Name: 세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징 리스테리아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 배우세요 Listeria monocytogenes 세포 침입을 정량화하는 현미경 기반 분석법을 사용하여 세균 감염에 필요한 숙주 세포 기능을 발견하는 방법을 알아보세요.

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P. Cossart 실험실에서 연구는 파스퇴르 연구소, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale, 문화원 내셔널 드 라 공들인 Agronomique, ERC 고급 그랜트 (233348), 직원은 국립 드 라 공들인 (부여 MIE-에서 지원 SignRupVac), 루이 Jeantet 재단과 매그 르 로크 레 무 스케 타이. AK는 파스퇴르 파리 대학 국제 박사 과정 / 문화원 카르노 만성 질환 Infectieuses에서 장학금을받는 사람입니다. 우리는 세포의 형질 전환 프로토콜을 최적화 제이슨 머서 감사합니다.

1. 세포의 준비 및 세균 배양, 형질 도구 및 차 항체 <ol><li> 개인 L.를 분리 신선한 한천 플레이트를 준비 C. -80 °로 유지 세균 글리세롤 (세균의 액체 배양 물을 포화 glycerol/50 % 50 %)에서 식민지 모노 사이토 겐 <ol><li> 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에 고정 된 세균 글리세롤, 줄무늬 박테리아를 전송 (-80 ° C 유지) 알루미늄 랙을 사용. </li><li> 48 시간 (또는 개별 박테리아의 식민지가 고립 될 수있을 때까지) 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> (액체의 문화를 시드하는 데 사용됩니다) 1 개월 최대 시간 동안 4 ° C에서, 그 후이 작업 판을 보관하십시오. </li><li> 우리의 프로토콜에서는, 우리는 L.를 사용 혈청보기 1/2A EGDe.PrfA * 균주 모노 사이토 겐 만도 1에 예시 된 바와 같이 L. P14.PrfA 4B monocytogenes의 혈청 형은 * 변형은 유사한 결과를 제공합니다. </li></ol></li><li> 그라 ATCC CCL2의 셀은 항생제의 부재 하에서 10 %의 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 성장된다. </li><li> 스크램블 (제어) 및 안티 메트로 된 siRNA는 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에로드 된 독립 풀. <ol><li> RNase가없는 물 500 μL에 siRNA를 160 pmol의 희석 잘 당이 솔루션의 5 μL (최종 농도 1.6 pmol의)를 추가합니다. </li><li> 1 년을 최대 -20 ° C에서이 판을 보관하십시오. </li></ol></li><li> 이전 25 설명한대로 InlC-GST 재조합 단백질을 사용하여 예방 접종에 의해 얻어졌다 InlC 세균의 단백질에 대한 다 클론 토끼 항체. </li></ol> 2. siRNA를 세포 형질 반전 <ol><li> 감염 전에 72 시간 실온 아니라 각각의 RNase없는 물 5 μL에서 1.6 pmol의 siRNA에 포함 된 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에 가져다. </li><li> 300에서 3 분 동안 접시를 원심 분리기우물의 벽에 입금 된 수의 siRNA를 가지고 실온에서 RCF. </li><li> 0.4 % 리포 펙 타민 RNAiMAX 보충 실내 온도 DMEM을 준비합니다. </li><li> (siRNA를 추가하기 전에 더 이상 20 분 이상 형질 매체를 배양하지 않는다) 각 웰에 DMEM / RNAiMAX 형질 매체의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 형질 감염 용액으로 siRNA를 혼합 앞뒤로 플레이트를 놓은 후 siRNA를 리포 펙 타민 - 복합체 형성하도록 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다. </li><li> 한 10 ㎖ 37 ° C 미리 예열 PBS와 합류 또는 하위 합류 세포 배양 플라스크에서 세척 HeLa 세포. </li><li> 1 ㎖ 37 °를 추가하여 HeLa 세포를 분리 C는 세포 배양 플라스크에 트립신을 데워진 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 품어 </li><li> 10 ㎖ 37 ° C에서 다시 정지 세포는 16 % FBS와 보충 DMEM을 데워진. </li><li> 세포를 계산하고 준비 DMEM의 ML 당 12,000 세포의 세포 현탁액은 보충16 % FBS. </li><li> 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 세포를 배포하고 세포는 실온에서 10 분 동안 정착하게 앞뒤로 빠르게 판을 이동합니다. </li><li> 파라 필름과 플레이트를 밀봉하고 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 함유 분위기에서 72 시간 동안 보관 </li></ol> 3. 세포 감염 및 염색 <ol><li> 감염 전날, L.의 단일 식민지을 BHI 한천 플레이트에서의 monocytogenes 및 15 ml의 폴리스티렌 튜브에서 액체 BHI 배지 5 ㎖에 재현 탁. </li><li> 박테리아의 성장을 허용 동거 장치에서 37 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 감염의 날, 하룻밤 L. 1 ㎖를 씻어 테이블 탑 원심 분리기에서 10,600 RCF에서 2 분 원심 분리하여 문화 모노 사이토 겐. </li><li> (분비 세포 독소의리스 테리 O를 포함) 상층 액을 버리고 PBS 1 ㎖ (반복 하오의 펠렛을 다시 일시 중지) 세척 단계 3 더 많은 시간을 t. </li><li> 600 nm에서 세균의 광학 밀도를 읽고 박테리아의 수를 (OD = 1 1E9 박테리아 / ㎖에 해당)으로 추정된다. </li><li> 적절한 L.에게 준비 1 % FBS와 보충 DMEM에 희석 모노 사이토 겐 : EGDe.PrfA *와 같은 고도의 침략 균주를 사용하여, 우리는 잘 당 매체의 30 μL에 5E4 박테리아의 사용을 (감염의 다중성이 2,000 셀 (25)로 추정된다)하는 것이 좋습니다. </li><li> 각 웰의 세포 배양 배지 (80 μL)를 제거하고 L.의 30 μl를 추가하여 교체 매체 모노 사이토 함유. </li><li> 감염 프로세스를 동기화하기 위해, 실온에서 5 분 동안 200 RCF로 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 데워진 알루미늄 블록에 37 ° C에서 가습 5 % CO 2 함유 분위기에서 1 시간 동안 접시를 품어. </li><li> L.에게 제거 각 웰로부터 배지를 모노 사이토 겐을 함유하고 10 % FBS 보충 된 DMEM 데워진의 30 μL를 추가40 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 세포 L.를 죽일 모노 사이토 제네스. </li><li> 데워진 금속 블록에 37 ° C에서 5 % CO 2 함유 분위기에서 4 시간 동안 배양한다. </li><li> 8 %의 포름 알데히드 (오히려 파라 포름 알데히드 폴리머보다 포름 알데히드 단량체가 사용되도록이 솔루션은 신선한 준비를해야합니다)와 보충 PBS의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 세포 배양 배지를 폐기하지 않고, 8 % 포름 알데히드 (최종 농도 4 %)으로 보충 된 PBS 30 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 정착액을 제거하고 (물론 당 PBS 80 μL의 최종 볼륨에있는 세포를 유지) 잘 당 PBS 80 μL와 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 준비 1:250는 PBS의 토끼 안티 InlC 혈청의 희석은 0.2 % 사포닌. </li><li> 잘 PBS를 제거한 후 각각 차 항체 용액 10 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 차를 폐기항체 용액과 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다. </li><li> PBS에서 보조 알렉사 형석 546 커플 안티 - 토끼 항체 (1:250), DAPI 용액 (1:1,500) 및 phalloidin도 - Dy647 (1:150)을 희석하여 0.2 %의 사포닌. </li><li> 각 웰에이 보조 염색 용액 10 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 차 얼룩 솔루션을 취소하고 (물론 각 40 μL의 최종 볼륨을두고 판을 밀봉) 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다. </li><li> 플레이트는 바로 몇 군데 있습니다 또는 후속 분석을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C (알루미늄 호일로 커버)에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 자동화 된 현미경에 장착 된 10 배 목표를 (물론 당 우선적으로 9 이미지를 얻기)를 사용하여 세 개의 서로 다른 채널 (350 nm의, 546 ㎚, 647 nm의) 이미지를 획득. </li><li> InlC 신호는 화상을 이용하여 측정 할 수있다각각 DAPI와 phalloidin도 염색을 이용하여 핵 및 세포 기관의 자동 분할 할 수 CellProfiler 같은 분석 소프트웨어. </li></ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
<li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resistance+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li>
<li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+and+the+growth%2C+movement%2C+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite%2C+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li>
<li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes%3A+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li>
<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
<li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product%2C+a+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li>
<li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Listeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape%3A+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
<li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin%2C+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li>
<li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li>
<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li>
<li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li>
<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

몇개의 파라미터는 InlC 신호의 명확한 검출을 허용하기 위해 충분히 큰 세포질 표시 건강한 세포주의 사용을 포함하는 트립 InlC 검출 프로토콜의 성공에 중요하다. 분석에서 우리는 우리가 인해 세포질 공간의 확장에 대한 우리의 분석에 특히 적합하다 헬라 CCL2 세포의 사용을 제안하고이 문서에서 제시 등의 헬라 교토 세포와 같은 다른 헬라 클론 작은 세포질을 표시하지만, 사용할 수 있습니다 우리 감염 프로토콜 (세포가 종종 CCL2 헬라 세포의 경우와 이웃하는 셀과 중첩되지 않기 때문에 교토 헬라 세포는 특히 세그멘테이션 분석하도록 구성된다.) 이러한 다형 핵 세포 나 대 식세포와 같은 아주 작은 세포질을 제시 세포는 우리의 프로토콜과 조합에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 여기에 존재하는 것과 같은 이미징 프로토콜의 제한은 세포의 최소한의 양이 infe되어야한다는 사실cted는 제어 조건에 관련 단층으로, 충분히 resolutive 파워 시스템을 제공하기 위해 : 몇...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

그람 양성 세균 리스테리아 균은 숙주 세포에 침입의 국제화 공포를 방해하고 숙주 세포 1의 세포질에서 복제 식품 매개 병원체이다. L. 세포 및 동물 모델에서 관찰 된 세균의 독성 특성의 지속성과 관련된 실험실 컨텍스트 (급속한 성장, 건강한 개인에 대한 낮은 독성)의 조작의 용이성 모노 사이토 겐 (용혈성 활동, 백혈구가)의 주요 모델로 1960 년에 처음 사용 허용 세포 내 기생의 감염 2에 대한 세포 성 면역의 이론적 기초의 설립을위한 연구. 1980 년대 후반과 1990 년대 초반, 세균의 세포주기 3뿐만 아니라 가장 중요한 세균의 독성의 분자 특성의 해부는 4-7 L.의 사용을 선호하는 요인 조작 및 스터드의 핵심 분자 도구로 모노 사이토 제네스숙주 세포 기능의 Y. 리스테리아 속에서 무독성의 존재 (L.의 innocua)과 악성 (L. monocytogenes에) 종 비교 게놈 연구 8 도로를 포장하는, 함께 완전한 L.의 최근 설립과 함께 모노 사이토는 L.의 진화에 대한 우리의 이해를 증가, 9 사체 인간 병원체 등의 감염을위한 모델 시스템으로 모노 사이토는 10 연구. L. monocytogenes에 자신의 숙주 세포 수용체 각각 E-cadherin의와 메트로, 11 ~ 12과 박테리아 표면 단백질 InlA 및 InlB의 상호 작용에 따라 숙주 세포로의 내면화를 유도한다. 초기 후보 기반 연구의 InlB - 중요한 음향과 InlA 침략의 통로 (13)와 phosphoinositide 3 - 키나제 (PI 3-K)의 중요한 구성 요소로서 α / β의 catenins - 굴지 링크의 식별에지도 의존 침공 casca데 14 ~ 15. 프로테오믹스 및 기능 기반의 분석 이후에 허용 된 새로운 골격 요소 (16)와 숙주 세포의 침공에 필요한 지질 두 번째 메신저 (17)의 식별. 전사 연구 (18)와 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스 (19)는 최근 호스트 신호 폭포의 활성화와 L. 동안 면역 반응의 억제에 관한 새로운 빛을 발산했다 감염 모노 사이토 겐. 시스템 생물학은 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 (kinomes, 전체 게놈)의 큰 세트의 불 활성화에 기반 접근 (siRNA의) 침묵은 최근 식균 작용을 포함한 특정 세포 기능의 컨텍스트에서 폭포 신호 글로벌 호스트의 분석을위한 새로운 길을 열고있다 병원체 내면화 20. 게놈 전체의 siRNA 화면은 이전에 L.의 감염에 필요한 세포의 계곡을 조사하기 위해 수행 된 식세포 초파리 모노 사이토 제네스 </em&gt; S2 세포를 21 ~ 22 만, 이러한 유형의 분석은 비 식세포로 수행되지 않은, 생체 내에서 감염을위한 중요한 표적을 나타낸다. 우리는 L.에 의해 감염의 후반 단계의 현미경 검출을위한 프로토콜을 최적화 한 상피 세포 내 세균 항목의 높은 처리량의 siRNA 연구에 적합 모노 사이토 제네스. 우리의 분석은 매우 침습적 L. 활용 PRFA, L.의 주요 전사 조절에 점 돌연변이를 제시 변형 모노 사이토 겐 독성이 6 요인 리스테리아 모노 사이토 겐 (PRFA * 이름)이 돌연변이는 23 PRFA는 구조적으로 활성 렌더링 때문에, 그렇지 않으면 제대로 감염된 비 식세포의 세균 항목을 호의를 침공 단백질 InlA 및 InlB의 발현 증가로 연결됩니다. 감염에 대한 우리의 판독은 분비 된 세균의 단백질 InlC의 세포질 축적의 검출을 기반으로이 분자는내 세포질 L.에 의해 우선적으로 발현되는 형질 발현 이펙터 모노 사이토 9 참여는 박테리아 세포에 세포 24를 전파뿐만 아니라, 호스트 면역 반응 25을 변조하는뿐만 아니라. 세포 내 세균에 의해 InlC 분비의 형광 표시가 명확하게 감염되지 않은 세포에서 감염과 구별 할 수 있지만, 또한 엔드 포인트 이후의 여러 단계에서 감염을 해부하는 데 사용할 수있는 판독 나타냅니다뿐만 아니라 : 항목, 액포 탈출, 세포 내 세균을 증식과 세포 간 확산. 이 현미경 기반 프로토콜 따라서 L. 의한 숙주 세포의 감염에 관련된 세포 경로를 연구하는 siRNA를 스크린에 연결될 수있다 모노 사이토 제네스.

<table><tbody><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td>액체 BHI 제제</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>BHI 한천 플레이트용 액체 BHI 보충 </td></tr> 열 <tr><td>비활성화 소 태아 혈청</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 (16 %)</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td>각 실험 전에 신선하게 준비</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Dy647</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Scramble</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Met</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>블랙 384웰 현미경 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver Z1 현미경</td><td>Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 분석 소프트웨어</td><td>Broad Institute</td><td>공개 소프트웨어는 <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a에서 사용할 수 있습니다></td><td></td></tr></tbody></table>

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 inlc 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

세균의 세포 내 병원균 절묘하게 조작 및 호스트 대상 조직의 감염에 필요한 세포의 기능을 파괴하는 그들의 능력에 의한 세포 신호 폭포를 해부하는 분자 도구로 생각 될 수있다. 이러한 세균성 병원균 가운데, 리스테리아 균은 세포 면역 반응의 특성에 세포 내 기생에 대한 패러다임으로 사용 된 그람 양성 미생물이며, 세포 골격과 막 인신 매매의 역 동성을 제어하는 분자 경로의 발견에서 쓸모있는 역할을했다한다. 이 문서에서는, 우리는 L. 늦은 세포 감염 단계의 검출을위한 강력한 현미경 분석을 설명 모노 사이토는 InlC, 감염된 세포의 세포질에 축적 박테리아 분비 단백질의 형광 표지에 근거,이 분석은 숯불하기 위해 자동화 고 처리량 소 간섭 RNA 스크린에 연결될 수있다감염의 상향 또는 하향 조절에 관여 세포 신호 전달 경로를 acterize.

세포질 InlC의 형광 표지는 L.에 의해 세포 감염에 대한 강력한 판독을 제공합니다 모노 사이토는,도 1에 도시 된 바와 같이 : 현미경의 중앙 셀은 높게 P14.PrfA는 * 23 균주에 의한 감염에는 위상 콘트라스트 화상 (화살촉,도 1a)에서 관찰 될 수 있으며, 이러한 DAPI 신호에 의해 확인 된 것처럼 여기서 개별 박테리아 깨끗이 (도 1b)를 구별 할 수있다. (그림 1C에서 DAPI 염색에 중첩) InlC 염색이 분비 단백질은 밀도가 감염된 세포의 세포질에 축적 감염된 숙주 세포 형태의 명확한 검출 할 수 방법을 보여줍니다. 형광 phalloidin도 (그림 1D)와 액틴 세포 골격의 염색 완전한 접종 세포 단층의 형태에 관한 정보를 제공하고 추가하는 방법 이웃 감염되지 않은 세포 (별표 세포 핵) D 보여O 모든 InlC ...

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세균 감염에 필요한 새로운 세포 기능을 발견하기 위해 siRNA 분석의 맥락에서 병원균 listeria monocytogenes의 세포 침입을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 세포 siRNA 역전이(reverse transfection)를 수행하여 특정 호스트 세포 기능을 비활성화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 세포에 listeria monocytogenes를 접종하며, 이 세균은 siRNA 처리에 의해 영향을 받은 세포 기능에 따라 세포를 차별적으로 감염시킵니다.다음으로, 세포 핵을 표지하기 위해 감염된 세포를 면역형광법으로 처리합니다. 세포골격 내의 활동과 박테리아 단백질 INLC 결과가 얻어지며, 개별 세포 내 INLC 단백질 분포에 대한 현미경 분석을 바탕으로 감염된 세포를 식별하고 비감염 세포와 구별합니다. Gentamycin 침투 분석과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 FU 방식으로 사용할 수 있다는 점입니다.따라서 이 방법은 eria의 내입에 필요한 새로운 신호 전달 경로를 식별함으로써 세포 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 감염 72시간 전 whole cells에 처리합니다. 각 웰에 5 µL의 RNase-free water에 녹인 1.6 pmol의 SIR A가 담긴 검은색 384-웰 현미경용 세포 배양 플레이트를 실온으로 가져옵니다. SIR A를 녹이고 웰 벽면에 붙어 있을 수 있는 SIR A를 내려보내기 위해, 실온에서 300 RCF로 3분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 0.4% Lipofectamine RNAiMAX가 보충된 실온의 DMEM을 준비합니다.siRNA를 첨가하기 전, transfection medium을 20분 이상 배양하지 마십시오. 384-well plate의 각 well에 transfection medium 25 µL를 첨가합니다. 플레이트를 앞뒤로 움직여 siRNA와 transfection solution을 혼합합니다.그 다음, siRNA 리포좀 복합체가 형성될 수 있도록 플레이트를 실온에서 1시간 동안 유지합니다. 합류(confluent) 또는 부분 합류(sub-confluent) 상태의 세포 배양 플라스크에서 HeLa 세포를 37 °C로 예열한 PBS 10 mL로 한 번 세척합니다. 세포 배양 플라스크에 37 °C로 예열한 트립신 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 3~5분 동안 배양하

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 배양된 대식세포의 in vitro 감염에 따라 세포 내 및 세포 외 병원성 박테리아인 Listeria monocytogenes를 정량화합니다.

In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

이 비디오는 인간 상피 세포의 Shigella 감염 시 지역 및 전역 칼슘 이온 반응을 감지하는 기술을 보여줍니다. Shigella는 숙주 세포에 침입하여 침입 효과기를 방출하여 세포 내 칼슘 수치에 영향을 미칩니다. 국소 및 전체 세포질 칼슘의 진폭과 빈도는 형광 지표를 사용하여 연구됩니다.

박테리아에 감염된 세포의 칼슘 반응을 연구하기 위한 이미징 기술

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을...

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다.  박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는.  여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

배우세요 Listeria monocytogenes 세포 침입을 정량화하는 현미경 기반 분석법을 사용하여 세균 감염에 필요한 숙주 세포 기능을 발견하는 방법을 알아보세요.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징

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