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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리

Full Text

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09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

초파리 유충의 먹이 회로는 공급 속도의 변화가 stomatogastric 신경 회로의 변화와 상관 관계가 될 수있는 간단하면서도 강력한 모델을 제공합니다. 이 회로는 입 후크 돌기뿐만 아니라 foregut 보내 중앙 세로토닌 성 신경 세포로 구성된다.

Transcript

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 모델 시스템을 활용하여 행동 출력과 신경 구조의 변화를 연관시키는 것입니다. 이것은 먼저 유충을 수집하기 위해 성인 초파리의 개체군 케이지를 설정하여 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 후반, 2번째에서 3번째 초기의 instar 유충의 운동 능력을 평가하는 것입니다.

세 번째 단계는 입 갈고리의 확장과 수축을 관찰하여 유충의 섭식 행동을 평가하는 것입니다. 마지막 단계는 면역조직화학 기술을 사용하여 후기 제3 instar 유충에서 입증된 심실 샘플을 해부하고 준비하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 행동 분석법과 면역 형광 현미경 검사의 조합을 통해 발달 중 신경 구조의 이상이 행동 변화와 어떻게 관련되어 있는지 보여줄 수 있습니다.

이 기술의 의미는 신경 구조의 발달에 대한 더 나은 이해로 확장되어 신경 질환의 진행을 더 잘 이해할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생인 prag bot이 될 것입니다. 초파리 개체군을 섭씨 25도에서 12시간 밝고 어두운 주기로 유지합니다.

대조군과 실험군이 동일한 조명 조건에 노출되는 한, 이 기술은 표준 실험실 환경에서 수행할 수 있습니다. 확립된 개체군을 사용하여 암컷이 사과 주스에 밤새 알을 낳을 수 있도록 하여 유충을 수집합니다. 한천 접시는 아침에 접시를 바꾸고 수집된 접시 중앙에 작은 효모 덩어리를 놓습니다.

효모는 부화 한 유충을 유인하고 섭씨 25도에서 24 시간 동안 알이 자라도록하고 다음 날에는 페이스트에서 첫 번째 instar 유충을 수집합니다. 금속 주걱을 사용하여 유충을 신선한 사과 주스 또는 포도 주스 플레이트에 옮깁니다. 두 번째 및 초기 세 번째 Instar 유충을 수집하기 위해 분석을 수행하여 첫 번째 instar가 40-48시간 동안 숙성될 때까지 유충에 영양을 공급하기 위해 추가 효모 페이스트를 추가할 수 있습니다.

이 기간 동안 수유 속도는 일정하게 수집됩니다. 늦은 세 번째 instar 유충은 병에 담긴 유충을 올립니다. 주스 플레이트에서 늦은 세 번째 instar 유충을 키우는 것은 체세포 위 시스템의 농업 축적으로 인해 해로울 수 있습니다.

유충의 나이는 이 구조에 뚜렷한 변화가 있기 때문에 입 갈고리 형태학으로 확인할 수 있습니다. 각 유충 곰팡이에 대해 주스 플레이트를 물로 부드럽고 광범위하게 씻고 유충을 메쉬 필터에 부어 두 번째 및 세 번째 초기 유충을 수집 한 다음 행동 분석을 진행합니다. 100mm 조직 배양 접시의 2%에이서 기질에 두 번째에서 세 번째 후반 instar 유충 하나를 놓고 유충이 정확히 1분 동안 30초 동안 적응하도록 합니다.

카운터 집계를 사용하여 기질을 통한 각 후방에서 전방으로의 움직임은 동물 몸의 3/4에 걸쳐 발생하는 각 수축 점수를 매깁니다. 유충이 좌우로 흔들리지만 실제로 위치를 바꾸지 않으면 이러한 움직임에 점수가 매겨지지 않습니다. 때때로 후방 수축에 대한 완전한 전방(anterior)은 전진 운동(forward locomotion)과 같은 후진 이동을 생성합니다.

후진 이동도 점수가 매겨집니다. 최대 10마리의 동물을 총 실험한 후 분석 플레이트를 교체하십시오. 실험 조건당 최소 20개의 녹음을 수행합니다.

뭉툭한 이녹스를 사용하여 먹이 분석에서 운동 분석에 사용된 각 유충에 점수를 매깁니다. 다섯 번째는 핀셋입니다. 운동 농업 판에서 5ml의 균질한 효모 용액으로 덮인 농업 충전 판의 중앙으로 유충을 조심스럽게 옮깁니다.

효모 용액에서 유충은 대체로 그 자리에 남아 있고 사료 공급은 구강 갈고리 수축 속도와 직접적인 관련이 있으며, 이는 두인두 수축 권한의 확장 및 수축으로 간주됩니다 유충이 30초 동안 적응하도록 한 다음 1분 동안 카운터를 사용하여 입 고리 수축 횟수를 기록합니다. PBS에서 갓 준비한 4%EM 등급 포름알데히드를 3웰 스폿 유리에 로드하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 떠도는 세 번째 instar 유충을 PBS가 있는 해부 접시로 옮깁니다.

한쪽 집게로 뒤쪽 끝을 잡고 다른 쪽 집게로 입 고리를 잡고 뒤쪽 끝을 움직이지 않게 잡습니다. 입 고리를 부드럽게 당겨 내장에 접근합니다. 침샘, 뇌, 지방체 등과 같은 관련 조직을 모두 제거합니다.

그런 다음 각 장을 포름알데히드 고정제가 들어 있는 세 개의 우물 접시로 옮깁니다. 섭씨 4도의 온도에서 불투명한 조직 배양 상자에서 하룻밤 동안 내장을 배양합니다. 고정 용액을 제거하기 다음날 위 세카를 제거하고 입증된 심실 근처에 중장을 클립하여 돌출부를 방해 없이 명확하게 볼 수 있도록 합니다.

이제 정착액을 하나의 XPBT로 교체하고 조직이 부드럽게 흔들면서 10분 동안 배양하도록 합니다. 이 PBT 세척을 6회 수행합니다. 다음으로, 세로토닌을 추가하면 신경 구조에 영향을 주지 않고 세로토닌 신호 전달을 강화할 수 있습니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 흔들리지 않고 한 시간 동안 내장을 배양합니다. 한 시간 후, PBT로 장을 6회 철저히 씻어 1차 항체를 제거합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 장을 항 세로토닌 1차 항체로 배양합니다.

다음 날, 6번의 PPT 세척을 반복하고 섭씨 4도에서 90분 동안 2차 항체 배양을 합니다. 1-400 Alexa floor 5 68 염소 anti-US 또는 1-400 anti-rabbit IgG를 사용하십시오. PBT 세척 요법을 사용하여 2차 항체를 제거한 다음 4밀리몰의 탄산나트륨에 10분 동안 부드럽게 흔들어 내장을 배양합니다.

그런 다음 내장을 20 밀리몰의 탄산나트륨을 완충액으로 사용하여 4%N 프로필 갈레이트에 장착하고 분석을 위해 400배 배율로 형광 하에서 볼 수 있습니다. 입증된 심실의 뒤쪽 끝에서 이미지를 촬영하지 마십시오. 이러한 섬유는 단단히 묶여 있기 때문입니다. 중장에 있는 더 많은 후방 섬유는 일단 조직에 들어가면 매혹적이기 때문에 더 분지

가 많습니다.

뉴라이트(neuro lucita) 및 뉴로 익스플로러(neuro Explorer)와 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 뉴라이트(neuro lucita) 섬유를 정량화할 수 있으며, 이를 수동으로 계산하거나 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 명확하지 않은 단순한 nerite tracer 이미지는 섬유와 정맥류를 구별하기 어렵게 만들며, 섬유 구조가 배경과 명확하게 구별되는 경우 사용해서는 안 됩니다. 그리고 nerite 길이를 따라 개별 정맥류를 식별할 수 있는 경우 준비는 분석에 적합합니다.

또한 나머지 섬유에서 개별 정맥류를 식별할 수 있는 경우 이는 분석을 위한 고품질 이미지의 또 다른 지표입니다. 뇌에서 돌출된 축삭 섬유는 재발 신경으로 뭉쳐 있으며 분리되고 신경을 자극하는 입증된 심실에 도달할 때까지 분석하기에 적합하지 않습니다. The steamatic 위 시스템: 초점 범위를 벗어난 섬유를 제외한 모든 섬유를 분석합니다.

어떤 경우에는 섬유가 여러 초점면 사이를 구부리고, 뇌에서 입증된 심실까지 개별 섬유 돌기를 추적하고, 정맥류와 가지를 세고, 단위 길이당 큰 정맥류의 빈도를 계산합니다. 세로토닌 섭식 회로를 연구하는 것은 신경계 발달에 대한 특정 요인의 영향을 분석하는 데 효과적입니다. 공급 속도를 정량화하면 공급 회로의 축삭 구조를 기능적 출력과 연결할 수 있습니다.

운동 분석은 대조군 유전자형과 돌연변이 유전자형 간의 운동 반응에 차이가 없음을 보여줍니다. 돌연변이가 섭식 회로에만 영향을 미치면 돌연변이 타원체가 열립니다. EBO three는 중앙 복합체의 타원체에 구조적 결함이 있습니다.

야생형 부모의 혈통. CSWU는 EO 3이 수유 저하를 초래하는 반면 운동은 영향을 받지 않는다고 밝혔습니다. EO 3 돌연변이의 발달 결함은 장의 요산 구조에 영향을 미쳤습니다.

이 유충은 요산염 길이를 따라 크고 작은 다양한 가지와 더 많은 정맥류를 보여주었습니다. 화살표의 분기 노드, 화살표 머리의 정맥류, 별표의 큰 정맥류에 유의하십시오. 신경 분지의 이러한 변화는 통계 분석을 위해 정량화되었습니다.

이 절차를 시도할 때 유충이나 절개된 조직 샘플을 손상시키지 않도록 하는 것이 중요합니다.

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