조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

본 절차의 전반적인 목표는 세포 시트를 사용하여 조직 공학 패치를 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포 배양 표면을 온도 감응성 폴리머인 poly propyl acrylamide(p nipam으로도 함)로 처리합니다. 두 번째 단계는 폴리머가 코팅된 표면에서 목적 세포를 고밀도로 배양하여 세포 시트를 생성하는 것입니다.

다음으로, 플레이트의 온도를 낮추어 시트를 들어 올리면 세포가 세포 시트 형태로 플레이트에서 분리됩니다. 마지막 단계는 손상되지 않은 세포 시트를 찢어지지 않게 하여 이식용 구조물로 옮기는 것입니다. 최종적으로, 간단한 광학 현미경을 사용하여 이식 가능한 조직 공학 재료를 만드는 과정 동안 세포 시트가 성공적으로 생성되었으며 조작 과정 중에도 잘 유지되었음을 확인할 수 있습니다.

세포를 하이드로겔과 같은 매트릭스에 매립하는 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세포의 측면 경계를 생성하여 기능적 조직으로 유지할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 조직 공학 분야의 추가적인 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포가 이렇게 조직화된 상태일 때 이식 후 생존율이 얼마나 되는지 등을 연구할 수 있습니다.

본 절차의 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.William Turner와 Ms.Snapshot sand do가 맡았습니다. 먼저, 60% 톨루엔과 40% 헥산 혼합 용액 2 mL에 P nipam 2.6 g을 녹입니다. 그다음, 혼합물을 60 °C에서 10분 동안 가열하고 P nipam이 완전히 용해될 때까지 교반합니다.

그런 다음 거름종이를 직경 60 millimeter의 원형으로 자른 후 뷰히너 깔때기에 넣습니다. 용액을 뷰히너 깔때기를 통해 미리 무게를 잰 유리 비커에 여과합니다. 비커와 그 내용물을 벨 진공 용기에 넣고 하룻밤 동안 보관합니다.

그 후, p nipam이 담긴 비커의 무게를 잽니다. 이어서 p nipam에 이소프로필 알코올을 첨가하여 50 50 중량비 용액을 만듭니다. 다음으로, 해당 용액 2 mL를 조직 배양 플레이트 표면에 떨어뜨리고 UV 광선 아래에서 5분 동안 코팅합니다.

그다음, 세포 배양에 사용하기 전 플레이트를 2 mL의 따뜻한 PBS로 두 번 세척합니다. 이 절차에서는 먼저, 세포를 2 mL의 따뜻한 PBS로 세척하여 쥐의 대동맥 평활근 세포를 분리합니다. 다음으로, 세포에 3 mL의 trypsin 또는 다른 절단 해리 용액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 10% FBS가 함유된 배양액 또는 PBS 3 mL를 세포에 첨가합니다. 그 후, 원심분리관(conical tube)에 세포를 수집하여 세포 수를 측정합니다. 이어서, 세포를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 흡입하여 제거하고 세포를 성장 배지에 다시 부유시킵니다. 그다음 세포가 포함된 배지를 35 mm 열민감성 플레이트에 100% Confluence에 도달할 수 있는 농도로 분주한 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 플레이트에 부착되도록 유지합니다. 이제 혈관 내피 세포를 수집하여 단일 세포 현탁액으로 분산시킵니다.

단일 세포 분산을 위해 1x trypsin, accutase 또는 세포 해리 버퍼를 사용할 수도 있습니다. 다음으로, 동일한 양의 대두 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 또는 PBS에 희석한 10% FBS를 사용하여 트립신 효소를 불활성화합니다. 그런 다음 15 mL 원추형 튜브에 세포를 수집합니다.

혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 4 mm 패치 크기에 필요한 부피를 계산합니다. 이후 200만 개의 내피세포를 분취하여 새로운 15 mL 원추형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 세포를 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 흡입하여 세포가 원추형 튜브 바닥에 펠릿 형태로 남게 합니다. 이제 제조사 프로토콜에 따라 고농도 오린(aurin) 하이드로젤을 준비합니다.

고농도 aurin과 액상 젤라틴을 1:1 비율로 혼합합니다. 이어서 최종 총 부피의 80%를 펠릿이 들어 있는 원심 분리 튜브로 옮겨 내피세포를 고농도 aurin 젤라틴 혼합물에 재부유시킵니다. 다음으로, 부유된 세포를 섬유성 매트릭스로 옮깁니다.

최종 총 부피의 20%에 해당하는 가교제를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 세포가 포함된 35 mm P nypa 처리 플레이트를 배양기에서 꺼내 세포 배양 후드로 옮깁니다. 실온에서 세포로부터 배지를 빠르게 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 37 °C의 6% normal gelatin 2 mL를 젤라틴이 아직 따뜻할 때 플레이트에 추가하고, 금속 격자를 normal gelatin 표면 아래로 잠기도록 젤라틴 안에 배치합니다. 이후, 플레이트 전체를 얼음 위에 5~7분 동안 두어 젤라틴을 굳힙니다. 7분 후, 스패튤라를 사용하여 플레이트 측면에서 젤라틴 가장자리를 조심스럽게 분리합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 플레이트에서 금속 격자를 들어 올립니다. 세포 시트를 디쉬로 옮겨 섬유질 매트릭스 하이드로겔 조합 위에 배치합니다. 조직 배양 플레이트에 37 °C 배지 2 mL를 추가하고 하룻밤 동안 배양하여 세포 시트가 하이드로겔 표면에 부착되도록 합니다.

그동안 용액이 데워지면 금속 격자를 제거합니다. 본 실험에서는 세포를 Pippa 코팅 표면에서 배양한 후, 이를 시트 형태로 섬유성 매트릭스 표면으로 이동시켰습니다. 젤라틴 금속 격자를 사용하여 옮기지 않은 초기 시도에서는 세포가 작고 너덜너덜한 조각 형태로 나타나는 결과가 발생했습니다.

이 이미지는 MitoTracker로 적색 염색된 쥐 대동맥 평활근 세포, Calcium AM으로 녹색 형광 염색된 인간 제대정맥 내피세포, 그리고 투과광 이미지를 결합한 초기 패치 디자인의 합성 사진입니다. 그리고 이것은 세포 시트와 더 강한 기반 섬유상 매트릭스 하이드로겔 조합의 합성 이미지입니다. 이 합성 이미지는 강한 기반 섬유상 매트릭스를 통해 패치의 바닥면에서 촬영되었으며, 세포 시트의 이 합성 사진은 기반 섬유상 매트릭스 위에서 촬영되었습니다.

시트 내의 하이드로젤 복합 세포들이 하단의 섬유성 매트릭스 하이드로젤 복합체를 덮고 있으며, 세포들의 응집으로 인해 가장자리 부분에서 형광이 증가한 것을 확인할 수 있습니다. 이것은 구조물의 투과 이미지이며, DPI의 자가형광 천연 섬유성 기저 매트릭스가 여기에 표시되어 있습니다. 이 절차를 통해, 세포 정렬과 통신이 이식 성공에 어떤 영향을 미치는지와 같은 다른 조직 공학적 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 기술을 통해 조직 공학 연구자들은 여러 세포 유형을 이식하는 복잡한 방법들을 탐구할 수 있습니다. 용매를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 적절한 마스크 착용 및 화학 후드 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.