Name: 췌장 신경 가소성 시뮬레이션 : 체외 이중 신경 가소성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 췌장 신경 가소성 시뮬레이션 방법을 통해 DRG와 MP 신경 세포에서 형태학적 및 전기생리학적 변화를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 췌장암과 만성 췌장염 연구에 활용됩니다.

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모든 저자가 제시 한 분석의 설립 및 검증으로하고 원고의 초안에 기여했다.

프로토콜의 모든 동물 실험 절차는 TECHNISCHE Universität 뮌헨, 독일의 동물 관리 지침을 따르십시오. 1. 미디어 / 준비를 추출 <ol><li> 조직의 균질화 조직 균질의 품질은 배양 된 뉴런 neuroplastic 변경의 결과 탐지에 매우 중요합니다. 여기서, 균질화는 조직의 온도에 큰 증가없이 조직의 분리를 가능하게하는 것이 좋습니다. <ol><li> 전송 5mm × 5 ㎜ × 5 ㎜의 직접 조직 homogenator에서 고체 상태에서 액체 질소와 장소에 -80 ° C에서 췌장 조직의 큐브. 이상적인 homogenator는 녹이다를 허용하지 않고, 충분히 빨리 조직을 떼어 놓다 것입니다. </li><li> 즉시 분리 후, 0.1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 300-500 μL에서 고체 분말 형상의 파쇄를 재현 탁. 여기,이 신경 세포를 용해 수 있기 때문에 (예 : RIPA 같은) 용해 버퍼를 사용하지 않습니다.</li><li> 벤치 원심 분리기 (예 : 21,130 XG)의 최대 속도로 적어도 15 분 동안 균질화를 원심 분리기. 조직 추출물을 나타내는 맑은 상층 액을 수집합니다. </li></ol></li><li> 세포주 상층 액 <ol><li> 정상적인 성장 매체에 80 %의 합류 - 관심의 세포가 적어도 70에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 이러한 미디어는 혈청 성분을 포함하고 신경 세포의 성장에 따라 통제 할 수없는 효과를 발휘할 수있다. 따라서, 원하는 세포 밀도에 도달 한 후, 세포 배양 등급 PBS로 최소한 3 배 당신의 세포를 세척하고 최대 48 시간 동안 무 혈청 배지 (SFM)에 배치합니다. 참고 : 여기에, (췌장 성상 세포와 같은) 일부 세포가 정상 상태와 구조를 유지하기 위해 자신의 성장 배지에 혈청을해야 할 수도 있음을 고려해야합니다. 그러한 경우에, 본래 세포 능의 필요한 최저 혈중 콘텐츠를 찾기 위해 그 셀의 직렬 혈청 배지에서의 희석을 수행N. </li><li> 브래드 포드 단백질 분석을 통해 조직 균질 액 또는 세포 상층 액의 단백질 농도를 측정한다. 이러한 값이 조직 및 세포 종류에 따라 다르지만, 췌장 조직 추출물에 대해, 하나는 5-12 ㎍ / μL 사이의 농도 범위를 예상하고, 3-8 ㎍ / μL 사이 세포주 상청액위한 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 나누어지는 추출물과 세포의 상층 액 분석에 사용되는 농도에 따라 신경원 매체 추출물 또는 상등액에 최종 농도가 100 ㎍ / ㎖의 5,8이어야한다. 참고 : 신경 세포는 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 배지에서 성장 분석을 위해, 하나는 잘마다 각각의 추출물 또는 상층 액의 단백질 50 μg을 필요로한다. 약 10 ㎍ / μL의 전형적인 추출물의 농도로, 하나는 각 웰에 대한 추출 / 상층 액의 5 μl를해야합니다. 각을 맞춘다에서G 세중으로 수행,이 추출물 / 상층 액 15 μL에 해당하는 것입니다. 다른 조직이나 세포 유형의 경우, 최종 추출물 또는 상층 액 농도의 시리얼 희석을 수행하고 다른 추출물 / 상층 액의 농도 사이의 관찰 된 신경 영양 효과를 비교. 뉴런의 3. 분리 추출 / 상층 액을 수집이 완료되면, 신경 세포의 분리와 함께 계속한다. <ol><li> DRG 뉴런의 경우, 생후 (P) 2-12 잘린 및 DRG의 stereomicroscopic 해부 (그림 1A) 후 사이에 태어난 쥐의 DRG를 허리에 자궁 경부를 수집합니다. , 24 - 웰 플레이트에 충분한 DRG 뉴런이 접시 당 (52 DRG를 동등) 한 신생아 쥐의 DRG를 허리 모든 자궁 경부를 수집하기 위해. <ol><li> microscissors에 의해 주변 장치 (신경) 및 DRG의 중앙 돌출부 (뿌리)을 버려야. 장소에 돌기를두면 분쇄을 방해하고 T를 증가그는 섬유 아 세포에 의해 문화의 위험을 오염. </li></ol></li><li> MP 뉴런의 경우, 수동으로 소장과의 장간막을 버려야 조심스럽게 소장 (MP 격리에 대한 자세한 프로토콜, 샤퍼 등. 9 그림 1B 참조)의 seromuscular 층을 벗겨. MP를 들어, 24 잘 플레이트 당 두 쥐의 신경 얼기를 수집합니다. 참고 : 그들은 소장에서 성공적인 분리를 방해하기 때문에 seromuscular 층에서 눈물을 방지하기 위해 될 수있는 한 부드럽게 대하기 위해보십시오. </li><li> 겐타 마이신 (500ml의 배지에서 20 ㎎) 및 metronidazol (500 ㎖의 중간에있는 2.5 mg)을 함께 제공 얼음처럼 차가운 최소한의 필수적인 매체에서 DRG와 seromuscular 층 (MEM)를 수집합니다. </li><li> DRG의 모음에 따라, 20 ~ 30 분 동안 콜라게나 유형 II와 함께 제공 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에서 그들을 품어. MP 격리를 들어, 연령에 따라 1 ~ 3 시간 사이에 콜라게나 유형에 품어동물 (그림 1C)의. </li><li> MP의 경우, 실체 현미경 그물코 형상 MP 조각들을 수집하고 빙냉 MEM으로 옮긴다. </li><li> 그런 다음 직경 감소와 주사기를 통해 DRG와 MP를 씹다. 참고 : 과도한 분쇄가 신경을 파괴, 그러나 더 적은 아교 세포 수 있습니다. </li><li> DRG 또는 MP를 포함하는 매체가 5 분 93.9 XG에서 정지 흐림, 원심 분리가되면, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5의 L-글루타민에게 보충 Neurobasal 매체의 중간에 resuspend을 (폐기 2 % B-27). </li><li> 혈구에 의해 셀의 총 개수 (즉, AND 신경 아교)를 센다. 주 : 필요한 세포의 수가 측정 파라미터에 의존한다. 신경 돌기 밀도의 정량, 신경 돌기는 한 가지, perikaryonal 사이즈의 측정보다 밀도 배양함으로써 세포의 더 많은 수를 필요개별 뉴런의 패턴을 분기. 신경 돌기의 밀도 측정의 경우, 예를 들어 잘 10,000 세포 (신경 세포 + 아교) / 또는 1,500 뉴런 / 잘 사용합니다. 개별 뉴런, 짧은 (1 분 길이) 세포의 trypsination 2,500 세포 / 웰 또는 400 뉴런 /의 파종에 대한 형태 학적 잘 좋습니다. 한 쥐에서 얻은 세포의 전형적인 수율은 약 300,000-500,000 세포입니다. </li><li> 전날 밤에 코팅 된 13mm 커버 슬립에 세포를 씨앗과 (100 U / ㎖ 페니실린과 보충, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5 mM의 L-글루타민 2 % B-27) Neurobasal 매체 (그림에게로 우물을 위로 1D). 참고 : 사용 폴리 - D - 라이신 (40 ㎎ / 평방 미터) 또는 오르니 틴과 라미닌 코팅 된 코팅 (1 ㎎ / ㎖ 각) 커버 전표. 세포는 이렇게 많은 세포 불필요되는 실험 (즉 신경 돌기 밀도 측정)에 적합하다, 매우 빠른 폴리-D-라이신에 부착. 라미닌에 첨부 파일은 일반적으로 몇 가지에약한 것을하지만, 라미닌은 신경 돌기 가지의 강력한 프로모터이다. 따라서, 신경 분지와 신경 돌기의 길이에 대한 측정을 위해, 오르니 틴 / 라미닌 코팅을 선호한다. </li><li> 세포는 하룻밤 우물에 부착 할 수 있습니다. 다음 날, (100 ㎍ / ㎖의 최종 추출물 / 상층 액 농도) 추출물이 첨가 된 미디어를 준비합니다. </li><li> 시드 매체를 대기음하고 PBS로 선택, 매우 부드러운 세척을 수행 한 다음 천천히 추출 / 상층 액을 보충 된 미디어 (그림 1E)를 피펫. </li><li> 세포는 48 시간 동안 성장하자. 미디어를 대기음 (그림 1 층) 면역 염색을 위해 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. </li><li> 신경 세포의 특정 (예 : 베타 III-튜 불린)과 glia의 별 (예 : 아교 fibriallary 산성 단백질 / GFAP) 마커 (그림 1G)를 사용하여 이중 면역 형광 염색을 수행합니다. </li><li> 형태 학적 들어, 콤비네이션 위스콘신에서 CCD 카메라가 장착 도립 광학 현미경을 사용신경 돌기의 밀도를 측정 할 수 자동화 소프트웨어 (표 참조) 번째. </li><li> 의 연결을 문화의 신경 돌기의 밀도는 50 ㎛ × 50 ㎛의 격자를 중첩시키고 교차 섬유 측정 단위 면적당 섬유 밀도를 계산하여 각 coverslip에 대한 밀도 높은 성장의 4 가지 영역에서 200 배 배율에서 4-5 대표 현미경에서 측정됩니다. 신경 돌기의 가지, 신경 세포 당 가지 수를 의미, 평균 분기 길이 perikaryonal 크기는 신경 돌기 및 perikarya (그림 1H)를 표시하여 각 coverslip에에서 무작위로 선택된 30 고독한 뉴런에서 측정 할 수있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁의 관심과 재정적 공시가 없습니다.

본 프로토콜은 최근 PCA와 CP 5에 신경 가소성의 메커니즘을 연구하기 위해 우리의 그룹에 의해 개발 된 생체 췌장 신경 가소성 분석 뒤에 방법론을 설명하기위한 것입니다. 프로토콜은 연기자가 DRG와 MP 신경 세포의 분리 및 문화에 충분한 경험을 쌓았되면 쉽게 적용 할 수있는 세 가지 일의 절차를 포함한다. 또한, 췌장 미세 환경의 구성 요소에 장내 및 DRG 관련 아교의 수반하는 반응을 연구하기위한 귀중한 도구를 나타냅니다. 우리의 의견으로는,이 분석의 가장 흥미로운 기능 중 하나는 체외에서 간단하게 설정에서 PCA와 CP (즉, 신경 발아 및 비대) 동안 발생하는 변경을 감지하고 시뮬레이션 할 수있는 기능입니다. 사실, w의 연결 형태의 변화에​​ 조직 추출물 또는 세포 상층 액 결과의 응용 프로그램HICH 체계적인 형태 계측 학적 분석에 의해 충분한 ...

위장 (GI) 신경의 형태와 밀도의 변화는 오랜 시간 동안 소화기 및 병리학의 관심을 끌었했지만, 위장관 질환의 병태 생리에 대한 자신의 관련성은 1-3 알려지지 않았다. 실제로, 위염, 역류성 식도염, 대장염, 게실염, 충수염과 같은 몇 가지 매우 일반적인 위장 장애는 염증 조직 분야 1 증가 신경 분포 밀도와 연관되어 있습니다. 그러나, 진짜 관심은 지금까지 위장관의 메커니즘과 신경 가소성의 의미에 지불되지 않았다. 형태 학적으로 변형 된 GI의 신경은 그 기능의 측면에서, 장용 신경계의 정상 상태, 즉 정상 GI 신경과 다를합니까? 플라스틱 장내 신경의 변경된 신경 펩타이드 / 신경 전달 물질의 내용의 의미는 무엇입니까? 말초 신경 가소성은 항상 중앙 신경 시스템에 변경된 신호를 수반 하는가? 어디 플라스틱 extri의 중심 돌기는NSIC GI의 신경 경로? GI의 신경 가소성의 기능적 측면에 대한 우리의 지식의 소수를 볼 때와 같은 핵심 질문의 긴 시리즈를 쉽게 생성 할 수 있습니다. 기능 수준에서 위장관 신경 가소성의 연구는, 유효한 재현 여전히 쉽게 적용 할 수있는 실험 모델을 필요로한다. 증가의 시대에 인기와 같은 생체 설정에서 유전자 조작 조건부 마우스 모델 (GECoMM)의 수용은 실제 패션 1 GI의 신경 가소성의 이전에 알려지지 않은 측면을 명료하게 할 수있는 잠재력을 부담. 그러나 GECoMM의 설계 및 제조는 비용이 많이 드는 노동 집약적 유지하고, 특히, 시간이 많이 소요. 또한, 그들은 조건부 유전자 조작 마우스 (장내 상피 세포에서 신경 성장 인자 / NGF의 예를 들면 유전자 과발현) 변조 할 대상의 사전 선택이 필요합니다. 따라서, DES에 대한성공적인 GECoMM의 IGN이 연구원은 가치있는 목표의 몇 가지 지표 (예를 들어, 이전의 실험 데이터)가 필요합니다 (여기 NGF) 그 분자가 적어도 GI 신경에 대한 몇 가지 생물학적으로 중요한 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다 즉. 이러한 지표들은 쉽게 생체 시스템의 복잡한 미세 환경으로부터 격리 세포 아형 선택적 이형 방식 4-7 공 배양 할 수있는 시험 관내 모델에서 적절한로부터 유도 될 수있다. 이러한 이형 문화 환경에서 분자 표적의 변조는 빠르고, 평균 기술적으로 덜 복잡하고, 따라서 생체 내 연구의 검증을 위해 가치있는 대상의 사전 필터링에 도움이 될 수 있습니다. 최근에, 우리는 intrapancreatic NE의 증가 된 신경 밀도와 비대를 시뮬레이션하기 위해 설계되었습니다 체외 신경 가소성의 분석을 제시인간의 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP) 조직에서 rves. 여기에, 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG) 또는 myenteric 신경총 (MP)에서 파생 된 신경 외과 적 절제 PCA 또는 CP 조직 표본에서 조직 추출물에 노출 정상적인 인간의 췌장 (NP) 조직 추출물 5 배양에 비해했다. 대신 조직 추출물 번 또한 신경 가소성의 선택된 세포 유형의 영향을 연구하기 위하여 세포주 상층 액을 사용할 수있다. 표준화 된 형태 계측 학적 측정과 함께 사용하면되게 신경 가소성의 분석은 다른 췌장 미세 환경에 대한 응답으로 신경 가소성의 유효하고 재현성 평가를 할 수 있습니다. 특히, 허용하는 신경 돌기의 가지, 패턴 및 신경 크기 분기, 2) 기능 신경 가소성, 말초 신경의 흥분에, 즉 변화의 변화 즉, 1) 형태 학적 신경 가소성의 시뮬레이션. 또한, 주변뿐만 아니라 (즉, </em&gt; 장용성)뿐만 아니라, 중심부 (예 DRG 또는 2 차 척추) 신경은 여러 GI 조직 내용에 그들의 형태 학적 및 기능적 반응을 평가하기 위해, 본 분석에 포함시킬 수있다. 본 비디오 튜토리얼에서, 우리는이 분석의 성능에 대한 기술적 인 프로토콜을 설명하고 그 장점과 단점에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 GI 기관의 신경 가소성의 연구에이 분석의 기본 개념의 적용에 관심을 그립니다.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Ornithine/laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533/L4544</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Coverslips</td><td>Merck</td><td></td><td>24-well plates에 사용</td></tr><tr><td>Dismembranator S</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-III-tubulin 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB1637</td><td>1:200 농도</td></tr><tr><td>Anti-GFAP-antibody</td><td>DAKO</td><td>M0761</td><td>1:400 농도</td></tr><tr><td>RIPA 완충액 + 프로테아제 억제제</td><td></td><td></td><td>모든 공급 업체</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>17504044</td><td>B-27의 품질은 로트 번호</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>에 따라 달라지는 것으로 알려져 있습니다.<td> 공급 업체</td></tr><tr><td>최소 필수 매체</td><td>Gibco / Life Sciences</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>24020133</td><td>Ca/Mg</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II형</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS-2</td><td>함유</td></tr> 시 콜라겐분해효소 활성을 개선함 <tr><td>트립신-EDTA 0.25%</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td></td><td></td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td>분석 다큐멘터리 소프트웨어</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :<em&gt; 체외</em&gt; 이중 신경 가소성 분석

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

신경 가소성은 병적 인 조건에서 장용 신경계와 위장관 (GI) 신경 분포의 고유 기능입니다. 그러나 GI 장애의 신경 가소성의 병태 생리 학적 역할은 알려지지 않았다. 시뮬레이션 및 GI의 신경 가소성의 조절을 허용 새로운 실험 모델은 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP)과 같은 특정 위장관 질환에서 신경 가소성의 기여의 강화 된 감사를 가능하게 할 수있다. 여기, 우리는 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG)와 myenteric 신경총 (MP) 신경 세포를 사용하여 생체 조건에서 췌장 신경 가소성의 시뮬레이션을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 이중 신경 세포의 접근 방식은 두 기관의 내장과 - 외인성 신경 가소성의 모니터링을 허용뿐만 아니라, 신경 세포와 신경 교세포의 형태 및 전기 생리학을 평가하는 유용한 도구를 나타냅니다뿐만 아니라. 또한, 자신의 IMPAC 공부를 위해 공급되는 미세 내용의 기능 조절을 할 수 있습니다신경 가소성에 t. 일단 설정되면, 본 신경 가소성 분석은 GI 기관의 신경 가소성의 연구에 적용 할 수 있다는 가능성을 맺는다.

형태 학적 신경 가소성 갓 태어난 쥐 (P2-12) 및 파종 밀도의 표시 연령 범위에서, MP 및 DRG 뉴런은 이미 48 시간 (그림 2A) 이후 밀도의 연결 네트워크를 구축 할 수 있습니다. PCA, CP에서 재배 뉴런 사이의 신경 돌기의 밀도, NP 추출물의 비교 NP 추출물에 비해 PCA 또는 CP 추출물의 DRG 뉴런의 큰 신경 돌기의 밀도 (그림 2A) 5를 보여준다. MP 뉴런이 더 쉽게 DRG 뉴런보다 주변 아교 세포에서 떼어 놓다 경향이 있기 때문에 우리는 특히, 개별 뉴런에 대한 측정을 위해 MP 신경을 선호합니다. 여기에, PCA 또는 CP 추출물에서 재배 MP 신경도 더 이상 신경 돌기를 구축하고 포함 된 NP-추출물 매체에서 성장 MP 뉴런보다 복잡한 분기 패턴 (그림 2B)를 전시 5. NP, CP, 그리고...

신경 가소성은 위장 (GI) 요로의 점점 인식하지만, 충분히 이해 기능입니다. 여기, 인간의 췌장 질환의 예에서, 우리는 형태 학적 및 기능적 수준에서 위장관의 신경 가소성 연구를위한 생체 외 신경 가소성의 분석을 제시한다.

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

다음 실험의 전반적인 목적은 서로 다른 췌장 미세환경에 따른 말초 신경세포의 반응성 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 정상 인간 췌장과 질환이 있는 췌장 조직으로부터 전체 조직 용해물을 생성합니다. 그 다음 단계로, 갓 태어난 쥐에서 DRG 세포를 분리한 후, 분리된 조직 용해물을 처리합니다.다음으로, 48시간 동안 배양한 후 세포를 고정하여 후속 이중 면역형광 염색을 진행합니다. 결과에서는 서로 다른 조직 추출물에서 배양된 뉴런의 신경돌기 밀도 분지 패턴과 글리아 세포 밀도의 차이가 나타납니다. 이 방법은 다양한 위장관 질환에서 신경가소성 변화의 분자 매개체 역할과 같은 신경 위장관계 분야의 연구를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 췌장 질환의 다양한 신경영양 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 암이나 위장관 전체의 염증 상태와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 저희는 Ong disease와 같은 소아 신경병성 질환 분야의 연구자들과 협력을 시작했을 때 처음으로 이 방법을 사용할 생각을 했으며, 이를 인간 췌장 조직의 균질화라는 저희의 목적에 적용하였습니다. 5 by 5 by 5 mm 크기의 췌장 조직 큐브를 -80 °C에서 액체 질소로 직접 옮깁니다.그런 다음 냉동 블록을 금속 분쇄용 볼이 들어갈 수 있는 균질화 튜브에 먼저 넣고, 조직 균질기로 옮겨 해동이 일어나지 않도록 즉시 균질화합니다. 고체 분말 형태의 균질물을 300 내지 500 µL의 얼음처럼 차가운 0.1 X PBS에 재현탁합니다. 용해 버퍼는 사용할 수 있는데, 이는 다음과 같은 영향을 줄 수 있기 때문입니다.뉴런을 용해한 후 균질액을 4°C에서 21,130 ×g로 최소 15분 동안 원심분리합니다. 조직 추출물이 포함된 맑은 상층액을 수집하고, 인간 췌장 세포주로부터 세포주 상층액을 수집합니다. 세포를 일반 성장 배지에서 최소 70~80%의 밀도로 배양합니다.세포가 준비되면, 세포 배양용 등급의 PBS로 세포를 최소 3회 세척하고 무혈청 배지에서 최대 48시간 동안 배양하십시오. 다음으로, Bradford 단백질 분석법을 통해 조직 균질액 또는 세포주 상층액의 단백질 농도를 측정하십시오. 그 후, 신경세포 배지 내 추출물 또는 상층액의 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 조직 추출물과 세포주 상층액을 분주하십시오.그리고 이를 -80 °C에서 보관합니다. 머리가 제거된 P2~P12 생후 쥐를 사용하여 피부를 절개하고 척추를 노출시킵니다. 그 다음 전방 척추궁 절제술을 수행하여 척수를 노출시킵니다.다음으로, 등쪽뿌리신경절(dorsal root ganglia 또는 DRGs)을 노출시켜 제거합니다. DRG를 Gentamycin과 metronidazole이 포함된 얼음처럼 차가운 MEM에 넣습니다. 꼬리쪽 DRG부터 시작하여 상부 경추 DRG까지 계속해서 DRG를 수집합니다.작업이 완료되면, 24웰 플레이트에 충분한 양인 52개의 DRG를 수집합니다. 다음으로, 미세 가위를 사용하여 DRG를 뿌리 및 신경으로부터 분리합니다. 그런 다음 남아 있는 모든 말초 및 중추 돌기를 잘라냅니다.DRG를 수집한 후, collagenase type two가 포함된 HBSS에 넣고 37 °C에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 직경이 점차 좁아지는 시린지를 사용하여 DRG를 트리투레이션(trituration)합니다.과도한 tri는 뉴런을 파괴할 수 있으나 글리아에는 파괴력이 덜하다는 점에 유의하십시오. DRG가 포함된 배지가 혼탁해지면, 현탁액을 93.9 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 배지를 제거하고 다시 현탁하십시오.배양 준비를 위해 세포를 neuro basal medium에 현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 뉴런과 글리아 세포의 총 수를 추산합니다. 그 다음, 13 millimeter 사전 코팅된 커버슬립에 세포를 분주합니다.24-웰 플레이트의 코팅은 실험 목적에 따라 다릅니다. 다음으로, 웰에 neuro basal medium을 채우고 세포가 웰에 부착될 수 있도록 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 조직 추출물이 첨가된 배지 또는 세포주 상층액이 첨가된 배지를 해동합니다.다음으로, DRG에서 파종 배지를 흡입하여 제거하고, 선택적으로 PBS를 사용하여 매우 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 조직 추출물이 보충된 배지 또는 세포주 상층액이 보충된 배지를 세포에 천천히 피펫팅하여 100 µg/mL 농도가 되도록 합니다. 이제 조직 추출물 또는 세포주 상층액이 보충된 배지에서 37 °C로 48시간 동안 세포를 배양합니다.배지를 흡입하여 제거하고, 면역 염색을 위해 4% paraform aldehyde로 고정합니다. 이중 면역 형광 염색의 경우, 형태 기하학적 분석을 위해 뉴런 특이적 마커와 글리아 특이적 마커를 사용합니다. CCD 카메라와 자동화 소프트웨어가 장착된 도립 광학 현미경을 사용하여 200 x 배율로 뉴라이트 밀도를 측정합니다.50 by 50 micron 그리드를 겹쳐 놓고 교차하는 섬유의 제곱당 섬유 밀도를 측정하여 신경세포 배양물의 신경돌기 밀도를 측정합니다. 각 커버슬립당 4~5개의 대표적인 사진 현미경 이미지에서 성장이 가장 조밀한 4개의 서로 다른 영역에 대해 이 분석을 반복합니다. 각 커버슬립에서 무작위로 선택한 30개의 단독 신경세포의 신경돌기와 주변부를 표시하여 신경세포당 평균 분지 수, 평균 분지 길이 및 perianal 크기의 신경돌기 성장치를 측정합니다. 여기에는 정상 췌장 조직 추출물로 배양된 DRG 신경세포가 나타나 있습니다.이와 대조적으로, 만성 췌장염 또는 췌장암 조직 추출물과 함께 배양된 DRG 뉴런은 더 높은 신경돌기 밀도를 나타냅니다. 여기 다양한 인간 췌장 조직 추출물과 함께 배양된 근층신경총 뉴런이 있습니다.만성 췌장염 또는 췌장암 추출물에서 배양된 장신경절 뉴런은 정상 췌장 추출물에서 배양된 뉴런보다 더 길게 성장하며 더 복잡한 분지 패턴을 보입니다. DRG 뉴런을 췌장암 세포의 상청액과 함께 배양했을 때, 조직 추출물에서 관찰된 것과 유사하게 신경 밀도의 증가가 관찰되었습니다. 그러나 이러한 증가는 뉴로테닌(neurotenin) 또는 신경성장인자(nerve growth factor)와 같은 특정 신경영양인자를 결핍시키거나 차단했을 때 가역적이었습니다.Ggl 세포는 또한 서로 다른 췌장 조직 추출물에 대해 다르게 반응하며, 만성 췌장염 또는 췌장암의 추출물은 DRG 유래 글리아 세포 배양에서 글리아 성장과 글리아 세포 수를 증가시켰습니다. 이러한 효과는 만성 췌장염 추출물보다 췌장암 추출물에서 더 두드러지게 나타났습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 개발 후 4~5시간 내에 완료될 수 있습니다.이 방법은 신경 위장관학 분야의 연구자들이 염증성 및 악성 위장관 질환을 포함한 다양한 위장관 질환에서 신경 가소성의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 췌장의 신경 가소성을 연구하기 위해 말초 신경세포를 분리하는 방법과, 해당 시스템 및 기타 신경 변화 및 다른 위장관 질환의 신경 가소성 분석법을 구현하는 방법에 대해 충분한 통찰을 얻게 될 것입니다.

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연구

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Medicine

의학

췌장과 같은 progenitors은 인슐린을 표현 식민지로 차별화할 수있는 3 차원 clonogenic 분석이 설명되어 있습니다. 이 방법은 메틸 셀룰로오스, Matrigel 및 성장 요인을 포함하는 반 고체의 미디어 활용,하는 하나의 progenitors는 분아 따위에 의해 중식과...

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을...

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

이 비디오는 건강하고 암이 있는 인간 췌장 조직 추출물에 노출된 등뿌리 신경절과 장신경총 뉴런의 형태학적 변화를 연구하기 위한 체외 신경 가소성 분석을 보여줍니다. 이 분석을 통해 신경돌기 성장, 분기 패턴 및 신경 세포 크기를 연구할 수 있습니다.

체외 췌장 신경 가소성 분석: 건강하고 암이 있는 인간 췌장 조직 추출물에 노출된 위장관 뉴런의 변화 연구

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

배우세요 췌장 신경 가소성 시뮬레이션 방법을 통해 DRG와 MP 신경 세포에서 형태학적 및 전기생리학적 변화를 분석하는 기술입니다. 이 방법은 췌장암과 만성 췌장염 연구에 활용됩니다.

췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :

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