 킹의 PGE 균주를 액체로 성장시키고, 배지에는 밀리리터당 10마이크로그램이 보충되어야 합니다. 밀리리터당 50마이크로그램의 리팜피신은 섭씨 28도에서 12시간 동안 마이신을 사용할 수 있습니다.

원심분리로 박테리아 배양물을 수확한 다음 어둠 속에서 장파장 UV 램프를 사용하여 녹색 형광의 존재를 확인합니다. 멸균수로 두 번 세척한 후 resus는 원하는 멸균수 농도에서 세포를 현탁시키고 OD 600을 조정합니다. 그런 다음 각각의 병원체를 표적의 축 방향에 접종합니다.

유전자 침묵 잎은 필요한 경우 약 1.5cm 직경의 원형을 둘러쌉니다. 동시에 표적 유전자 침묵 식물에서 성장하기 위해 여러 비 숙주 병원체를 테스트하고, 식물에는 관찰을 위한 벡터 제어도 포함됩니다. 2일에서 5일 사이에 박테리아 성장을 이식합니다.

접종된 잎을 어둠 속에서 장파장의 자외선에 노출시킵니다. 피부와 보안경을 반드시 착용하십시오. 박테리아 군체를 잎 표면에서 방출되는 붉은 형광의 배경에서 잎의 축 방향에 있는 녹색 형광 반점으로 모니터링합니다.

양성 대조군 역할을 하는 숙주 병원체에서 방출되는 녹색 형광을 확인합니다. 접종 후 2일에서 5일까지 매일 병원균 성장을 관찰합니다. 침묵을 일으켜 하나 이상의 숙주가 아닌 병원체의 성장을 초래한 클론의 목록을 만드십시오.

첫 번째 화면에서 가양성을 제거합니다. 선택한 클론에 대해 VIG를 반복하고 다시 비용이 들지 않는 병원체에 대한 유전자 침묵 식물의 반응을 테스트합니다. 선택한 클론에 colony PCR을 사용하여 클로닝 부위를 블랭킹하는 T RV 2개의 벡터 또는 프라이머에 A, TTB 1개 및 TB 2개의 프라이머를 사용하여 삽입물을 증폭합니다.

aros gel에서 PCR 산물을 실행하고 단일 밴드의 증폭을 확인합니다. 그런 다음 A TTB 프라이머 또는 클로닝 부위 옆에 있는 프라이머를 사용하여 T RV 2 벡터에 식물 유전자 삽입물을 염기서열분석합니다. 염기서열을 사용하여 blast를 수행하고 유전자 세부 정보를 식별합니다.

니코티아나에서 담배 딸랑이 바이러스 기반 무화과를 사용하여 많은 수의 유전자를 침묵시키기 위한 일반화된 프로토콜. Hamana는 이 순서도에 표시되어 있습니다. 유전자 침묵 식물 중 일부는 성장 저해, 황변 및 광표백 표현형을 포함한 다양한 표현형 변화를 보였습니다.

이 데이터는 식물 접종 전 어둠 속에서 자외선에 노출된 병원체와 성장 임플란트의 녹색 형광을 보여주며, 접종 3일 후 백색광 아래에 노출된 동일한 잎이 대조군으로 나타났습니다. 이 실험은 플라나에서 박테리아를 발현하는 G-F-P-U-V의 성장을 추적합니다. 호스트가 아닌 3개.

병원체는 면역을 가진 야생형 nons 침묵 니코티아나 하마마 식물에 취약한 유전자 침묵 식물의 식별 과정을 입증하는 데 사용되었습니다. 이 병원체는 자라지 않았습니다. 그러나 NB sgt.One

유전자는 잎을 침묵시켰다. 박테리아 성장에 대한 정량적 데이터는 비 ST 내성으로 손상된 유전자 침묵 식물을 식별하는 과정을 보여줍니다. 이 무화과 매개 순방향 유전학 접근법을 사용하여 우리는 nicotiana hamana에서 약 5, 000 개의 유전자를 침묵시키고 약 1 년 반 동안 비 ST 저항성을 손상시키는 식물을 확인했습니다.

예를 들어, 이 스크린에서 확인된 두 개의 유전자 침묵 식물에서 비숙주 병원체 성장이 여기에 나와 있습니다. 수백 개의 유전자에 대해 바이러스 유도 유전자 침묵을 수행하는 방법을 전달한 다음, 비비용 내성을 해부하기 위해 플라나에서 비비용 병원체의 성장을 관찰하여 침묵된 식물을 평가하는 방법을 전달하기를 바랍니다. 이 바이러스에 의하여 유도된 유전자를 이용하여, 중재된 의정서를 침묵시킴으로써, 사람은 대략 2 3 주 기간에 있는 유전자의 수백을 침묵시킬 수 있고, 그 후에 GFP UV로 레테르를 붙인 비 말 병원체의 성장을 일 대략 2 3 시간에, 약 2 5 일에 걸쳐 평가할 수 있습니다.