Name: 맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-09T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 학습하세요 맹장 결찰 및 관통법을 이용하여 마우스에서 패혈증을 유도하고 조직 자가소화를 연구하는 방법을. 전자현미경으로 자가소화체 형성을 분석하여 감염 반응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 AMK 최에 NIH 부여 P01의 HL108801, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01-HL079904에 의해 지원되었다. S. Ryter는 난봉꾼 호흡기 연구소에서 급여 지원을 받았다.

참고 : 브리검 여성 병원 / 하버드 의과 대학 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 다음과 같은 절차를 승인했다. 1. 맹장 내고와 빵꾸 같은 배경의 마우스를 사용합니다 (C57BL / 6), 8-10 주 된 남성. 암컷 생쥐는 패혈증에 의한 치사율에 대한 남성보다 더 강한입니다. 팔주 세 이상 마우스는 CLP 후 생존의 측면에서 젊은 쥐보다 변수 결과를 생산하고 있습니다. 약 N은 비교 그룹에 10 마우스는 생존 분석을 위해 사용되어야한다 =. N = 3-5 마우스는 autophagy에 분석 실험에 적합하다. <ol><li> 설치류 수술에 적합해야한다 멸균 작은 수술기구 (즉 메스, 가위 무딘 해부 집게를) 사용합니다. </li><li> 마취 혼합물을 제조 : PBS의 7.95 mL에 자일 라진 (AnaSed 주사 100 ㎎ / ㎖)의 150 μL와 케타민 (Ketaset 700 μl를 추가 &#160; CIII, 100 ㎎ / mL). </li><li> 절차를 수행하는 동안 무균 조건을 보장하기 위해, 장갑, 얼굴 마스크와 수술 가운을 착용한다. </li><li> 동물의 무게를. intraperitonally 주입을 마취 (IP) μL (g에서 10 배의 체중)의 투여 량에서 3 단계에서 언급 한 혼합물. 예를 들어, 22g 무게 마우스의 마취 혼합물의 10x22 = 220 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 따라서, 자일 라진 및 케타민의 최종 투여 량은 17 ~ 80 ㎎ / kg 체중, 각각이다. 그 마취가 적절한 지 확인, 극한의 더 굴곡 발가락 핀치 이후에 생산 될 수 없습니다 참고 :. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 사용합니다. </li><li> 그들의 뒤에 깨끗한 작업 표면에 동물을 배치합니다. 꼬리와 뒷발은 수사관을 지향하고 있습니다. . 알코올 (70 %의 EtOH 용액)을 참고하여, 복부의 피부를 소독 : 외과 분야는 완전히 접촉을 통해 상처의 오염을 피하기 위하여, 면도해야모피. 또한, 최적, 순환 온수 패드는 수술 중 마취 된 쥐의 normothermia을 유지하는 데 사용되어야한다. </li><li> 메스를 사용함으로써, 작은 피부 절개 길이 방향과 평행하게 약 1cm은 정중선하는 왼쪽. 복강에 아직 침투하지 마십시오. 초기 절개를 확장하는 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 복부 근육을 확인하고 복강에 액세스 할을 해부하다. </li><li> 무딘 해부 집게를 사용하여, 맹장을 확인하고 복강 밖으로 이동합니다. (이것은 치명적인 출혈로 이어질 수) mesenterial 혈관이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 중간 등급 패혈증을 달성하기 위해 맹장의 60 %를 결찰. 같거나 저급 패혈증 맹장 결과의 25 % 미만을 결찰 반면 동일하거나 맹장의 75 % 이상을 결찰하는 것은 일반적으로 고품위 패혈증 초래한다. 회맹 (이것은 장 연속성을 차단할 수) 결찰하지 않도록주의하십시오. </li><li> 를 사용함으로써21 G 바늘, 결찰 근처에 한 관통 한 구멍 (2 개 구멍)에 의해 맹장 천공. 천공 방향은 장간막에서 맹장의 안티 장간막 측에 있어야한다. mesenterial 혈관에 구멍을하지 않도록주의. </li><li> 바늘을 제거합니다. 가볍게 두 개의 구멍을 통해 개방성을 확인하기 위하여 맹장 결찰 짤; 배설물의 소량 만이 그들을 통해 압출한다. </li><li> 복강에 결찰 및 천공 맹장 이동합니다. 참고 : 가짜 마우스의 경우, 1.10 ~ 1.12 단계를 건너 뜁니다. </li><li> 복부 근육을 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다. 복부 피부를 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다. </li><li> 열 및 절차를 수행하는 동안 손실 된 수분을 대체 할 예비 가온 1 ML (37 ° C) 생리 식염수의 IP를 주입한다. 자신의 소생 할 때까지 가열 램프 아래에 마우스를 놓고 참고 :. 최적, 안전 온난화 장치 (SU순환 온수 패드) 등 CH 대신 가열 램프를 사용할 수있다. </li><li> 수술 후 진통을 달성하기 위해 (. 0.05 ㎎ / ㎏ 체중 SC)의 buprenorphin 주입 참고 :.은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물이 방치 할 수 없습니다. 수술 적 치료를 겪은 동물이 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 할 수 없습니다. </li><li> 음식과 물에 대한 무제한 액세스를 다시 자신의 새장에있는 동물을 놓습니다. 그들은 (예 : 터치시 이동 장애 또는 청색증 등의 임상 증상으로 표시) 빈사가되면 마우스는 안락사됩니다. 그 전에 안락사에 죽는 것을 피하기 위해 마우스마다 4 시간을 확인합니다. </li></ol> 2. 조직 수확 및 고정 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 준비 889 ml의 PBS는 37 % PFA 111 ML을 추가합니다. </li><li> CO 2에 의한 마취 또는 케타민 / 자일 라진의 하나를 사용하여 마우스를 희생높은 복용량에서 olution. </li><li> 깨끗한 작업 표면에 마우스를 고정시킨다. 그것을 소독 70 %의 EtOH 용액으로 복부와 가슴 피부를 스프레이. </li><li> 복부 및 흉부 피부뿐만 아니라 기관의 지역을 커버하는 피부를 제거하는 메스와 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 그 주변의 조직 (근육과 결합 조직)을 제거하여기도를 알 수있다. </li><li> 기관의 주위에 (바늘을 절단하지 않고) 봉합사를 놓습니다. 아직 조이지 마십시오. </li><li> &#39;삽관&#39;기관으로 작은 말초 정맥 카테터 (20 G)를 사용합니다. 기관의 눈물을 피하기 위해 카테터 삽입시주의해야합니다. 기관의 가장 큰 직경이 바로 윤상 연골 아래에 있습니다. </li><li> 기관 / 카테터 주위에 봉합사를 조입니다. 기관에 카테터 만 플라스틱 캐 뉼러를 떠나 바늘을 제거합니다. 니들은 플라스틱 캐 뉼러를 삽입하기위한 가이드 선으로 만 제공. </li><li> 기관에 플라스틱 캐 뉼러를 확보 한 후, 일을 절단전자, 복부의 근육, 배를 열고 다이어프램을 보여준다. </li><li> 바늘을 사용하여, 기흉 (흉강으로 공기 즉, 삽입)을 생성하기 위해 격막을 천공. 폐는 축소되어야한다. </li><li> 작은 가위를 사용하여, 가슴 뼈 (흉골)을 따라 절단 다이아 프램을 제거, 갈비뼈를 제거하고 심장과 폐를 알 수있다. </li><li> 기관에 삽입 된 플라스틱 캐 뉼러를 통해, 30cm의 H 2 O의 압력 하에서 포름 알데히드 용액으로 폐를 고정합니다. </li><li> 폐를 제거하고 24 시간 이후에 70 %의 EtOH로 솔루션에 대한 4 % PFA에 넣지 처리까지. </li><li> 심장, 간, 신장을 식별하고 제거 할 수 있습니다. 동일한 방식으로, 처리 될 때까지 70 %의 EtOH에이어서 용액을 24 시간 동안 4 % PFA로 그들을 배치. </li></ol> 3. GFP 마우스 및 GFP의 슬라이드보기 <ol><li> 1 단계, 수술 후 절차에 따라 GFP-LC3 마우스에 CLP 및 가짜 수술을발 프로토콜의 단계 2에서 설명한 바와 같이. </li><li> 파라핀 조직 (즉, 폐, 심장, 간, 신장)을 포함하고 직렬 5 μm의 섹션에서 그들을 잘라. </li><li> 파라핀이 녹아 조직이 반투명 나타날 때까지 30 ~ 60 분 동안 60 ° C에서 배양하면 GFP 염색에 대 한 준비. </li><li> 자일 렌, 크실렌 대체,로 5 분 크실렌 1, 자일 렌 2, 자일 렌 (3)의 표준 등급 시리즈 Deparaffinize 다음 등급의 EtOH 시리즈의 3 분의 배양 : 후 100 %, 95 % 75 % 및 증류수에 헹군다. 참고 : 탈 파라핀 샘플 배경을 증가 조직의 건조를 방지 한. </li><li> 10-20 분 동안 레인지 작동하여, 구연산 완충액 (10 mM의 시트르산 나트륨 산, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)를 사용하여 항원 검색을 수행. 조직의 건조를 방지하기 위해 주기적으로 버퍼를 대체 할주의하십시오. </li><li> 솔루션은 항원 검색을 완료하는 벤치에 20 분 동안 식히십시오. </li><li> PBS로 2 배를 씻으십시오. 여분의 버퍼와 육 차원 속의를 제거nsfer 슬라이드 상자 또는 건조를 방지하기 위해 다른 가습 실에서 수평 위치로 랙에서 슬라이드. </li><li> 10 % 정상 당나귀 혈청 (도 5 % 소 혈청 알부민, 또는 차 항체가 생성되는 동물 바람직 혈청) PBS에 실온에서 45 ~ 60 분을 차단합니다. </li><li> 가습 실에서 4 ° C에서 하룻밤 PBS에서 1:100 희석에서 기본 GFP 항체에 샘플을 품어. 부드럽게 조직과 균일 한 접촉을 촉진하고 증발을 방지하는 항체와 조직을 통해 파라 필름의 작은 조각을 적용합니다. 참고 : 나머지 단계는 실온에서 수행된다. </li><li> 초과 기본 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 PBS에있는 이차 항체 1:500-1:1,000에 품어. </li><li> 과잉 차 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 원하는 경우,이 단계에서의 슬라이드를 counterstain. </li><li> 형광 차 항체를 사용하는 경우, 70 % EtOH로 F에서 0.1 % 수단 검정을 품어또는 15 ~ 20 분은 형광도를 줄일 수 있습니다. 조직 주위에서 초과 수단 검정을 닦아내고 20 분 동안 PBS로 5 배 씻는다. </li><li> coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다. </li></ol> 4. 대체 프로토콜 : GFP-LC3의 직접 검출 <ol><li> (50 / 50) V / 10월 PBS V의 ~ 500 mL를 Cannulate 및 팽창 폐. </li><li> cryomold의 바닥에의 OCT 소량을 넣어 OCT에서 포함 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 금형 해부 폐 단지를 배치합니다. </li><li> 메틸 부탄은 드라이 아이스를 사용하여 냉장을 통해 천천히 동결. </li><li> 조직이 완전히 덮여 얼어 될 때까지 더 OCT를 추가합니다. -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 보관 </li><li> cryomicrotome를 사용하여, 빛의 섹션을 보호하는 5 ~ 10 μm의 두께 부분을 잘라. 저장소 섹션 및 -80 ° C에서 나머지 조직 </li><li> , 이미지에 대한 슬라이드를 준비 냉동고에서 섹션을 제거하고 즉시 건조를 방지하기 위해 PBS의 드롭을 적용하려면. </li><li> 4 % PFA로 30 분 동안 수정. PBS로 세척. </li><li> 10 분 동안 DAPI / Hoescht을 적용합니다. PBS로 3 회 세척한다. </li><li> coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다. </li><li> 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관 샘플. </li></ol> 5. 전자 현미경에 대한 조직의 준비 <ol><li> 고정 약 1mm의 큐브로 조직을 잘라. </li><li> 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH를 7.4에서 2 %의 포름 알데히드, 2.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 조직을 고정합니다. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 세척. 참고 : 고정 된 조직을 4 ℃에서 0.1 M 나트륨 cacodylate에 저장 될 수있다 </li><li> 1 시간 동안 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1 % 오스뮴에 수정 프로그램을 게시합니다. </li><li> 10 분 배를위한 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 씻어. </li><li> 70 % EtOH로, 20 분 배에 탈수. 90 %의 EtOH, 10 분 2X에서 탈수. 100 %의 EtOH에 탈수,20 분의 2 배. </li><li> 10 분 2X 용 프로필렌 옥사이드 (에폭시 프로판)와 함께 배양한다. </li><li> 1 시간 프로필렌 옥사이드 / 에폭시 수지 혼합물 (50:50)으로 배양한다. 에폭시 수지의 혼합물이다 : 24g 한천 100 수지, 도데 세닐 숙신산 무수물 13g, 13g 및 무수 메틸 나 1ml의 N-벤질 디메틸 아민. 나무 주걱을 사용하여 일회용 비이커에 철저하게 섞는다. </li><li> 세척제 유리 병에 에폭시 수지 하룻밤 (이 남아있는 프로필렌 옥사이드가 증발 할 수 있습니다)에 품어. </li><li> 새로 제조 된 수지로 표시 캡슐에 포함. 48 시간 동안 60 ° C에서 중합. </li><li> 전자 현미경 필름 상에 80 또는 60 kV의에서 투과형 전자 현미경을 사용하여 사진 조직 섹션. 사진 용지에 이미지를 인쇄하거나 디지털 미디어를 저장합니다. </li><li> 핵을 포함하는 손상 세포에 autophagosome 형성을 분석합니다. 낮은 전력 필드 (E. g. 2,000-4,000 X)는 유핵 세포를 식별하기 위해 사용될 수있다. 일반적으로 6,800-10,000 X 이미지는 일에 사용됩니다autophagosome 정량화입니다. 적절한 통계적 표현을위한 15 ~ 30 필드에서 단위 면적당 autophagosomes를 계산합니다. Autophagosomes 늦게 단계 autophogosomes이 채워진 액포를 닮은 이중 막 구조를 가지고. </li></ol>

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저자는 선언 할 경쟁 금융의 이익이 없다

CLP의 주요 장점은 연구원이 (저에 대한 중간 및 높은 수준에서 즉) 다른 심각도의 패혈증을 조사 할 수 있다는 것입니다. 유도 패혈증의 심각도는 맹장 결찰의 길이 (가장 중요한 결정 인자)에 의해 영향을받는, 천자 사용 바늘의 크기와 구멍의 수는 15을 수행 하였다. 또한, 마우스의 피로와 성별은 패혈증의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 몇 가지 계통이 다른 사람보다 더 민감하고 남성은 일반적으로 여성 (19, 20)보다 더 취약합니다. 함께 찍은 위의 요인은 CLP에 의한 사망률을 결정합니다. 우리의 경험에 근거하여 달성 CLP 인한 사망률과 관련 연구자 간의 차이가있다. . 예를 들어, Rittirsch는 등 60 %의 사망률 (15)를 달성하기 위해 &#39;관통 한&#39;천자 (두 개의 구멍) 50 % 내고, 21 G, 1을 사용, 우리의 연구 그룹을 필요로...

패혈증, 감염에 대한 전신 염증 반응은 비판적으로 아픈 환자 1에서 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 자주 polymicrobial 패혈증에 이르는 복강 내 감염, 최대 60 % 2의 상당한 사망률이있는, 패혈증 케이스의 20 %를 차지하고있다. 패혈증 관련 사망률은 주로 다음 장기 부전 3,4에 다 장기 부전의 결과. 이 질병의 발병 메커니즘에 추가적인 조사가 급하게 신규하고보다 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 필요하다. 맹장 결찰술 및 천자 (CLP) 방법은 생체 내에서 모델링 패혈증 일반적으로 사용되는 절차입니다. 궁극적으로 맹장 박테리아 가득으로, polymicrobial 복막염에서의 천자 결과, 혈액 (균혈증)에 박테리아의 전위, 패 혈성 쇼크, 다 장기 부전 및 사망 5. 그것은 일반적으로 CLP 임상 반영 접수더 정확하게 설치류에 독소 또는 정제 된 박테리아의 주사와 같은 이전 기술보다 현실 따라서, CLP는 패혈증의 발병 기전의 조사, 따라서 실험 유도 6 (하지 제한없이이기는하지만) 황금 표준으로 간주된다. 이 논문에서, 우리는 패혈증의 발병 메커니즘은 autophagy에 포함 여부를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. autophagy에, 진화 적으로 보존 된 휴대 과정은 손상된 단백질과 같은 미토콘드리아 같은 세포 내 소기관의 턴 오버를 촉진하고 세균 7,8 등의 세포 내 병원균의 정리에 중요한 역할을합니다. autophagy를하는 동안, 세포 내 단백질이나 세포 소기관은 이후 저하 9의 리소좀에 전달 autophagosomes라는 이중 막 결합 소포로 압수됩니다. 단백질의 수는 autophagy에 관련 유전자의 포유 동물 동족체 (ATG)으로 식별 된,원래는 autophagy의 과정을 조절하는 효모에서 발견. LC3B-I (자유 양식)에서 미세 소관 관련 단백질 1 경쇄 3B (LC3B) (Atg8의 상동)의 변환 (포스파티딜 에탄올 아민 - 복합 양식)-II를 LC3B하려면 autophagosome 형성 9에있는 중요한 단계를 나타냅니다. Autophagic 장애는 노화와 암, 신경 퇴행성 질환 (10)을 포함하여 인간의 질병과 연관되어 있습니다. 또한, autophagy에는 면역 세포 (8)에 의해 항원 프레 젠 테이션, 림프구 개발과 사이토 카인의 분비와 같은 타고난 및 적응 면역에 영향을 미칩니다. 따라서, autophagy에 또한 감염에 전신 염증 반응 (즉, 패혈증)에 역할을 할 수 있다는 합리적인 것 같다. 지금까지 여러 가지 방법이 생체 내에서 조직 손상에 autophagy에의 역할을 평가하기 위해 기술되었다. 이들은 녹색 형광 단백질 (GFP) LC3 표현 생쥐의 사용과 자동의 정량화를 포함전자 현미경으로 조직 된 phagosomes는 (이 두 가지 방법은이 논문에서 설명합니다). 추가 방법은 조직 균질 autophagic 단백질 발현의 정량화하고, (다른 곳에서 설명) autophagic 플럭스의 분석 11 ~ 13 있습니다. 이 검토의 목적은 실험 패혈증의 컨텍스트에서 생체 내 autophagy에 대한 평가를 위해 현재의 프로토콜을 제공하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>GFP-LC3 형질전환 마우스</td><td>Riken (일본)</td><td>RBRC00806</td><td>GFP-LC3#53</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry-Schein</td><td>568-0606</td><td>Xylazine HCl 주입 수의사</td></tr><tr><td>케타민</td><td>Henry-Schein</td><td>995-2949</td><td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A405-20</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizatiion용</td> 조직학 등급<td>EtOH</td><td>Fisher</td><td>A407-1</td></tr><tr><td>실크 외과 봉합사 6-0</td><td>Owens & 미성년자</td><td>2300-0078OG, 017624</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀-HCl</td><td>Henry-Schein</td><td>614-5157</td><td>부프레넥스 앰플</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(37%) 용액</td><td>JT Baker</td><td>S898-09</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP 단클론 항체</td><td>Life Technologies</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Sigma</td><td>944403</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR scientific</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>수단 블랙</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-203760</td><td></td></tr><tr><td>EM 등급 글루 타르 알데히드 2.5 % cacodylate</td><td>나트륨 전자 현미경 과학</td><td>15960</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>시그마</td><td>240397</td><td></td></tr><tr><td>한천 100 수지</td><td>한천 과학</td><td> R1045</td><td></td></tr><tr><td>도데세닐숙신산 무수물</td><td>시그마</td><td>46346</td><td></td></tr><tr><td>메틸나딕 무수물</td><td>시그마</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>N-벤질디메틸아민</td><td>시그마</td><td>185582</td><td></td></tr></tbody></table>

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 polymicrobial 패혈증 발생 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. 여기서, 프로토콜 CLP 기술을 사용하여 마우스에 다양한 중증도의 패혈증을 유발하도록 제공된다. autophagy에 스트레스와 병원균 침입에 대한 근본적인 조직의 반응이다. 실험 패혈증의 맥락에서 생체 내에서 autophagy에를 평가하기 위해 현재의 두 프로토콜도 여기에 표시됩니다. (I), 녹색 형광 단백질 (GFP) - LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 CLP을 실시한다. GFP 신호 (puncta에)의 현지화 강화는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로, 향상된 autophagosome 형성을 감지하고, autophagy에 경로의 따라서 변경 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. (autophagy에 자극 마커 등) 단위 조직 면적당 (II) 향상된 autophagic 액포 (autophagosome) 형성은 전자 현미경을 사용하여 정량화 될 수있다. 패혈증 autophagic 반응의 연구는 중요한 샘플입니다조직이 감염에 반응하는 메커니즘을 이해 onent. 이 지역에있는 연구 결과는 궁극적 중요한 치료 의학의 주요 문제를 나타내는 패혈증의 발병 기전을 이해에 기여할 수있다.

균혈증은 초기 CLP-유도 패혈증 14 후 6 시간으로 마우스에 존재한다. (오한, tachypnoea 및 손상 모터 활동 포함) 패혈증의 임상 증상은 수술 후 약 12​​ 시간으로 나타납니다. 마우스는 복막염의 유도 후 약 18 시간에서 죽기 시작 CLP를 실시. 더 심한 더 증가 패혈증은 ​​치사율 (15)이다. CLP 후 7 일에서 60 %의 사망률 중급 패혈증 결과 (이 시간 제한을 넘어, 사망자가 예상되지는) 동안 구체적으로, 고급 패혈증 (그림 1) 2 ~ 3 일 이내에 100 % 사망의 원인이됩니다. 대조적으로, 모의 생쥐의 사망률이 0이어야 <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51066/51066fig1highres.jpg" src="/files/f...

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

본 절차의 전체적인 목적은 마우스의 맹장 결찰 및 천자를 통해 패혈증을 유도함으로써, 손상된 단백질과 소기관의 교체를 촉진하는 항상성 과정인 조직 자가포식을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 마취된 마우스의 복강 내에서 맹장을 찾아 외부로 노출시킴으로써 수행됩니다. 맹장이 분리되면, 맹장의 60%를 결찰한 후 천공하여 중등도 복막염을 유도합니다.결찰 및 천공된 세슘을 복강 내에 다시 넣고 동물을 회복시킵니다. 마지막 단계는 24시간 후 패혈증 동물로부터 폐, 간 및 신장 조직을 채취하는 것입니다. 최종적으로, 패혈증 동물에서 채취한 조직의 온전한 세포 내에서 오토파고솜 형성을 보여주기 위해 전자현미경이 사용됩니다.패혈증을 유도하고 오토파지를 연구하기 위한 수단으로 Cecal Ligation and Puncture (CLP) 방법을 제시하겠습니다. 내독소 주입과 같은 이전 방법들에 비해 이 기술이 가지는 주요 장점은 임상적 관련성입니다. CLP는 인간의 다균성 패혈증으로 잘 알려진 원인인 복막염을 유발합니다.자가포식(Autophagy)은 기아 상태나 세균 감염에 의해 활성화될 수 있는 조직의 일반적인 스트레스 반응으로, 자가포식 과정 동안 소기관 내의 단백질을 포함한 세포질 물질이 이중막 구조의 파고솜(phagosome) 내로 격리된 후 분해를 위해 리소좀으로 전달됩니다. 먼저, 작업 영역을 준비하고 수술에 필요한 멸균 수술 도구들을 배치합니다. 마취제를 투여한 후, 발가락 꼬집기 반사(toe pinch reflex)를 통해 진정 상태를 확인합니다. 준비가 되면 동물을 깨끗한 작업 표면에 놓고 눈에 연고를 도포합니다.제모 후, Betadine과 에탄올을 반복적으로 도포하여 수술 부위를 소독합니다. 메스를 사용하여 정중선에서 왼쪽으로 약 1cm 떨어진 지점에 평행하게 피부를 작게 세로로 절개합니다. 복강 내로 침범하지 않도록 주의하며, 작은 가위를 사용하여 초기 절개 부위를 확장합니다.다음으로, 복근을 확인하고 절개합니다. 복강에 접근하기 위해 포셉을 사용하여 맹장을 확인하고 강 밖으로 이동시킵니다. 치명적인 출혈을 일으킬 수 있는 장간막 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 맹장을 분리한 후, 원하는 패혈증 정도에 따라 결찰합니다. 여기서는 중간 정도의 패혈증을 유도하기 위해 60%를 결찰합니다.21 gauge 바늘을 사용하여 결찰 부위 근처의 맹장을 천공하며, 맹장은 장간막 측에서 반장간막 측 방향으로 천공해야 합

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간 패혈증 연구에 유용한 도구로 cecal 내고 주사의 마우스 모델입니다.

Cecal 내고의 찔린 절차

패혈증은 미생물 감염으로 인한 전신 염증 반응 증후군을 참조하고, cecal 내고 주사 (CLP)을 되나 수술 기법에 의한 시뮬레이션이 될 수 있습니다. 여기 치료 대리인을위한 약초를 구분할 CLP 유발 동물 모델을 사용하는 방법을 설명합니다.

소설 허벌 요법을 평가하는 패혈증의 동물 모델의 사용

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

여기 장 장벽 위반 후 박테리아에서 파생 된 화합물의 입구를 모방 하는 프로토콜 제공 됩니다. Lipopolysaccharide sublethal 저용량 24 h 후 주입에 대 한 모니터링 했다 생쥐에 체계적으로 주입 했다. 프로 염증 성 cytokines의 표정은 비장, 간, 그리고 콜론에서 여러 시간 지점에서 결정 되었다.

장 방 벽 위반 후 미생물 파생 제품의 입구를 모방 하는 쥐로 Lipopolysaccharide의 주사

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

이 프로토콜은 면역 억제 상태에서 이차 병원 획득 감염의 근본적인 전염성 결과를 측정하는 기술을 설명합니다. 면역 억제 패혈증의 임상적으로 관련 모델을 만들 수 있습니다.

세칼 결찰 및 천자 및 비강 내 감염 이중 모델 패혈증 유발 면역 억제 설계

이 프로토콜은 패혈증의 마우스 모델에서 맹장 결찰 및 천자 (CLP)의 수술 세부 사항을 제시합니다. CLP는 패혈증의 동물 모델을 만들기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 따라서 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻으려면 표준화된 CLP 프로토콜이 필요합니다.

패혈증의 맹장 결찰 및 천자 유도 마우스 모델에서 신뢰할 수 있는 바이오마커의 평가

이 프로토콜은 마우스 모델 시스템에서 그람 음성 단세균 패혈증의 유도를 기술한다. 상기 모델은 패혈증 동안 염증성 및 치명적인 숙주 반응을 조사하는데 유용하다.

살모넬라 티피뮤리움-유도된 마우스의 패혈성 복막염의 특징

이 쥐 모델은 패혈증 모욕과 뒷다리 근육 사용을 결합하여 전형적인 패혈증 환자의 병상 특징을 요약합니다. 이 모델은 패혈증의 근육 기능 장애를 연구하기 위한 이전 모델에서 크게 벗어난 것이며 이 상태를 치료하기 위한 치료 전략을 다루기 위한 재현 가능한 접근 방식입니다.

A Preclinical model of Sepsis-Induced Myopathy with Disuse in mouse(마우스에서 사용하지 않는 패혈증 유발 근병증의 전임상 모델)

여기서는 Klebsiella pneumoniae 를 비강 주입하여 마우스 패혈증 면역억제 모델을 구축하는 프로토콜을 제시하고, 다양한 지표를 통해 모델을 검증하였습니다.

비강 주입을 통한 마우스 패혈증 유도 면역억제 모델 구축

학습하세요 맹장 결찰 및 관통법을 이용하여 마우스에서 패혈증을 유도하고 조직 자가소화를 연구하는 방법을. 전자현미경으로 자가소화체 형성을 분석하여 감염 반응 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

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