코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

이 절차의 전반적인 목표는 꿀벌에게 먹이에 대한 단순 반사 반응의 행동 조건화를 구현하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 꿀벌을 포획하여 하네스로 고정한 뒤, 소량의 설탕 용액을 먹이고 구속 상태에 적응하도록 함으로써 달성됩니다. 그 다음, 더듬이를 설탕으로 터치했을 때 충분한 동기 부여를 보이는 벌들을 조건화 대상으로 선택합니다.

조건화 과정 동안, 조건 반응을 유도하기 위해 냄새 제시를 자당 보상과 짝지어 제공합니다. 다음으로, 비강화 시행을 통해 반응의 유무, 반응 잠복기 및 반응 지속 시간을 측정합니다. 마지막 단계는 조건화 및 테스트 시행에 대한 데이터 분석과 그래픽 제시입니다.

이 기술은 꿀벌의 생물학 및 건강 연구에 성공적으로 적용되어 왔으며, 특히 학습 행동은 살충제와 같은 방해 처리에 매우 민감하므로 치사량 미만 수준에서 이러한 처리가 꿀벌의 행동에 미치는 영향을 평가하는 것이 가능합니다. 이 방법의 시각적 시연은 효과적인 조건 형성에 필요한 자극 타이밍과 효율성을 떨어뜨리는 일반적인 오류를 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 방법이 처음인 연구자는 프로토콜과 주변 환경 모두에 요구되는 세부 사항에 주의를 기울이는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

먼저, 일벌들이 외출 전 잠시 멈춰 있거나 먹이 활동 후 돌아올 때 벌집 입구에서 일벌들을 수집합니다. 바이알당 한 마리의 벌만 포획하십시오. 벌이 탈출하는 것을 방지하기 위해 뚜껑을 닫는 동안 바이알 입구를 수평으로 유지하거나 아래로 향하게 잡으십시오.

벌을 수집한 후 실험실로 돌아와 바이알을 한 번에 몇 개씩 얼음물 슬러리에 넣습니다. 벌이 움직이지 않게 되면, 과도한 노출을 피하기 위해 즉시 바이알을 얼음물에서 꺼내 벌을 고정 하네스에 배치합니다. 벌의 등쪽 흉부가 홀더의 절개된 부분을 향하게 하고 머리가 상단 바로 위에 오도록 하여 벌을 고정합니다.

벌을 살며시 눌러 구강 부위가 홀더 가장자리 바깥으로 나오게 합니다. 덕트 테이프 조각을 등 쪽의 머리와 가슴 사이에 밀어 넣고, 테이프의 자유로운 끝부분을 홀더 측면에 단단히 부착합니다. 하네스에 부착된 테이프가 매끄럽고 팽팽한지 확인하십시오.

벌 홀더의 앞부분과 테이프 사이에 눈에 띄는 틈이 없어야 합니다. 틈이 있으면 벌이 per bois를 제대로 뻗지 못하거나 탈출할 수 있습니다. 급여 전, 벌이 하네스 착용 상태에서 회복될 수 있도록 약 30분 정도 시간을 둡니다.

그 후 훈련 구역에서 충분히 떨어진 곳에서, 급여와 조건 형성 사이의 간격 동안 각 벌에게 0.5 molar sucrose를 약 3~4 µL 급여합니다. 벌들을 실험실의 조용한 구역에 있는 젖은 종이 타월이 깔린 플라스틱 용기에 넣습니다. 이 시간 동안, 조건 형성을 시작하기 몇 분 전에 0.5 molar sucrose 용액의 작은 방울로 더듬이를 접촉시켜 벌의 섭식 동기를 유도합니다.

이 테스트 동안에는 먹이를 주지 마십시오. 만약 벌들이 psis를 뻗어 반응한다면, 이는 학습을 위한 동기 부여가 충분히 된 상태이므로 프로토콜에 사용할 수 있습니다. 준비가 되면 유리 냄새 주입기를 모델링 클레이 홀더에 고정하고, 넓은 쪽 끝의 개구부가 벌들을 정면으로 향하도록 조정하며 10 E. 주입기의 끝부분이 벌로부터 10~20cm 거리에 있도록 해야 합니다. 카트리지를 공기 흐름 튜브 및 밸브 시스템에 연결하는 피팅을 주입기의 좁은 쪽 끝에 단단히 고정하십시오.

각 실험 시작 시, 하네스를 착용한 벌을 조건화 구역의 핀에 배치하고 더듬이가 냄새 카트리지를 정면으로 향하게 합니다. 벌이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 냄새 자극을 주기 전 15~25초 동안 구역 내에서 휴식하게 합니다. 시작 버튼을 눌러 냄새 전달을 위한 타이밍 메커니즘을 작동시킵니다.

자극 시작 후 무조건 자극을 제시하기 전까지 냄새에 대한 벌의 반응을 관찰하십시오. 각 시행 후에는 초기 기억 형성이 이루어질 수 있도록 벌이 조건 형성 구역에서 15~25초 동안 더 휴식을 취하게 하십시오. 시행 직후 벌을 너무 빨리 이동시키면 각 조건 형성 시행의 효과가 크게 감소합니다.

수크로스를 공급하려면, 냄새가 제시되는 동안 바늘 끝을 벌로부터 2~3cm 거리에 둡니다. 시린지의 흔들림은 벌의 주의를 분산시킬 수 있으므로, 훈련 아레나의 가장자리를 이용하여 시린지가 흔들리지 않게 고정하십시오. 냄새 자극이 제시되는 동안 급이 신호음이 울립니다.

급여 신호가 들리는 즉시 꿀벌이 확률관을 뻗을 때까지 더듬이를 가볍게 터치한 후, 꿀벌에게 먹이를 줍니다. 냄새 제시와 자당 제시 사이의 타이밍이 매우 중요합니다. 이상적으로는 이 두 가지 자극이 짧게 겹쳐야 합니다.

냄새 제시와 자당 제시 사이에 몇 초 이상의 시간이 경과하면 조건 형성의 수행 능력이 저하됩니다. 조건 형성 후에는 비강화 테스트 시행을 통해 벌이 조건화된 연관성을 얼마나 잘 기억하는지 평가하십시오. 먼저, 훈련 구역 상단 삼각대에 비디오 카메라를 설치하고, 촉각과 구기가 선명하게 초점이 맞도록 벌 머리의 전면에 카메라 초점을 맞춥니다.

냄새 자극 제시를 나타내는 작은 LED 표시등이 벌의 뒤쪽 영역에 위치하여 비디오에서는 보이지만 벌에게는 보이지 않는지 확인하십시오. 이를 통해 분석 과정에서 냄새의 시작 및 종료 시간을 식별할 수 있습니다. 가장 일관된 결과를 얻으려면 모든 설정이 완료된 후 테스트를 위해 갓 준비한 냄새 카트리지를 사용하십시오.

앞서 설명한 대로 냄새를 제시하여 테스트를 시작합니다. 냄새를 제시하기 20초 전부터 녹화를 시작하고, 제시 후 최소 20초 동안 녹화를 계속합니다. 테스트 후에는 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 자극 조건에 대한 각 벌의 반응을 점수화합니다.

이진 점수 체계를 사용하여 psis 확장 반응을 양성 또는 음성으로 점수화하십시오. B의 반응을 양성으로 점수화합니다. 벌려진 대악의 끝단을 연결한 선 너머로 B extensus psis가 확장될 때, 냄새 시작 후 냄새 종료 전 단계에서 B가 prob bois를 확장한 경우에만 양성 반응으로 점수화하십시오. 시험 중 prob Bois의 확장이 없거나, 냄새제거 후 prob Bois가 확장된 경우 B의 반응을 음성으로 점수화하십시오. 확장 잠복기, 확장 반응의 횟수 및 총 지속 시간과 같은 다른 파라미터도 수집할 수 있습니다.

이후의 조건 형성 시도에서 자극을 증가시켰습니다. 탄소 사슬 길이 또는 탄소-탄소 결합 위치가 자극과 다른 새로운 테스트 냄새에 대한 반응은 조건 자극과 새로운 테스트 냄새 사이의 차이 정도에 비례하여 감소했습니다. 이러한 데이터는 새로운 연구자들 사이의 가변성과 성공적인 조건 형성을 보여줍니다.

옥탈(octal)에 대한 반응은 테스트를 수행한 집단에 따라 다르게 나타났습니다. 테스트 시행 동안, 조건 자극으로 사용된 냄새가 가장 강한 반응을 유도했습니다. 옥탈이 조건 자극으로 사용되었을 때, 새로운 냄새인 메틸 사이클론(methyl cyclone)과 비교하여 테스트 중 반응이 더 강하게 나타났습니다.

마찬가지로, 메틸 사이클론을 조건 자극으로 사용했을 때 더 강한 반응이 나타났습니다. 역행 연합을 사용했을 때 조건 반응은 새로운 냄새의 수준에 가깝게 감소하였으며, 이는 성공적인 조건 형성을 위해 정밀한 타이밍이 중요하다는 것을 보여줍니다. 이 기술의 발전은 신경과학 분야의 연구자들이 꿀벌과 같은 곤충 모델 생물에서 학습과 기억의 신경학적 기초를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

곤충, 특히 꿀벌을 다루는 작업은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 동물들을 다룰 때는 반드시 적절한 보호 장구를 착용하십시오.