Name: 정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비 초파리 고환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 초파리 고환을 분리하고 고정하여 현미경 관찰을 위한 세포 샘플을 준비하는 방법을. Drosophila를 이용한 정자 발생 단계 분석 및 단백질 국소화 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 이명박 실험실에서 카렌 헤일 즈에서 전문가의 조언과 정자를 연구하는이 허용 방법을 설정하기위한 마이클 앤더슨에게 감사의 말씀을 전합니다. H.오다와 Y 아키야마 -오다 아낌없이 γ-튜 불린-GFP 재고 비행 제공. 이 작품은 LAL (GM074044)에 NIH R01 교부금에 의해 지원되었다.

1. 고환의 해부 <ol><li> CO 2의 스트림을 사용하여 병 또는 유리 병에 파리를 마취 및 비행 패드에 전송합니다. </li><li> 정렬 작은 붓을 사용하여 해부 현미경으로 파리, 원하는 유전자형의 초파리 수컷의 (실험)에 따라 해당 번호를 수집합니다. (2-5 일) 이전 약간 나이가 남성은 세포 검사에 이상적입니다 반면 (0-2일 세) 젊은 남성은 정자의 초기 단계 (예를 들어 정조 세포, 정모 세포, 초기 포스트 감수 정자)를 통해 세포를 검사에 이상적입니다 정자의 마지막 단계에서 (특히, 정자를 성숙). </li><li> (해부하는 동안 액체에 떠에서 파리를 방지하기 위해) 각 비행에서 날개를 제거하는 집게를 사용합니다. </li><li> 에 실리콘 코팅 해부 접시에 드롭, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS 130 mM의 NaCl을, 7 개 mm 나 2 HPO 4, 3 밀리미터의 NaH 2 PO 4)의 ~ 500 ML을 추가합니다검은 배경. 다른 수용액을 성공적으로 고환 절제술 3에 사용되었다. </li><li> 포인트는 파리의 전방을 향해 핀셋, 가슴으로 이해하고, PBS의 드롭에 젖어. 해부 현미경을 통해 볼 수 있지만, 복부에서 분리 될 때까지 후방 외부 생식기 (복부 복부의 뒤쪽 끝 부분에 진한 갈색 구조)를 잡아 당겨 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 대부분의 경우, 고환, 정낭, 및 부속 선은 외부 성기와 복부에 따라 제거 할 것,하지 않을 경우, 복부에 포셉 한 쌍을 삽입하고 고환을 애타게. </li><li> PBS의 드롭 집게 이쌍 (그림 2)를 사용하여 부속 선 및 외부 생식기에서 별도의 고환. 야생 형 고환은 쉽게 노란색으로 이웃 흰색 조직과 구별된다. 2 단계로 바로 진행합니다. </li><li> pharate의 남성 (전에서 고환을 분리하려면.. 전자 번데기 케이스 내에 포함), 추가 단계는 먼저 번데기 케이스에서 비행을 제거 포함하는 수행해야합니다,이 단계는 이전에 다른 31에 설명되어 있습니다. 단계 1.2에서 시작하는 성인의 고환을 위해 같은 해부를 진행합니다. </li><li> 애벌레 남성에서 고환을 분리, 초파리 애벌레 난소 32을 분리하는 프로토콜의 변형을 수행합니다. 간략하게, 수컷 유충 지방 본체의 후방 제에 포함 된 대형, 분명, 타원형 구조 (유생 정소) 쌍의 존재에 의해 암컷 유충으로부터 구별 될 수있다. 유생 고환을 분리 부분적 유생 난소의 분리 기술 한 바와 같이 복부에서 고환 및 주변 체지방을 분리 수컷 유충을 열 채찍. 본원에 기술 된 프로토콜의 2 단계로 바로 진행; 정소하기 직전 난소 (32)에서 기술 한 바와 같이 (2.3 또는 3.14 단)에 장착 지방 본체로부터 제거 될 수있다. </li></ol><ol><li> 부드럽게 사각 유리 커버 슬립에 PBS의 4-5 ML의 드롭 고환 2 ~ 3 쌍을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 너무 작은 액체 때 숙청 세포는 파열의 원인이됩니다 반면, 너무 많은 액체를 숙청 할 때 제대로 확산 세포를 방지 할 수 있습니다 : PBS의 볼륨에 고환의 수의 비율을 조정해야 할 수도 있습니다. 선택 사항 : 사용 실리콘 처리 된 커버 단계 3.2 슬립을 충당하기 위해 조직의 부착을 최소화하기 위해 전표. </li><li> (참고 준비에 필요한 생식 세포 유형의 존재를 극대화 할 수 있도록 적절한 위치에 열려있는 각각의 고환을 찢어 포셉 한 켤레를 사용하는 부수 동안 슬라이드에 고환 찢어진 지역에서 의지 주로 출구의 내용 단계를 포함한다.) 정조 세포와 정모 세포에 풍부하게, 그 정점 팁 (레벨 1, 그림 2B)에 인접한 고환을 열고 눈물. 정모 세포와 정자 세포에 풍부하게, 눈물은 pos의 고환을 열레벨 1 (레벨 2, 그림 2B)에 약간 기초 ition. , 더 성숙한 생식 세포에 풍부 가까이 곡률 (레벨 3, 그림 2B)를 시작하는 위치에 개방 고환을 찢어. </li><li> 부드럽게 고환 스쿼시 커버 슬립 위에 유리 현미경 슬라이드를 배치, 혼자 커버 슬립의 무게가 제대로 숙청 샘플을 얻기에 충분하다로 수동으로 압력을 적용하지 않는다. 공기 방울이 않도록하십시오. 선택 사항 : 사용 폴리-L-라이신 코팅 현미경 단계 3.2에서 슬라이드에 조직의 준수를 촉진하기 위해 슬라이드. </li><li> 위상차 현미경으로 살아있는 세포를 관찰하기 (이상적으로 준비 15 분 이내) 즉시 준비를 사용하여, 고환에서 찬란 태그 단백질의 발현과 유전자 변형 파리에, 살아있는 세포는이 단계에서 형광 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 고정 및 항체 염색 (프로토콜 3)를 진행합니다. </li><li> 부드럽게 청소 W를 사용하여 커버 슬립 아래에서 초과 액체를 심지생식 세포에 초점이 명확하게 될 때까지 IPE는 자료의 평탄화를 허용합니다. </li></ol> 3. 포름 알데히드 고정 및 항체 염색법 <ol><li> 스냅 (액체 질소 버블 링을 멈출 때까지) 액체 질소에 짧게 젖어 금속 집게의 쌍을 사용 (프로토콜 2) 숙청 고환이있는 각 슬라이드를 동결. </li><li> 면도날을 사용하여 즉시 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올로 가득 prechilled 유리 슬라이드 랙 (분광 등급, 메탄올 - 무료)에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 10 분 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 4 % PBS에 포름 알데히드 플러스 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T)로 채워진 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 7 분 동안 실온에서 보관하십시오. </li><li> PBS로 가득 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 1X를 반복합니다. (유리 슬라이드 랙에 솔루션을 삭제하여 모든 세척을 수행 <em&gt; 예. 그것을 밖으로 쏟아져)와 신선한 솔루션으로 대체하여. </li><li> PBS를 폐기하고 세포막을 투과하는, 실온에서 30 분 동안 PBS-T에서 슬라이드 젖어. </li><li> 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다. </li><li> 단계 (옵션) 차단 : 실온에서 45 분 동안 PBS에서 슬라이드 플러스 1 % BSA를 담근다. </li><li> (단계 3.9 및 3.11에 추가) 항체 솔루션을 제한하기 위해 (눈으로 쉽게 볼) 숙청 조직 주변의 슬라이드에 원을 그리려면 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 조직을 항상 습한 유지되어야한다. </li><li> 원 내에서 조직에 (항체에 따라 1:50 PBS-T, 1:400으로 희석) 일차 항체의 30 ~ 40 ML을 추가합니다. 블로킹이 수행 된 경우, PBS-T 플러스 1 % BSA에 일차 항체를 희석. (그림 4의 중심체의 염색에 대한) 안티-γ-tubulin에 항체는 1:100 희석시켰다. 습기, 어두운 챔버 (예. 폐 플라스틱 상자에 품다젖은 종이 실온에서 2 시간 동안 수건) 또는 4 박 ° C에서와 </li><li> 실내 온도 3 배에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 차단을 수행 한 경우, PBS-T에 두 번 세척 한 번 PBS에서 (실내 온도 각에서 5 분). </li><li> 조직에 형광 - 복합 이차 항체 (PBS에서 1:400 희석)의 30 ~ 40 mL를 넣고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 어둠 속에서 부화. </li><li> 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다. </li><li> 30 ~ 40 원 내에서 조직에 DAPI 용액 (PBS 0.2 ㎎ / ㎖)의 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 공기 방울이 않도록주의하면서, 조직 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 발생한 경우, 거품이 커버 슬립의 측면에서 탈출 할 때까지 스쿼시를 파괴하지 않고 커버 슬립 주위를 조심스럽게 이동합니다. </li><li> 청소를 사용하여 슬라이드의 가장자리에서 초과 DAPI를 지워 버리 닦아냅니다. </li><li> 명확한 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 봉인. </li><li> 이 혼합물을 사용하여형광 현미경으로 세포 면역 염색을 볼 수있는 다음 3 ~ 4 시간 이내. (적어도 몇 주까지) 슬라이드의 장기 저장을 위해, -20 ˚ C에서 글리세롤 기반 하드 마운트 DAPI와 매체 및 저장 슬라이드를 사용 </li><li> 또한, (항원)에 따라 메탄올 대신 포름 알데히드에 샘플을 고정합니다. 단계 3.2을 통해 전체 프로토콜을 완료 한 후, -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 숙청 고환의 슬라이드를 담가 이후 단계 5를 진행합니다. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

야생형 파리의 고환은 쉽게 인해 노란색 (대조적으로 이웃 흰색 조직)을 식별 할 수 있지만, 흰색 돌연변이 체의 고환은 흰색이며, 따라서 가끔 용기와 혼동 할 수 있습니다. P 요소에있는 미니 흰색 유전자가 고환에있는 색소의 축적을 촉진하지 않기 때문에 흰색 배경에 전형적으로 대부분의 형질 전환 균주는 또한 흰색 고환이 있습니다. 초파리의 고환은 색깔로 구분 할 수없는 경우, 다른 쉽게 인식 기능은 쌍 (12)에서의 나선형 패턴과 발생 (가) 있습니다. 일부 근로자가 쉽게 고환 (12)을 분리하는 절개 바늘 대신 집게를 사용하여 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 숙청 고환의 준비입니다. 한 가지 유용한 방법은 몇 밀리되도록 고환을 함유 커버 슬립 위에 슬라이드를 올려하는 표면 TE커버 슬립에 PBS의 nsion 슬라이드 향해 조직을 함유하는 커...

초파리의 고환은 줄기 세포의 조절, 세포의 감수 분열, 그리고 정자 개발 13-18 등 많은 생물 학적 과정의 연구를위한 이상적인 모델 시스템이다. 정모 세포와 그들의 감수 스핀들 대형 및 세포 학적 분석에 따라서 편리하고 편안한 정자 동안에 세포주기 체크 포인트는 세포주기 유전자 변이의 연구를 용이하게한다. 상이한 세포 유형은 고환의 길이를 따라 정렬 된 진행성에서 관찰 될 수 있고, 정자 형성에 어떠한 중단이 전반적인 배열의 변화로 이어질 수있다. 초파리의 유전 도구와 결합 된 이러한 기능은 정자 21-23의 돌연변이 분석을 용이하게했다. 초파리의 정자의 단계가 잘 정의되어 있습니다. 낭종 내에 동기 개발 생식선 세포는 고환의 길이를 따라 정자의 단계를 통해 순차적으로 진행. 보 중유사 분열과 남성 생식 세포의 감수 분열 번째, 세포질 분열은 딸 세포 (그림 1) 링 운하로 알려진 세포질 다리로 연결되어있는 것을 불완전 같은 발생합니다. 고환의 꼭대기 끝은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생성하는 불완전한 세포질 분열 네 개의 유사 분열 분열을 거쳐 정원 세포에 상승을 제공 생식 줄기 세포의 인구가 포함되어 있습니다. premeiotic S 단계 후, 차 정모 세포는 G2 ~ 90 시간하는 세포 부피가 증가 ~ 25 배 동안의 장기 성장 기간을 입력합니다. 감수 분열의 I 각각 차 정모 세포와 반수체 정자의 64 세포 낭종, 32 셀 낭종의 형성 세포의 감수 분열 II 결과를 통해 진행 상황. 미숙 한, 둥근 정자 성숙 정자를 형성하기 위해 광범위한 세포 리모델링을 받고있다. 사후 감수 세포는 연신의 번들 및 성숙 정자 특히, 고환의 볼륨을 중시 점유한다. 티여성 파리에 기능 정자의 그는 성공적으로 전송 여러 쌍 구조 (고환, 정낭 및 액세서리 땀샘)과 하나의 사정관으로 구성되어 남성의 생식 시스템 (그림 2)의 다른 부분 간의 조정이 필요합니다. 정자는 고환에서 생산 교미 24까지 정낭에 저장됩니다. 액세서리 샘은 정액을 생산하는 분비 세포가 포함되어 있습니다. 정낭에서 이주 정자가 정낭 및 액세서리 분비 모두 연결된 사정관, 내 정액과 혼합된다. 정자와 정액의이 혼합물은 궁극적으로 여성의 남성의 복부 (25)의 후방 단부에 위치 사정 전구를 통해 비행의 질에 남성의 펌핑된다. 정액 내 단백질은 담당자에 spermathecae로 알려진 전문 기관 내에서 정자의 장기간 보관에 필수적인초파리 암컷 26 roductive 기관. 초파리 고환의 분리 및 정자의 여러 단계에서 세포의 시각화를위한 훌륭한 방법은 과학 문헌 3-12에서 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 첨부 된 비디오 데모와 함께 이러한 프로토콜의 예를 제시하여 지식이 몸에 추가합니다. 위상차 현미경 라이브 고환 샘플의 준비를위한 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 (27)에 기초한다. 포름 알데히드 고정 및 고환의 면역 염색을위한 프로토콜은 이전에 설명한 방법 28을 기반으로합니다. 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 초파리 정자 동안, 마이너스 엔드 - 지향의 미세 소관 모터 dynein의 역할을 평가하기 위해) 초파리 정자의 많은 연구에 사용되었다. 기본 프로토콜 이외에, 제안은 varyin 제공된다G 해부 정조 세포, 정모 세포, 또는 성숙한 정자 풍부하게하기 위해. 이러한 낭종이 고환을 처리하기위한 다른 방법은 그대로 유지 또는 설명되어 필요에 따라 중단됩니다 하나. 모델 시스템으로 초파리 고환 사용에 장점은 초파리 난자 및 배아에 비해 항체 및 염료 쉽게 고환에서 그들의 분산 다음 세포에 침투 할 수 있으며, 적은 세척 단계가 요구되는 점이다, 따라서, 프로토콜은 상대적으로 수행 될 수있다 짧은 시간.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Kimax 페트리 접시 PAP 펜에서 실리콘 코팅 해부 접시를 만들기 위한 2액형 실리콘 엘라스토머</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>투명 손톱 보호대</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-감마-튜불린 항체 (클론 GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat 안티-마우스 IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>시그마코트</td><td>시그마-알드리치</td><td>SL2</td><td>제조업체의 지시에 따라 커버 슬립을 실리콘화하십시오.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg/ml in 75% ethanol; -20 &deg; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>연구 제품 국제 공사</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>유리 코플린 염색 항아리, 나사 캡</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>단일 젖빛 현미경 슬라이드</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>폴리 L- 라이신 코팅 현미경 슬라이드</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>옵션(처리되지 않은 현미경 슬라이드 교체용)</td></tr> <tr><td>사각형 커버 유리</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>집게</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>패턴 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS 스테레오스코프</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X 대물</td><td>렌즈 Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X 대물</td>렌즈 <td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

초파리 melanogaster의 널리 생물학적 과정의 다양성을 설명하기 위해 사용 된 강력한 모델 시스템이다. 예를 들어, 여성과 초파리의 수컷 생식 라인 모두의 연구는 현재의 감수 분열에 대한 이해뿐만 아니라 줄기 세포 생물학에 크게 기여했다. 우수한 프로토콜은 초파리의 난소와 고환 3-12의 분리 및 이미징에 대한 문헌에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 현미경 분석에 대한 해부와 초파리 고환의 제조 방법은 첨부 된 비디오 데모와 ​​함께 설명되어 있습니다. 성인 남성의 복부에서 고환을 분리하고 위상차 현미경에 의한 분석뿐만 아니라 형광 현미경에 의한 분석을 위해 고환을 고정하고 면역 염색을위한 프로토콜에 대한 살아있는 조직 슬라이드를 제조하는 프로토콜이 제공됩니다. 이러한 기술 개발을 나타내는 초파리 돌연변이의 특성에 적용 할 수있다정자뿐만 아니라 단백질의 세포 내 현지화의 시각화 EFECTS.

초파리의 남성 생식 기관의 제대로 해부 쌍의 예를 그림 2A에 표시됩니다. 성인 남성 파리의 복부에서 제거 고환은 일반적으로 정낭의 쌍 (파란색, 그림 2A &#39;)를 통해 절규하는듯한 덕트 (브라운, 그림 2A&#39;) 및 액세서리 땀샘의 한 쌍 (녹색, 그림 2A &#39;)에 연결되어 . 첨부 된 체세포 조직, 절규하는듯한 덕트 및 부속 샘의 대부분에서 고환을 분리하려면 분리 및 고환 쌍과 정낭 만이 ( &#39;도 2b 및 2B)을 유지하도록 폐기해야합니다. 정낭 또한 더욱 처리 될 만 고환 쌍을 남겨 제거 될 수있다. 고환 절제술 선택 성인 남성의 나이는 중요한 고려 사항이다. (0~2일 우화 후) 젊은 남성에서, 정낭 작은거의 빈, 고환 (그림 2에서...

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 현미경 관찰을 위해 초파리 정소를 해부하고 준비하는 것입니다. 먼저 수컷 초파리의 복부에서 정소 쌍을 해부하여 분리합니다. 두 번째 단계로, 적절한 발달 단계에서 정소를 찢은 후 정소를 압착하여 내부의 세포들을 방출시킵니다.다음으로, 압착된 고환을 고정시킨 후 1차 및 2차 항체에서 배양합니다. 마지막 단계는 이미징을 위해 조직을 슬라이드에 마운팅하는 것입니다. 최종적으로 위상차 현미경 또는 면역형광 현미경을 사용하여 정자 형성의 다양한 단계에 있는 세포의 결함과 형태를 관찰하고, 다양한 단백질의 세포 내 국소화를 관찰합니다.이 방법은 정자 형성 과정 중 단백질의 결정적인 역할을 식별하는 것과 같이 발달 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 초보자의 경우 처음에는 초파리 복부 내에서 정소를 찾는 데 어려움을 겪을 수 있으므로, RAs 정소를 해부하는 과정을 시각적으로 보여주는 것이 매우 중요합니다. 또한, 조직을 압착하는 가장 효과적인 방법은 말로 설명하기보다 시연하는 것이 더 쉽습니다.해부를 시작하려면 이산화탄소 기류를 사용하여 병이나 바이알 속에 있는 초파리를 마취하십시오. 그 다음, 마취된 초파리를 플라이 패드로 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 작은 붓을 사용하여 초파리를 분류하여 원하는 유전자형의 oph 수컷을 약 6~8마리 수집하십시오.다음으로, 핀셋을 사용하여 각 파리의 날개를 제거합니다. 이는 파리가 액체에 떠오르는 것을 방지하기 위함입니다. 해부 과정 중에, 검은색 배경의 실리콘 코팅 해부 접시 위에 인산완충식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS 500 µL를 한 방울 떨어뜨립니다.그런 다음 핀셋 끝을 날개가 제거된 파리 중 한 마리의 앞부분으로 향하게 합니다. 흉부를 잡고 PBS 방울 속에 담급니다. 복부 배면의 뒷부분에 위치한 짙은 갈색 구조물을 확인하고, 다른 핀셋을 사용하여 외부 생식기를 잡고 복부에서 분리될 때까지 뒤쪽으로 당깁니다.대부분의 경우, 정소, 정낭 및 부속샘은 외부 생식기와 함께 복부에서 제거됩니다. 하지만 그렇지 않은 경우, 핀셋 한 쌍을 복부에 삽입하여 정소를 조심스럽게 끄집어냅니다. 두 쌍의 핀셋을 사용하여 정소를 부속샘 및 외부 생식기로부터 분리합니다.야생형 정소는 노란색을 띠므로 인접한 흰색 조직과 구분하십시오. 라이브 이미징을 위한 시료 준비를 위해, 핀셋을 사용하여 정소 2~3쌍을 사각 유리 커버슬립 위의 4~5 µL PBS 방울 속에 조심스럽게 놓으십시오. 그다음, 찢으십시오.준비 과정에서 원하는 생식세포 유형의 존재를 최대화할 수 있도록 적절한 높이의 위치에서 포셉을 사용하여 각 정소를 엽니다. 정소의 내용물이 찢어진 부위를 통해 슬라이드 위로 배출될 것입니다. 정원세포와 정모세포를 농축하기 위한 압착 단계 동안, 농축을 위해 정소의 정점 끝부분에 인접한 곳을 찢어 엽니다.정모세포와 정세포를 얻으려면, 더 성숙한 생식세포를 많이 확보하기 위해 1단계보다 약간 기저부 쪽에서 정소(testes)를 찢어 엽니다. 곡률이 시작되는 지점에 더 가까운 곳에서 정소를 찢어 엽니다. 다음 단계는 커버슬립 위에 현미경 슬라이드를 조심스럽게 올려놓아 정소를 짓누르는 것입니다.수동으로 압력을 가하지 말고 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 살아있는 세포를 관찰하려면 시료 준비 후 15분 이내에 사용하십시오. 위상차 현미경으로 관찰하며, 생식 세포가 명확하게 초점에 잡힐 때까지 세정용 와이프로 커버 슬립 아래의 과잉 액체를 조심스럽게 흡수하여 표본을 평평하게 만듭니다.압착된 고환이 포함된 준비된 슬라이드를 금속 집게를 사용하여 액체 질소에 담가 기포가 더 이상 발생하지 않을 때까지 급속 냉동합니다. 면도날을 사용하여 커버슬립을 즉시 제거합니다. 그런 다음 금속 집게로 슬라이드를 옮겨 얼음처럼 차가운 95%ethanol이 채워진 사전 냉각된 유리 슬라이드 랙에 넣고 샘플을 -20 °C에서 10분 동안 보관합니다.평형을 맞춘 슬라이드를 0.1% Triton X 100이 첨가된 4% formaldehyde-PBS 또는 PBST가 채워진 유리 슬라이드 랙으로 옮기고 실온에서 7분 동안 보관합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS가 채워진 랙으로 옮깁니다. 랙 안의 용액을 버리고 새로운 PBS 용액으로 교체하는 방식으로 실온에서 5분 동안 슬라이드를 PBS로 세척합니다.세척 과정을 한 번 더 반복합니다. PBS를 제거하고 슬라이드를 실온의 PBST에 30분 동안 담가 세포막을 투과화합니다. 그 후, 실온에서 PBS로 슬라이드를 5분씩 세 번 세척합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 항체 용액이 퍼지지 않게 가두고 조직이 항상 촉촉하게 유지되도록, 소수성 배리어 펜을 사용하여 슬라이드 위의 압착 조직 주변에 원을 그립니다.그런 다음 PBST로 희석한 1차 항체 30~40 µL를 원 안의 조직에 첨가합니다. 1차 항체 반응 후, 슬라이드를 습기가 있는 암실 챔버에서 실온으로 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실온의 PBS로 슬라이드를 5분씩 세 번 세척합니다.그 후 PBS에 희석한 30~40 µL의 형광 표지 2차 항체를 조직에 첨가하고, 실온의 암소에서 1~2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 PBS로 실온에서 5분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 원형 영역 내의 조직에 30~40 µL의 DAP 용액을 첨가합니다.조직 위에 유리 커버슬립을 조심스럽게 덮으며, 기포가 생기지 않도록 각별히 주의하십시오. 기포가 발생한 경우, 샘플이 손상되지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 움직여 기포가 가장자리로 빠져나가게 하십시오. 세척용 와이프로 슬라이드 가장자리의 과도한 액체를 닦아냅니다.그 다음 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하고, 3~4시간 이내에 형광 현미경으로 세포의 면역 염색 상태를 관찰합니다. 이 도식은 초파리 정소 내 다양한 세포 성숙 단계의 위치를 나타냅니다. 1단계에는 정자 형성 초기 단계의 어린 세포들이 포함되어 있으며, 3단계에는 더 성숙한 정자 세포들이 포함되어 있습니다.레벨 2에는 감수 분열 중인 세포와 감수 분열 후의 생식세포가 혼합된 집단이 포함되어 있습니다. 이에 상응하는 위상차 이미지에서는 고환을 레벨 1에서 찢었을 때 정조세포와 초기 및 후기 제1정모세포가 방출되는 모습을 보여줍니다. 노란색 화살표는 불완전한 세포질 분열로 인해 서로 연결된 두 개 이상의 세포가 융합된 지점을 가리킵니다.여기 제시된 압착 과정의 인위적 결과물(artifact)로, 정소의 레벨 2 지점이 찢어졌을 때 후기 1차 정모세포와 원형 정세포, 신장 정세포 및 성숙한 정자를 포함한 감수분열 후 세포들이 방출되는 모습을 보여주는 위상차 이미지가 나타납니다. 압착된 정소의 위상차 이미징은 또한 풍부한 원형 정세포의 결함을 쉽게 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 여기서는 하나의 위상 밝은 핵을 가진 야생형 정세포가 거의 동일한 크기의 위상 어두운 단일 미토콘드리아 응집체에 부착된 모습이 나타납니다.이와 대조적으로, Aun 고환의 정세포는 세포질 분열 실패와 염색체 분리 오류로 인해 여러 개의 작은 핵과 하나의 큰 미토콘드리아 응집체를 포함하고 있습니다. 여기에 제시된 그레이스케일 이미지는 미세소관, DNA 및 중심체를 색상으로 식별하는 시약으로 염색한 압착 고환 표본에서 얻은 것입니다. 결합된 이미지들은 분열 중인 정모세포, 원형 정세포의 넓은 영역, 그리고 성숙한 정자의 다발을 보여줍니다. 위상차 현미경 관찰을 위한 시료 준비법을 숙달하면 20분에서 30분 내에 수행할 수 있습니다.면역형광 현미경 관찰을 위한 시료 준비는 적절하게 수행될 경우 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 현미경 관찰을 위한 oph 고환 처리 외에도, 적출된 고환을 단백질의 생화학적 분석에 대안적으로 사용할 수 있습니다.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초파리의 정자 중 centrosomal 단백질의 영상은 중심체 생물학에 중요한 새로운 단백질을 식별 할뿐만 아니라이 과정에서 알려진 선수의 특정 기능을 명료하게하는 강력한 방법입니다.

비행 고환에있는 영상 중심체

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster 번데기에서 온전한 고환과 생식 세포 낭종의 해부 및 배양을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 생체 외 정자 형성을 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 또한, 번데기 고환에서 생식 세포 발달의 특정 단계에 대한 억제제의 효과에 대한 약리학적 분석을 설명합니다.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

우리는 성숙한 초파리 난모세포의 수집, 준비 및 이미징을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 방법을 사용하면 염색체 거동과 방추체 조립 및 감수분열 중 기능을 시각화할 수 있습니다.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

배우세요 초파리 고환을 분리하고 고정하여 현미경 관찰을 위한 세포 샘플을 준비하는 방법을. Drosophila를 이용한 정자 발생 단계 분석 및 단백질 국소화 연구에 활용할 수 있습니다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비

더 많은 동영상 탐색