Xenopus의 난자 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술

이 절차의 전반적인 목표는 빠른 채널 동역학의 높은 시간 분해능으로 zap cyte로 표현된 전압 게이트 이온 채널에서 이온 및 게이팅 전류의 저잡음 기록을 얻는 것입니다. 이는 먼저 기록된 이온 채널 mRNA를 개구리 난모세포에 주입함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 모세관 튜브를 형성한 다음 튜브에 한천을 함유한 소금 용액으로 채워 한천 브리지를 만드는 것입니다.

다음으로, 절단된 개방형 리그는 UO 사이트와 한천 브리지를 포함한 모든 구성 요소를 지정된 위치에 배치하여 실험을 준비합니다. 마지막 단계는 전압 클램프 녹음을 허용하기 위해 마이크로 전극을 UO 사이트에 삽입하는 것입니다. 궁극적으로 기록 프로토콜은 난모세포막에 위치한 이온 채널의 이온 전류를 표시하는 데 사용됩니다.

절단 개방 전압 클램프 기술의 주요 장점은 매우 많은 이온 채널 모집단에 대한 안정적인 저잡음 기록이 가능하다는 것입니다. 또한 채널 kinetics의 빠른 분해능을 허용합니다. 이 방법의 시각적 시연은 O 부위, 상부 챔버 및 한천 브리지의 배치와 같은 일부 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

이 절차에서는 중간 화염에서 보로 실리케이트 모세관 튜브의 한쪽 끝을 가열하여 최소 6개의 한천 브리지를 만듭니다. 그들 각각을 위해. 모세관 튜브의 끝이 파란색 불꽃의 상단 부분에 있는지 확인하십시오.

모세관 튜브가 가열되면 집게를 사용하여 90도 구부립니다. 굽힘 부위는 갑작스러운 모서리가 아닌 부드러운 곡률을 가져야 하며, 그렇지 않으면 유리의 내부 직경이 크게 감소하여 충전이 더 어려워지고 브리지의 저항이 증가할 수 있습니다. 그런 다음 구부러지지 않은 끝에서 약 25mm 떨어진 곳에서 모세관 튜브를 가열합니다.

이 위치에서 첫 번째 절곡부와 같은 방향으로 두 번째 90도 절곡부를 만듭니다. 모세관 튜브가 냉각된 후 다이아몬드 팁 유리 커터를 사용하여 브리지 다리를 약 5mm로 자릅니다. 다음으로, 백금 와이어를 세 개의 전류 공급 브리지의 모세관 튜브에 삽입합니다.

튜브 외부에 노출된 와이어가 없도록 여분의 백금 와이어를 잘라냅니다. 와이어가 모세관의 양쪽 끝에 있는 유리보다 1mm 짧아지도록 끝이 미세한 도구를 사용하여 백금 와이어를 모세관 안으로 더 밀어 넣습니다. 그런 다음 다리가 위를 향하도록 미리 만들어진 한천 용액에 모세관 브리지를 한 번에 하나씩 추가합니다.

브리지에 기포나 주머니가 없으면 한천 용액에서 브리지를 회수하고 다리를 종이 타월에 올려 말리십시오. 또는 작은 피펫 팁에 부착된 주사기를 통해 한천 용액을 밀어 브리지를 채웁니다. 그 후, 끝이 매우 미세한 물체로 중간 챔버의 위쪽에 있는 구멍의 가장자리와 위쪽 챔버의 아래쪽에 소량의 바셀린을 도포하여 해부 현미경으로 절단 열린 리그를 준비합니다.

그런 다음 3 몰의 염화 칼륨 용액에서은, 염화은 펠릿을 담고있는 매니 폴드 슬롯에 넣습니다. 이 단계에서는 UO 사이트 없이 상단 챔버를 설치합니다. 두 챔버의 구멍이 겹치지 않도록 상단 챔버를 중앙에서 밀어냅니다.

그런 다음 모든 챔버를 외부 용액으로 채우고 모든 브리지를 해당 챔버에 놓습니다. 그런 다음 외부 명령과 두 클램프가 모두 꺼져 있는지 확인하십시오. 의 전류 판독값을 확인하십시오 ampliifier를 사용하고 작은 드라이버로 목욕 가드 헤드 스테이지 뒷면의 P 세트를 0 전류로 조정합니다.

그런 다음 증폭기의 수조 가드 스위치를 활성으로 전환하십시오. 그런 다음 배스 가드 헤드 스테이지의 GS 오프셋을 조정하여 작은 드라이버로 제로 전류를 얻고 둘 다 0에 상당히 가까워질 때까지 액티브와 패시브 사이를 반복합니다. 다음으로, 한천 다리 끝과 상단 챔버를 제거합니다.

피펫 펌프를 사용하여 UO 사이트를 중간 수조 챔버로 옮기고 UO 사이트가 수조 중앙의 구멍 위에 위치하는지 확인합니다. 그런 다음 피펫 펌프를 사용하여 바닥 수조에서 과도한 외부 용액을 제거하여 UO 부위와 수조 표면 사이에 밀봉을 만듭니다. 이제 챔버의 구멍이 UO 사이트 상단의 중앙에 오도록 상단 목욕 챔버를 UO 사이트 위에 놓습니다.

엄지, 가운데 손가락, 핀셋을 사용하여 난모세포에 단단히 눌릴 때까지 챔버에 천천히 압력을 가하여 멤브레인의 작은 부분만 구멍을 통해 상부 수조에 노출되도록 한 다음 거의 가득 찰 때까지 상부 및 하부 수조에 외부 용액을 추가합니다. 그런 다음 한천 브리지의 자유로운 다리를 각 수조의 외부 용액에 놓습니다. 각 브리지가 올바른 욕조 위치에 놓여 있는지 확인하십시오.

레코딩 소프트웨어에서 테스트 프로토콜을 시작하고 테스트 펄스의 두 피크 사이 수평 단면의 수직 변위가 100나노 암페어 이하인지 확인합니다. 수평 단면이 그림과 같이 100 나노 암페어 이상의 수직 변위를 보이는 경우, 세포의 상단 챔버의 견고성을 증가시킵니다. 그런 다음 증폭기의 수조 가드 스위치를 활성으로 전환하십시오.

다음으로 바닥 욕조의 외부 용액을 제거하고 사포닌 용액으로 교체합니다. 사포닌 용액을 첨가한 후 컴퓨터 모니터에서 반복 테스트 펄스를 관찰합니다. 테스트 프로토콜의 피크가 감소하거나 사라지면 아래에 거품이 있음을 나타냅니다.

이 경우 cyte는 사포닌 용액을 완전히 대체했습니다. 새로운 사포닌 용액으로 세포가 침투했습니다. 테스트 프로토콜에서 전류 스파이크의 하향 기울기가 감소할 때.

세포가 제거되면 사포닌 용액을 제거하고 내부 용액으로 수조를 채웁니다. 그런 다음 테스트 프로토콜을 중지합니다. 다음으로, 다른 수조에 있는 용액 사이에 가능한 접촉이 있는지 확인하고 매니폴드의 웰 사이에서 염화칼륨을 결정화하면 단락 및 불규칙한 동작이 발생할 수 있습니다.

용액이 있는 경우 수조 사이의 접촉은 두 수조에서 초과 용액을 흡인합니다. 결정화된 염화칼륨용. 분출 병을 사용하여 결정화된 염화칼륨을 씻어낸 다음 남은 물을 흡인합니다.

그런 다음 변형된 주사기를 사용하여 3개의 몰 염화칼륨을 마이크로 전극에 주입합니다. 마이크로 전극을 여러 번 튕깁니다. 이제 와이어 필라멘트를 개방형 마이크로 전극 끝에 삽입하여 마이크로 매니퓰레이터 암에 염화칼륨으로 채워진 전극을 장착합니다.

마이크로 전극의 끝을 필라멘트 홀더에 밀어 넣고 전극이 헐거워지지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 전극 패스너를 조입니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터 암을 cyte bath 위의 위치로 스윙하고 클램프를 조여 팔이 더 이상 움직이지 않도록 합니다.

전극 팁이 수조의 액체 표면을 깨뜨릴 때까지 전극을 내립니다. cyte vol의 V one 버튼을 누르십시오.tage clamp 그런 다음 V one 오프셋 노브를 조정하여 V one vol을 줄입니다.tage를 0으로. V 2에 대해 동일한 조정을 수행합니다.

전위차 V 1 빼기 V 2는 전압 클램프 디스플레이에서 0밀리볼트를 읽어야 합니다. 그 후, 현미경을 통해 보면서 상부 수조에 있는 UO 부위의 보이는 부분을 향해 전극을 계속 내립니다. 마이크로 전극이 UO 부위에 매우 가까워지면 V 1 - V 2 판독값을 관찰하여 전극이 UOC 부위에 들어갈 때를 확인합니다.

V 1 빼기 V 2 전압은 마이크로 전극이 셀에 들어갈 때 음극이 됩니다. 이때 녹음 소프트웨어에서 데이터 수집 프로토콜을 엽니다. uoc 사이트 vol의 클램프 스위치를 뒤집습니다.tage clamp 증폭기를 켜짐 설정으로 전환합니다.

그런 다음 I 헤드 스테이지에 있는 노브를 조정하여 명령과 일치하도록 전위를 조정합니다. 그런 다음 데이터 기록 프로토콜을 시작하여 전류 기록을 시작합니다. 다음은 선택한 테스트 펄스 추적입니다.

난모세포 투과성 동안, 미량에서 볼 수 있는 붕괴의 시간 상수의 증가는 난모세포 투과성의 증가를 보여줍니다. 이 그림은 절단 개방 전압 클램핑으로 인한 야생형 나트륨 채널 결과를 보여줍니다. 다음은 다양한 전압 자극에서 기록된 전류의 흔적입니다.

여기에 표시된 전류 전압 곡선은 피크 전류의 전압 의존성을 나타냅니다. 이 기술을 시도하는 동안 셀에 들어가기 전에 전압 클램프를 끄고 셀을 나가기 전에 전압 클램프를 끄는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 농업 교량에 손상이 발생할 수 있으며 교체해야 할 수 있습니다.