정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비

이 실험 절차의 전반적인 목표는 현미경 관찰을 위해 초파리 정소를 해부하고 준비하는 것입니다. 먼저 수컷 초파리의 복부에서 정소 쌍을 해부하여 분리합니다. 두 번째 단계로, 적절한 발달 단계에서 정소를 찢은 후 정소를 압착하여 내부의 세포들을 방출시킵니다.

다음으로, 압착된 고환을 고정시킨 후 1차 및 2차 항체에서 배양합니다. 마지막 단계는 이미징을 위해 조직을 슬라이드에 마운팅하는 것입니다. 최종적으로 위상차 현미경 또는 면역형광 현미경을 사용하여 정자 형성의 다양한 단계에 있는 세포의 결함과 형태를 관찰하고, 다양한 단백질의 세포 내 국소화를 관찰합니다.

이 방법은 정자 형성 과정 중 단백질의 결정적인 역할을 식별하는 것과 같이 발달 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 초보자의 경우 처음에는 초파리 복부 내에서 정소를 찾는 데 어려움을 겪을 수 있으므로, RAs 정소를 해부하는 과정을 시각적으로 보여주는 것이 매우 중요합니다. 또한, 조직을 압착하는 가장 효과적인 방법은 말로 설명하기보다 시연하는 것이 더 쉽습니다.

해부를 시작하려면 이산화탄소 기류를 사용하여 병이나 바이알 속에 있는 초파리를 마취하십시오. 그 다음, 마취된 초파리를 플라이 패드로 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 작은 붓을 사용하여 초파리를 분류하여 원하는 유전자형의 oph 수컷을 약 6~8마리 수집하십시오.

다음으로, 핀셋을 사용하여 각 파리의 날개를 제거합니다. 이는 파리가 액체에 떠오르는 것을 방지하기 위함입니다. 해부 과정 중에, 검은색 배경의 실리콘 코팅 해부 접시 위에 인산완충식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS 500 µL를 한 방울 떨어뜨립니다.

그런 다음 핀셋 끝을 날개가 제거된 파리 중 한 마리의 앞부분으로 향하게 합니다. 흉부를 잡고 PBS 방울 속에 담급니다. 복부 배면의 뒷부분에 위치한 짙은 갈색 구조물을 확인하고, 다른 핀셋을 사용하여 외부 생식기를 잡고 복부에서 분리될 때까지 뒤쪽으로 당깁니다.

대부분의 경우, 정소, 정낭 및 부속샘은 외부 생식기와 함께 복부에서 제거됩니다. 하지만 그렇지 않은 경우, 핀셋 한 쌍을 복부에 삽입하여 정소를 조심스럽게 끄집어냅니다. 두 쌍의 핀셋을 사용하여 정소를 부속샘 및 외부 생식기로부터 분리합니다.

야생형 정소는 노란색을 띠므로 인접한 흰색 조직과 구분하십시오. 라이브 이미징을 위한 시료 준비를 위해, 핀셋을 사용하여 정소 2~3쌍을 사각 유리 커버슬립 위의 4~5 µL PBS 방울 속에 조심스럽게 놓으십시오. 그다음, 찢으십시오.

준비 과정에서 원하는 생식세포 유형의 존재를 최대화할 수 있도록 적절한 높이의 위치에서 포셉을 사용하여 각 정소를 엽니다. 정소의 내용물이 찢어진 부위를 통해 슬라이드 위로 배출될 것입니다. 정원세포와 정모세포를 농축하기 위한 압착 단계 동안, 농축을 위해 정소의 정점 끝부분에 인접한 곳을 찢어 엽니다.

정모세포와 정세포를 얻으려면, 더 성숙한 생식세포를 많이 확보하기 위해 1단계보다 약간 기저부 쪽에서 정소(testes)를 찢어 엽니다. 곡률이 시작되는 지점에 더 가까운 곳에서 정소를 찢어 엽니다. 다음 단계는 커버슬립 위에 현미경 슬라이드를 조심스럽게 올려놓아 정소를 짓누르는 것입니다.

수동으로 압력을 가하지 말고 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 살아있는 세포를 관찰하려면 시료 준비 후 15분 이내에 사용하십시오. 위상차 현미경으로 관찰하며, 생식 세포가 명확하게 초점에 잡힐 때까지 세정용 와이프로 커버 슬립 아래의 과잉 액체를 조심스럽게 흡수하여 표본을 평평하게 만듭니다.

압착된 고환이 포함된 준비된 슬라이드를 금속 집게를 사용하여 액체 질소에 담가 기포가 더 이상 발생하지 않을 때까지 급속 냉동합니다. 면도날을 사용하여 커버슬립을 즉시 제거합니다. 그런 다음 금속 집게로 슬라이드를 옮겨 얼음처럼 차가운 95%ethanol이 채워진 사전 냉각된 유리 슬라이드 랙에 넣고 샘플을 -20 °C에서 10분 동안 보관합니다.

평형을 맞춘 슬라이드를 0.1% Triton X 100이 첨가된 4% formaldehyde-PBS 또는 PBST가 채워진 유리 슬라이드 랙으로 옮기고 실온에서 7분 동안 보관합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS가 채워진 랙으로 옮깁니다. 랙 안의 용액을 버리고 새로운 PBS 용액으로 교체하는 방식으로 실온에서 5분 동안 슬라이드를 PBS로 세척합니다.

세척 과정을 한 번 더 반복합니다. PBS를 제거하고 슬라이드를 실온의 PBST에 30분 동안 담가 세포막을 투과화합니다. 그 후, 실온에서 PBS로 슬라이드를 5분씩 세 번 세척합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 항체 용액이 퍼지지 않게 가두고 조직이 항상 촉촉하게 유지되도록, 소수성 배리어 펜을 사용하여 슬라이드 위의 압착 조직 주변에 원을 그립니다.

그런 다음 PBST로 희석한 1차 항체 30~40 µL를 원 안의 조직에 첨가합니다. 1차 항체 반응 후, 슬라이드를 습기가 있는 암실 챔버에서 실온으로 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실온의 PBS로 슬라이드를 5분씩 세 번 세척합니다.

그 후 PBS에 희석한 30~40 µL의 형광 표지 2차 항체를 조직에 첨가하고, 실온의 암소에서 1~2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 PBS로 실온에서 5분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 원형 영역 내의 조직에 30~40 µL의 DAP 용액을 첨가합니다.

조직 위에 유리 커버슬립을 조심스럽게 덮으며, 기포가 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 기포가 발생한 경우, 샘플이 손상되지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 움직여 기포가 가장자리로 빠져나가게 하십시오. 세척용 와이프로 슬라이드 가장자리의 과도한 액체를 닦아냅니다.

그 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하고, 3~4시간 이내에 형광 현미경으로 세포의 면역 염색 상태를 관찰합니다. 이 도식은 초파리 정소 내 다양한 세포 성숙 단계의 위치를 나타냅니다. 1단계에는 정자 형성 초기 단계의 어린 세포들이 포함되어 있으며, 3단계에는 더 성숙한 정자 세포들이 포함되어 있습니다.

레벨 2에는 감수 분열 중인 세포와 감수 분열 후의 생식세포가 혼합된 집단이 포함되어 있습니다. 이에 상응하는 위상차 이미지에서는 고환을 레벨 1에서 찢었을 때 정조세포와 초기 및 후기 제1정모세포가 방출되는 모습을 보여줍니다. 노란색 화살표는 불완전한 세포질 분열로 인해 서로 연결된 두 개 이상의 세포가 융합된 지점을 가리킵니다.

여기 제시된 압착 과정의 인위적 결과물(artifact)로, 정소의 레벨 2 지점이 찢어졌을 때 후기 1차 정모세포와 원형 정세포, 신장 정세포 및 성숙한 정자를 포함한 감수분열 후 세포들이 방출되는 모습을 보여주는 위상차 이미지가 나타납니다. 압착된 정소의 위상차 이미징은 또한 풍부한 원형 정세포의 결함을 쉽게 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 여기서는 하나의 위상 밝은 핵을 가진 야생형 정세포가 거의 동일한 크기의 위상 어두운 단일 미토콘드리아 응집체에 부착된 모습이 나타납니다.

이와 대조적으로, Aun 고환의 정세포는 세포질 분열 실패와 염색체 분리 오류로 인해 여러 개의 작은 핵과 하나의 큰 미토콘드리아 응집체를 포함하고 있습니다. 여기에 제시된 그레이스케일 이미지는 미세소관, DNA 및 중심체를 색상으로 식별하는 시약으로 염색한 압착 고환 표본에서 얻은 것입니다. 결합된 이미지들은 분열 중인 정모세포, 원형 정세포의 넓은 영역, 그리고 성숙한 정자의 다발을 보여줍니다. 위상차 현미경 관찰을 위한 시료 준비법을 숙달하면 20분에서 30분 내에 수행할 수 있습니다.

면역형광 현미경 관찰을 위한 시료 준비는 적절하게 수행될 경우 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 현미경 관찰을 위한 oph 고환 처리 외에도, 적출된 고환을 단백질의 생화학적 분석에 대안적으로 사용할 수 있습니다.