조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설
October 3rd, 2014
복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다. 이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 세포 시트를 사용하여 조직 엔지니어링 패치를 구성하는 것입니다. 이는 먼저 세포 배양 표면을 p nipam이라고도 하는 열에 민감한 고분자 폴리 프로필 아크릴아미드로 처리하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 폴리머 코팅 표면에서 고밀도로 관심 세포를 배양하여 세포 시트를 만드는 것입니다.
다음으로, 플레이트 온도를 낮추어 시트를 들어 올려 셀을 셀 시트로 플레이트에서 분리할 수 있습니다. 마지막 단계는 이식을 위해 구조물에 찢어지지 않고 온전한 세포 시트를 옮기는 것입니다. 궁극적으로, 간단한 광학 현미경을 사용하여 이식 가능한 조직 공학 재료를 만드는 동안 세포 시트가 조작 중에 생성되고 유지되었음을 보여줄 수 있습니다.
하이드로겔과 같은 매트릭스에 세포를 내장하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술에서 세포 측면 경계가 기능적 조직으로 생성되고 유지될 수 있다는 것입니다. 이러한 방법은 또한 조직 공학 분야에서 추가 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 이식 후 세포가 이렇게 조직화된 상태에 있을 때 얼마나 잘 살아남을까요?
이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사후 연구원인 윌리엄 터너(William Turner) 박사와 스냅숏 샌드(Ms.Snapshot sand)가 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 2.6g의 P nipam을 60% 톨루엔, 40% 헥산 용액 2ml에 녹입니다. 다음으로 혼합물을 섭씨 60도로 10분 동안 가열하고 P nipam이 용해될 때까지 저어줍니다.
그런 다음 여과지를 직경 60mm의 원으로 자르고 buchner 깔때기에 넣습니다. Buchner 깔때기를 통해 용액을 미리 계량된 유리 비커로 여과합니다. 비커와 내용물을 벨 진공 청소기에 밤새 보관하십시오.
그 후, p nipam으로 비커의 무게를 잰다. 그런 다음 P nipam에 이소 프로필 알코올을 첨가하여 50 50 중량 용액을 만듭니다. 그런 다음 조직 배양 플레이트의 표면에 용액 2ml를 놓고 자외선 아래에서 5분 동안 코팅합니다.
그런 다음 세포 배양에 사용하기 전에 2ml의 따뜻한 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 이 절차에서는 먼저 2ml의 따뜻한 PBS로 세포를 세척하여 쥐 대동맥 평활근 세포를 분리합니다. 다음으로, 3ml의 트립신 또는 다른 절단 해리 용액을 세포에 첨가하고 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 10%FBS를 함유한 배양 배지 또는 PBS 3ml를 세포에 추가합니다. 그런 다음 원뿔형 튜브에 세포를 모아 세십시오. 그런 다음 5분 동안 1000RPM으로 셀을 회전시킵니다.
상층액을 흡인하고 성장 배지에서 세포를 재현탁합니다. 다음으로 세포를 포함하는 배지를 100% Confluence를 달성하는 농도로 35mm 열에 민감한 플레이트에 배치한 다음 플레이트에 대한 세포 접착력을 유지하기 위해 밤새 섭씨 37도에서 배양합니다. 이제 내피 세포를 모아 단일 세포 용액으로 분산시킵니다.
하나의 x 트립신을 사용하면 acuate 또는 cell dissociation buffer를 단일 세포 분산에 사용할 수도 있습니다. 다음으로, PBS에서 동일한 양의 대두 트립신 억제제 또는 10%FBS로 트립신 효소를 비활성화합니다. 그런 다음 15ml 원추형 튜브에 세포를 수집합니다.
혈구 분석기로 세포를 세고 패치 치수에 필요한 부피를 계산하십시오.4mm 패치, 200 만 개의 내피 세포를 사용한 후 200 만 개의 세포를 추출하여 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 5 분 동안 세포를 원심 분리하고 상등액을 흡인하여 세포를 원뿔형 튜브에 펠릿으로 남겨 둡니다. 이제 회사 프로토콜에 따라 고 오린 하이드로겔을 준비합니다.
고농도 오린과 리퀴드 젤라틴을 1:1 비율로 섞습니다. 그 후 총 최종 부피의 80%를 펠릿이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮기고 높은 오린 젤라틴 혼합물에 내피 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 부유 세포를 섬유질 매트릭스로 옮깁니다.
crosslinker의 총 최종 부피의 20%를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 인큐베이터에서 세포가 들어 있는 35mm P nypa 처리 플레이트를 제거하고 세포 배양 후드에 넣습니다. 실온에서 세포에서 배지를 빠르게 흡인합니다.
그런 다음 젤라틴이 아직 따뜻할 때 섭씨 37도, 6% 일반 젤라틴 2밀리리터를 플레이트에 넣고 금속 격자를 젤라틴에 넣고 일반 젤라틴 표면 아래에 담그십시오. 그런 다음 접시 전체를 얼음 위에 5-7분 동안 올려 젤라틴이 굳어지도록 합니다. 7분 후, 주걱을 사용하여 접시 측면에서 젤라틴 가장자리를 조심스럽게 분리합니다.
그런 다음 집게로 플레이트에서 금속 격자를 들어 올립니다. 세포 시트를 접시에 옮기고 섬유질 매트릭스 하이드로겔 조합 위에 놓습니다. 조직 배양 플레이트에 섭씨 37도의 배지 2ml를 추가하고 세포 시트가 하이드로겔 표면에 부착될 수 있도록 밤새 배양합니다.
그 동안 용액이 예열된 후 금속 격자를 제거하십시오. 여기서, 세포는 Pippa 코팅 표면에서 배양된 다음 섬유질 매트릭스의 표면으로 시트로 이동되었습니다. 젤라틴 금속 격자로 옮기지 않은 초기 시험에서는 작은 너덜너덜한 패치가 생성되었습니다.
이 이미지는 미토 추적기, 붉게 염색된 쥐 대동맥 평활근 세포, 칼슘 암 녹색 형광 인간 배꼽 정맥 내피 세포 및 투과광 이미지를 결합한 초기 패치 디자인 합성 사진을 나타냅니다. 그리고 이것은 더 강한 염기 섬유질 매트릭스 하이드로겔 조합과 결합 된 세포 시트의 복합체입니다. 이 합성 이미지는 패치의 바닥에서 더 강한 기본 섬유 매트릭스를 통해 촬영되었으며, 세포 시트의 이 복합 사진은 기본 섬유 매트릭스 위에 촬영되었습니다.
시트의 하이드로겔 조합 세포는 기본 섬유질 매트릭스 하이드로겔 조합을 덮고 있으며, 이는 세포의 뭉침으로 인해 가장자리에서 증가된 형광을 보여줍니다. 이것은 구조체의 투과 이미지이며 DPI의 자가형광 자연 섬유질 기저부(autofluorescent natural fibrous base matrix)가 여기에 나와 있습니다. 이 절차에 따라 다른 조직 공학 실험은 세포 정렬 및 통신이 이식 성공에 미치는 영향과 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.
이 기술을 통해 조직 공학 연구자들은 여러 세포 유형을 이식하는 복잡한 방법을 탐구할 수 있습니다. 용제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 마스크와 화학 물질 후드를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.
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개요
이 연구는 세포 시트를 사용하여 조직 공학 패치를 구성하는 데 중점을 둡니다. 이 과정에는 열에 민감한 폴리머로 세포 배양 표면을 처리하고, 임플란트를 위한 손상되지 않은 시트를 만들기 위해 세포를 배양하는 것이 포함됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 조직 공학
- 세포 배양 기술
- 생체 재료
배경
- 복잡한 조직의 구조화된 구조를 만들려면 여러 가지 재료와 세포 유형이 필요합니다.
- 기관별 층화된 세포 시트를 활용하면 조직 통합이 향상됩니다.
- 생물학적으로 유래한 재료는 새로운 혈관 형성을 지원할 수 있습니다.
- 열에 민감한 폴리머는 세포 시트의 분리를 촉진합니다.
연구 목적
- 조직 공학 패치를 구성하는 방법을 개발하는 것.
- 개선된 임플란트 기술을 위해 세포 시트를 활용하는 것.
- 조작 중 세포 성분을 유지할 수 있는 가능성을 입증하는 것.
사용된 방법
- 폴리 프로필 아크릴아미드(pNIPAM)로 세포 배양 표면을 처리합니다.
- 고밀도의 폴리머 코팅된 표면에서 세포를 배양합니다.
- 온도를 낮춰 세포 시트를 분리하여 들어 올립니다.
- 손상되지 않은 세포 시트를 임플란트용 구조물로 옮깁니다.
주요 결과
- 찢어지지 않고 조작할 수 있는 세포 시트를 성공적으로 만들었습니다.
- 광학 현미경으로 과정 중 세포 시트의 무결성을 확인했습니다.
- 이 방법은 임플란트 가능한 조직 공학 재료의 구성을 허용합니다.
- 공학된 조직의 혈관화 향상 가능성을 입증했습니다.
결론
- 이 연구는 조직 공학 패치를 만드는 실행 가능한 방법을 제시합니다.
- 열에 민감한 폴리머를 사용하는 것은 세포 시트 조작에 효과적입니다.
- 이 접근법은 조직 공학 분야를 크게 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables the construction of multicellular 3D scaffolds using layered cell sheets, addressing a key challenge in regenerative medicine: delivering organized, multi-cellular constructs with preserved cell-cell interactions and vascular potential. By preserving lateral cell borders and enabling sheet transfer onto biomatrix composites, the technique supports predictive confidence in preclinical models of tissue integration and function. It offers a scalable, off-the-shelf approach for therapeutic tissue design applicable across multiple organ systems beyond cardiac tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining cell sheet integrity and lateral adhesions during manipulation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through organized cell delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized, implantable tissue constructs.
- Operational Value: Supports assay readiness through temperature-dependent sheet detachment and transfer, enabling scalable workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by combining organ-specific cells with neovascular-permissive hydrogels and endothelial cells.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation via off-the-shelf, implantable patches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in tissue engineering applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled delivery of layered cell types with preserved interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible cell sheet formation and transfer onto biomatrix platforms.
- Analytics: Generates quantitative outputs via light microscopy and fluorescence tracking to assess sheet integrity and vascular integration.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by constructing implantable patches with vascular potential for functional tissue assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for generating off-the-shelf tissue constructs across multiple organ targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell-cell interactions and organized tissue architecture.
- Operational Value: Standardization and scalability via temperature-sensitive polymer coating and sheet lifting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in tissue integration and survival.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through enhanced predictive value in preclinical tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, biomaterials handling, and temperature-sensitive polymer techniques.
- Depends on UV crosslinking, hydrogel preparation, and precise temperature control for sheet detachment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sheet quality and transfer efficiency.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or organ-specific matrices.
- Includes practical limitations such as solvent hazards during pNIPAM preparation and the need for aseptic handling throughout.
