췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :

다음 실험의 전반적인 목적은 서로 다른 췌장 미세환경에 따른 말초 신경세포의 반응성 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 정상 인간 췌장과 질환이 있는 췌장 조직으로부터 전체 조직 용해물을 생성합니다. 그 다음 단계로, 갓 태어난 쥐에서 DRG 세포를 분리한 후, 분리된 조직 용해물을 처리합니다.

다음으로, 48시간 동안 배양한 후 세포를 고정하여 후속 이중 면역형광 염색을 진행합니다. 결과에서는 서로 다른 조직 추출물에서 배양된 뉴런의 신경돌기 밀도 분지 패턴과 글리아 세포 밀도의 차이가 나타납니다. 이 방법은 다양한 위장관 질환에서 신경가소성 변화의 분자 매개체 역할과 같은 신경 위장관계 분야의 연구를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 췌장 질환의 다양한 신경영양 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 암이나 위장관 전체의 염증 상태와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 저희는 Ong disease와 같은 소아 신경병성 질환 분야의 연구자들과 협력을 시작했을 때 처음으로 이 방법을 사용할 생각을 했으며, 이를 인간 췌장 조직의 균질화라는 저희의 목적에 적용하였습니다. 5 by 5 by 5 mm 크기의 췌장 조직 큐브를 -80 °C에서 액체 질소로 직접 옮깁니다.

그런 다음 냉동 블록을 금속 분쇄용 볼이 들어갈 수 있는 균질화 튜브에 먼저 넣고, 조직 균질기로 옮겨 해동이 일어나지 않도록 즉시 균질화합니다. 고체 분말 형태의 균질물을 300 내지 500 µL의 얼음처럼 차가운 0.1 X PBS에 재현탁합니다. 용해 버퍼는 사용할 수 있는데, 이는 다음과 같은 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

뉴런을 용해한 후 균질액을 4°C에서 21,130 ×g로 최소 15분 동안 원심분리합니다. 조직 추출물이 포함된 맑은 상층액을 수집하고, 인간 췌장 세포주로부터 세포주 상층액을 수집합니다. 세포를 일반 성장 배지에서 최소 70~80%의 밀도로 배양합니다.

세포가 준비되면, 세포 배양용 등급의 PBS로 세포를 최소 3회 세척하고 무혈청 배지에서 최대 48시간 동안 배양하십시오. 다음으로, Bradford 단백질 분석법을 통해 조직 균질액 또는 세포주 상층액의 단백질 농도를 측정하십시오. 그 후, 신경세포 배지 내 추출물 또는 상층액의 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 조직 추출물과 세포주 상층액을 분주하십시오.

그리고 이를 -80 °C에서 보관합니다. 머리가 제거된 P2~P12 생후 쥐를 사용하여 피부를 절개하고 척추를 노출시킵니다. 그 다음 전방 척추궁 절제술을 수행하여 척수를 노출시킵니다.

다음으로, 등쪽뿌리신경절(dorsal root ganglia 또는 DRGs)을 노출시켜 제거합니다. DRG를 Gentamycin과 metronidazole이 포함된 얼음처럼 차가운 MEM에 넣습니다. 꼬리쪽 DRG부터 시작하여 상부 경추 DRG까지 계속해서 DRG를 수집합니다.

작업이 완료되면, 24웰 플레이트에 충분한 양인 52개의 DRG를 수집합니다. 다음으로, 미세 가위를 사용하여 DRG를 뿌리 및 신경으로부터 분리합니다. 그런 다음 남아 있는 모든 말초 및 중추 돌기를 잘라냅니다.

DRG를 수집한 후, collagenase type two가 포함된 HBSS에 넣고 37 °C에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 직경이 점차 좁아지는 시린지를 사용하여 DRG를 트리투레이션(trituration)합니다.

과도한 tri는 뉴런을 파괴할 수 있으나 글리아에는 파괴력이 덜하다는 점에 유의하십시오. DRG가 포함된 배지가 혼탁해지면, 현탁액을 93.9 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 배지를 제거하고 다시 현탁하십시오.

배양 준비를 위해 세포를 neuro basal medium에 현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 뉴런과 글리아 세포의 총 수를 추산합니다. 그 다음, 13 millimeter 사전 코팅된 커버슬립에 세포를 분주합니다.

24-웰 플레이트의 코팅은 실험 목적에 따라 다릅니다. 다음으로, 웰에 neuro basal medium을 채우고 세포가 웰에 부착될 수 있도록 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 조직 추출물이 첨가된 배지 또는 세포주 상층액이 첨가된 배지를 해동합니다.

다음으로, DRG에서 파종 배지를 흡입하여 제거하고, 선택적으로 PBS를 사용하여 매우 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 조직 추출물이 보충된 배지 또는 세포주 상층액이 보충된 배지를 세포에 천천히 피펫팅하여 100 µg/mL 농도가 되도록 합니다. 이제 조직 추출물 또는 세포주 상층액이 보충된 배지에서 37 °C로 48시간 동안 세포를 배양합니다.

배지를 흡입하여 제거하고, 면역 염색을 위해 4% paraform aldehyde로 고정합니다. 이중 면역 형광 염색의 경우, 형태 기하학적 분석을 위해 뉴런 특이적 마커와 글리아 특이적 마커를 사용합니다. CCD 카메라와 자동화 소프트웨어가 장착된 도립 광학 현미경을 사용하여 200 x 배율로 뉴라이트 밀도를 측정합니다.

50 by 50 micron 그리드를 겹쳐 놓고 교차하는 섬유의 제곱당 섬유 밀도를 측정하여 신경세포 배양물의 신경돌기 밀도를 측정합니다. 각 커버슬립당 4~5개의 대표적인 사진 현미경 이미지에서 성장이 가장 조밀한 4개의 서로 다른 영역에 대해 이 분석을 반복합니다. 각 커버슬립에서 무작위로 선택한 30개의 단독 신경세포의 신경돌기와 주변부를 표시하여 신경세포당 평균 분지 수, 평균 분지 길이 및 perianal 크기의 신경돌기 성장치를 측정합니다. 여기에는 정상 췌장 조직 추출물로 배양된 DRG 신경세포가 나타나 있습니다.

이와 대조적으로, 만성 췌장염 또는 췌장암 조직 추출물과 함께 배양된 DRG 뉴런은 더 높은 신경돌기 밀도를 나타냅니다. 여기 다양한 인간 췌장 조직 추출물과 함께 배양된 근층신경총 뉴런이 있습니다.

만성 췌장염 또는 췌장암 추출물에서 배양된 장신경절 뉴런은 정상 췌장 추출물에서 배양된 뉴런보다 더 길게 성장하며 더 복잡한 분지 패턴을 보입니다. DRG 뉴런을 췌장암 세포의 상청액과 함께 배양했을 때, 조직 추출물에서 관찰된 것과 유사하게 신경 밀도의 증가가 관찰되었습니다. 그러나 이러한 증가는 뉴로테닌(neurotenin) 또는 신경성장인자(nerve growth factor)와 같은 특정 신경영양인자를 결핍시키거나 차단했을 때 가역적이었습니다.

Ggl 세포는 또한 서로 다른 췌장 조직 추출물에 대해 다르게 반응하며, 만성 췌장염 또는 췌장암의 추출물은 DRG 유래 글리아 세포 배양에서 글리아 성장과 글리아 세포 수를 증가시켰습니다. 이러한 효과는 만성 췌장염 추출물보다 췌장암 추출물에서 더 두드러지게 나타났습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 개발 후 4~5시간 내에 완료될 수 있습니다.

이 방법은 신경 위장관학 분야의 연구자들이 염증성 및 악성 위장관 질환을 포함한 다양한 위장관 질환에서 신경 가소성의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 췌장의 신경 가소성을 연구하기 위해 말초 신경세포를 분리하는 방법과, 해당 시스템 및 기타 신경 변화 및 다른 위장관 질환의 신경 가소성 분석법을 구현하는 방법에 대해 충분한 통찰을 얻게 될 것입니다.