Name: 를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사 체외 준수의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 생균제 Streptococcus salivarius가 Streptococcus pneumoniae의 상피세포 부착을 억제하는 능력을 평가하는 체외 부착 분석법을 통해. 이 방법은 폐렴구균 식민화 예방 전략 개발에 기여합니다.

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이 작품은 머독 아동 연구소와 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에서 자금에 의해 지원되었다.

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Jacoby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+co-occurrence+of+Streptococcus+pneumoniae+with+other+bacterial+and+viral+pathogens+in+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract.</a> Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).</li>
<li>Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acquisition+and+high+nasopharyngeal+co-colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+three+respiratory+pathogens+amongst+Gambian+new-borns+and+infants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants.</a> BMC Infect. Dis. 11, (2011).</li>
<li>Licciardi, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+against+pneumococcal+disease%3A+critical+interactions+between+probiotics+and+the+airway+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome.</a> PLoS Pathog. 8, (2012).</li>
<li>Popova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+probiotics+in+upper+respiratory+tract+infections+and+their+mechanical+actions+to+antagonize+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens.</a> J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).</li>
<li>Pracht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavA+of+Streptococcus+pneumoniae+modulates+adherence%2C+invasion%2C+and+meningeal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation.</a> Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).</li>
<li>Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+human+bronchial+epithelial+cells+%28BEAS-2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B).</a> Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+pneumoniae+adherence+to+human+epithelial+cells+in+vitro+by+the+probiotic+Lactobacillus+rhamnosus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG.</a> BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).</li>
<li>Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+bacteriocins+and+the+case+for+Streptococcus+salivarius+as+model+oral+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics.</a> Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).</li>
<li>Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+oral+probiotic+Streptococcus+salivarius+K12+in+the+prevention+of+recurrent+pharyngitis+and%2For+tonsillitis+caused+by+Streptococcus+pyogenes+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).</li>
<li>Fiedler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+respiratory+tract+streptococci+against+Streptococcus+pyogenes+biofilm+formation+and+epithelial+cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).</li>
<li>Slotved, H. C., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+pneumococcal+isolates+representing+23+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes.</a> BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).</li>
<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
<li>Smith-Vaughan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nasal+bacterial+load+and+its+association+with+otitis+media%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ear+Nose+Throat+Disord%22%5BJournal%5D)">Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media.</a> BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).</li>
<li>Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+of+bacterial+adhesion+onto+mammalian+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 분석의 중요한 부분은 S.의 적절한 농도를 추가하고 섹션 3.1.7 및 3.1.12에 살리 바리우스와 폐렴 구균. 농도는 OD의 수치를 사용하여 추정되지만 플레이트 다음날 계산 될 때까지 정확한 접종이 결정되지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 중간 로그 위상을 식별하고 OD하여 농도를 추정을 지원하기 위해 분석에서 사용 된 모든 세균 균주에 대해 시간 OD 및 균수 (CFU / ㎖)를 측정하기 위해 성장 곡선을 수행하는 추천한다. 또한, 폐렴 구균 균주는 준수의 특성에 실질적으로 다를 수 있습니다. 좋은 부착 (&gt; 3 시간 배양 후 상피 세포에 부착 접종의 10 %)가 폐렴 구균 부착을 억제하는 프로 바이오 틱의 능력을 조사 분석에 대한 추천과 긴장. 숙련 된 작업자에 의해 실시하는 경우에도 부착 수준은도 5에서 볼 비교적 큰 오차 막대에 의해 입증되는 바와 같이, 분석에 분석을 변화 할 수있다. 들면이러한 이유로 우리는 각각의 분석 조건에 대한 중복 된...

연쇄상 구균 폐렴 (폐렴 구균)는 폐렴, 중이염, 수막염 등의 감염을 일으킬 수있는 그람 양성 세균이다. 그것은 저소득 국가 어린이 매년 1 5 세 미만 어린이의 약 80 죽음에 책임이있는 질병의 주요 원인입니다. 폐렴 구균은 종종 어린이의 비 인두에서 수행됩니다. 이 식민지는 일반적으로 자각 증상이없는 것으로 간주되어 있지만, 그것은 폐렴 구균 감염을 앞에 인간의 인구 2의 박테리아를위한 저수지 역할을한다. 폐렴 구균 결합되는 예방 접종이 효과적으로 백신에 포함 된 혈청 형의 운송을 줄일 수 있습니다. 그러나, 90 폐렴 구균 혈청 형에, 그리고 예방 접종은 백신 혈청 형의 제거가 nonvaccine 혈청 형 3에 의한 운송과 질병의 상승 뒤에된다 혈청 형의 교체로 이어질 수 있습니다. 또한, 약간의 위험이 높은 집단에서, 폐렴 구균식민지는 종종 이전에 첫 번째 백신 투여 량 4.5의 관리에, 초기 생활에서 발생합니다. 최근, 프로바이오틱스의 사용은 폐렴 식민 6,7을 억제하는 추가의 전략으로서 제안되었다. 체외 부착 분석법은 폐렴 구균 부착 8,9를 검사하는데 사용되어왔다. 이러한 분석은 폐렴 구균 준수 (10)의 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus GG (LGG)의 영향을 조사하기 위해 적용되었다. LGG 유용한 유산균 이외에, 스트렙토 코커스 살리 바리우스, 구강 공통 상주 인해 잠재적 체외 (11) 내에 폐렴 구균 및 다른 호흡기 병원체를 억제하는 능력의 정착에 호흡기 대한 잠재적 생균제로서 연구되어왔다 - 13. 여기에 제시된 프로토콜은 S.의 효과를 조사하기 위해 사용되는 접착 분석을 설명 폐렴 구균 준수에 살리 바리우스 K12인간의 상피 세포 라인 CCL-23. 성장과 준수 속성을 분리 10,14 사이에 실질적으로 다를 수있는 분석에 사용하기 전에, 폐렴 구균 균주는 준수의 기능을 평가 하였다. 폐렴 구균과 S.의 성장 곡선 살리 바리우스는 (OD, 그림 1) 광학 밀도 중반 로그 단계 및 추정 농도 (콜로니 형성 단위 또는 CFU / ㎖)을 결정하기 위해 수행되었다. 그것은 각각의 분석에서 사용하기 전에 분리를 위해 가능한 수와 OD로 성장을 검사하는 것이 좋습니다. 이 분석은 표준 조직 배양 시설 및 장비 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, S의 3 회에의 영향 살리 바리우스 이전 S.의 준수에 대한 폐렴 구균의 추가로 1 시간을 관리 폐렴 PMP843, 비 인두 면봉에서 파생 된 혈청 형 19F 캐리지 분리가 검사됩니다. 부착 폐렴 구균을 정량화하는 두 가지 방법이 제시되어 있습니다 억제 혈액 한천에 도금내 가능한 수, DNA 추출 및 qPCR에 (15)에 의해 폐렴 구균 리타 유전자의 검출. 기본적인 부착 분석 프로토콜은 쉽게 여러 복용량 또는 프로바이오틱스의 투여 시간을 시험하기 위하여 변형 될 수 있고, 또한 다른 균주 또는 종으로 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>최소 필수 매체(MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>눅크</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23 셀</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트립신</td><td>생명 기술</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>말 혈액 한천 (HBA) 플레이트</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>양 혈액 한천 플레이트도 허용</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt Broth</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>D141-100MG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>일회용 큐벳</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>화이자</td><td>2112105</td>은 <td>5,000 IU/5m/&nbsp의 멸균 앰플에 들어 있습니다.</td></tr><tr><td>멸균 스프레더</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>대안적으로, 유리 스프레더는 96% 에탄올에 담그고 화염 멸균</td></tr> 전에 <tr><td>매번 Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>을</td></tr> 사용할 수 있습니다.<tr><td>무탄올리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>키아겐</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 미니 키트 (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F 프라이머</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>맞춤 제작</td><td>5' -> 3' 시퀀스 ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R 프라이머</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>맞춤 제작</td><td>5' -> 3' 시퀀스&nbsp; TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA 프로브</td><td>Eurogentec</td><td>맞춤 제작</td><td>5' -> 3' 시퀀스 Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, 대체 형광체를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III 초고속 QPCR 마스터믹스</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 감지 플레이트&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraclear qPCR 캡 스트립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR 시스템</td><td>애질런트 기술</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*대체로 나열된</td><td></td><td></td> 대부분의/모든 제품에 대해 대체 소스가 사용 가능합니다<td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

비 인두의 상피에 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 준수는 식민지가 발생할 수 있습니다합니다. 체외 준수의 분석이 세포를 상피 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수있는 폐렴 및 중이염 등의 폐렴 구균 감염을위한 전제 조건으로 간주됩니다 단층과 같은 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하는 폐렴 구균 식민지을 억제 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 (때때로 HEP-2 세포로 지칭) 인간 상피 세포주 CCL-23 폐렴 구균의 부착에 생균제 스트렙토 코커스 살리 바리우스의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 분석은 세 가지 주요 단계를 포함한다 : 상피 세포와 박테리아 세포의 1) 준비, 세포 단층 상피 박테리아의 2) 또한, 실행 가능한 횟수 (시리얼 희석 도금) 또는 정량 실시간 PCR (qPCR에 의한 부착 폐렴 구균의 3) 검출 ). 이 절반hnique은 비교적 간단하고 조직 문화 설정 이외의 특수 장비를 필요로하지 않습니다. 분석은 다른 생균제 종 및 / 또는 폐렴 구균 군체의 잠재적 억제제를 시험하는데 사용될 수 있고 쉽게 폐렴 구균 부착 및 침윤에 관한 다른 과학 문제를 해결하기 위해 수정 될 수있다.

대표적인 실험의 결과가되는 폐렴 구균에 (S. pneumoniae에 PMP843, 정착 19F 분리)를 1 시간 S의 첨가 후 CCL-23 세포에 추가 된 살리 바리우스, 및 폐렴 구균 부착이 가능한 횟수 및 리타 qPCR의 양에 의해 정량화되었다 표 2에 나타낸다. 결과 개수로 표준화 박테리아의 절대 수 (CFU / ㎖로 표시) 및 % 부착, 모두이 방법 간의 일치했다 혼자 폐렴 구균을 포함하는 우물의 부착 폐렴 구균. 이 폐렴 구균 부착을 억제하는 것으로 알려져 있으므로 폐렴 구균 + 헤파린 상태에서 감소가 부착 (일반적으로 &lt;40 % 형 폐렴 구균에 비해). S.에게 성공적인 분석 나타내는 바와 같이 헤파린은 대조군으로 사용 표 2, S.의 고농도 같이 살리 바리우스는 용량 의존적 방식으로 폐렴 구균 부착을 억제 살리 바리우스 (...

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 프로바이오틱스 streptococcus cell levarius가 상피 세포주에 대한 폐렴구균의 부착을 억제하는 능력을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 CCL 23 상피 세포 단층을 준비합니다. 24웰 플레이트의 단층에 slovar와 폐렴구균을 순차적으로 첨가한 후 세포를 배양합니다.마지막 단계에서는 비부착 세균을 제거하기 위해 웰을 세척합니다. CCL 23 상피 세포를 용해하고 웰의 내용물을 수집합니다. 최종적으로, 세포 결합 폐렴구균의 수를 정량화하여 salivarius가 폐렴구균의 부착에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.이 방법은 프로바이오틱스가 폐렴구균과 같은 세균성 병원균의 부착을 억제할 수 있는지와 같이 감염병 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 당사는 호흡기 계통에서 lactobacillus hypnosis, GG 및 기타 프로바이오틱스의 잠재적 활용을 연구하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 절차의 시연은 당사 연구실의 박사 과정 학생인 Jane Manning과 Zen이 담당합니다. 실험 전날, confluence CCL 23 상피 세포 배양물을 분할한 다음, 멸균된 50 mL 튜브에서 예열된 배지를 사용하여 150,000 cells/mL 농도로 희석합니다.다음으로, 처리된 24웰 조직 배양 플레이트의 웰당 1 mL의 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음 10 µL 루프 접종기를 사용하여, 각 박테리아 배양액에서 분리된 10~12개의 콜로니를 0.5% 효모 추출물이 첨가된 10 mL의 Todd Hewitt 배지 분주액에 접종합니다. 짧게 볼텍싱한 후, 실험 당일에 배양액을 14~16시간 동안 배양합니다.각 세균 배양액을 3~5초 동안 볼텍싱한 다음, 10 mL의 브로스(broth)가 들어 있는 라벨이 부착된 예열된 튜브에 pneumococci 100 µL와 salivarius 100 µL를 각각 첨가합니다. 접종된 튜브를 3~5초 동안 볼텍싱하고 37 °C에서 배양하여 배양액을 mid log phase까지 성장시킵니다. CCL 23 세포 배양의 합류도(confluency)가 최소 80%임을 확인한 후, 전이 피펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거합니다. 이때 세포 단층이 흐트러지지 않도록 플레이트를 약간 기울입니다. 그 다음, 약 500 µL의 예열된 PBS를 첨가하고 전이 피펫으로 액체를 부드럽게 제거하여 웰을 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후 단층을 보존하기 위해 세척하는 동안 플레이트를 기울이십시오. 각 웰에 미리 데워둔 배지 500 µL를 추가하고, 박테리아 배양액을 준비하는 동안 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 먼저, 흡광도 600에서 levarius 배양액 1 mL의 광학 밀도를 측정하십시오.그런 다음 5 mL의 Sal Levarius 배양액을 10 mL 튜브로 옮기고 실온에서 1,870 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, OD 측정값에 따라 펠릿을 0.85% 염화나트륨 200~1000 µL에 현탁하여 최종 농도가 약 1.5 × 10⁹ CFU/mL가 되도록 합니다. 실제 첨가된 박테리아 수는 다음 날 콜로니 계수를 수행하기 전까지는 확정되지 않으므로, 정확한 수의 박테리아를 첨가하는 것이 이 실험에서 가장 까다로운 부분입니다.이제 재현탁한 타액 접종물을 'high'라고 표시된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 분석을 위한 중간 및 낮은 농도의 alvar를 만들기 위해, 0.85% sodium chloride를 더해 고농도 접종물을 1:10 및 1:100로 희석합니다. 희석 단계 사이에 튜브를 볼텍싱하여 헤파린 대조군 웰을 생성합니다. 각 대조군 웰에서 40 µL의 배지를 제거하고 50 µL의 heparin을 추가하여 웰당 최종 농도가 100 units/mL가 되도록 합니다.CCL 23 세포만 포함된 웰과 CCL 23 세포 및 폐렴구균이 함께 포함된 웰에 0.85% sodium chloride 10 µL를 추가하고, 모든 SIV 농도 구역을 완전히 볼텍싱합니다. 그 다음, 박테리아와 세포 단층의 접촉을 촉진하기 위해 적절한 웰에 희석되지 않은 SIV와 1:10 및 1:100로 희석된 다양한 농도의 SIV 10 µL를 각각 추가합니다. 플레이트를 상온에서 114 ×g로 3분간 원심분리한 후, 세포를 배양하는 동안 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션합니다. 타액 스톡을 0.85% sodium chloride로 연속 희석하고, 멸균 스프레더를 사용하여 10⁻⁵, 10⁻⁶ 및 10⁻⁷ 희석액 100 µL를 말 혈액 한천 배지에 이중으로 도말합니다.단층 배양이 완료될 무렵, 플레이트를 뒤집은 상태로 하룻밤 동안 배양합니다. 폐렴구균 배양액의 광학 밀도를 측정한 후, 세포 1 mL를 원심분리하여 가라앉힙니다. OD 측정값에 따라 펠렛을 0.85% 염화나트륨 300~2000 µL에 재현탁하여 최종 농도가 약 150 million CFU/mL가 되도록 조정합니다.그런 다음 음성 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 희석하지 않은 pneumococci 10 µL를 추가하고 24-웰 플레이트를 다시 원심 분리한 뒤, 공동 배양물을 3시간 동안 배양합니다. 배양 단계 동안 pneumococcal stock을 salivarius와 유사한 방식으로 연속 희석하여 플레이트에 도말합니다. 3시간의 배양 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 세포병변효과가 있는지 확인합니다.이제 각 웰에서 배지를 제거하고, 단층 세포가 손상되지 않도록 주의하며 1XPBS로 공동 배양물을 세 번 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거합니다. 그런 다음 0.1% Digitonin 200 µL를 넣어 37 °C, 5% CO2 조건에서 7분 동안 세포를 용해합니다. 다음으로, 각 웰에 THB 800 µL를 첨가합니다.각 웰에서 피펫으로 수차례 상하 혼합한 후, 세포 현탁액을 수확하여 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 마지막으로, 부착된 폐렴구균을 단계별로 희석한 다음, 다음 날 적절한 희석 평판에서 콜로니 수를 측정합니다. 이 표에서 폐렴구균과 alvar를 정량화하기 위해, slovar를 첨가한 1시간 후에 폐렴구균을 CCL 23 세포에 추가한 대표적인 실험 결과가 제시되어 있습니다.폐렴구균의 부착 정도는 생균수 측정법과 lit. A-Q-P-C-R 결과 모두를 통해 정량화하였습니다. 두 방법 모두 박테리아의 절대 수와 부착 백분율에 대해 일관된 결과를 보였습니다. 폐렴구균만 포함된 웰 내의 부착된 폐렴구균 수를 기준으로 표준화하였습니다.헤파린(Heparin)은 폐렴구균의 부착을 억제하는 것으로 알려져 있어 대조군으로 사용됩니다. 따라서 폐렴구균 단독 샘플과 비교하여 폐렴구균과 헤파린을 함께 처리한 샘플에서 부착률이 약 40% 이상 감소했다면 해당 분석이 성공적으로 수행되었음을 나타냅니다. 타액은 농도 의존적으로 폐렴구균의 부착을 억제하며, 폐렴구균 1개당 타액의 농도가 약 10배인 고농도 조건에서 폐렴구균의 부착률이 가장 낮게 나타났습니다.이 그래프들은 폐렴구균을 처리함과 동시에, 또는 처리 1시간 전이나 후에 salivarius를 첨가했을 때 CCL 23 세포에 대한 폐렴구균의 부착 정도를 보여줍니다. Alvar를 폐렴구균 처리 전에 첨가했을 때 폐렴구균 부착 억제 효과가 더 높게 나타났으며, 전처리 시험에서 Alvar의 고농도 및 중농도 투여군 모두 폐렴구균 부착을 유의미하게 감소시켰습니다. 반면, 동시 처리 및 후처리 시험에서는 Slovar의 고농도 투여군에서만 폐렴구균 부착 억제 효과가 나타났습니다.이 영상을 시청하신 후에는 프로바이오틱스 streptococcus cell areas에 의한 폐렴구균 부착 억제 정도를 측정하기 위한 in vitro 분석법 수행 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다.

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

출처: Jagau, H. et al. 일정한 흐름의 원발성 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 일정한 배지 흐름 조건에서 내피 세포의 VWF(Von Willebrand Factor) 스트링에 대한 폐렴구균 부착의 실시간 시각화를 보여줍니다. VWF 방출을 자극하고, 문자열에 라벨을 붙이고, 박테리아 결합을 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

일정한 배지 흐름 하에서 일차 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 부착 평가

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

이 비디오는 생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석을 보여줍니다. 멀티웰 플레이트에서 담즙염이 보충된 매체의 박테리아는 고체 표면에 부착되어 생물막을 형성하며, 이는 결정 바이올렛 염색 및 에탄올 처리를 통한 비색법으로 확인됩니다.

생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

폐렴구균의 경쟁은 폐렴구균 및 기타 관련 종에 대한 억제 활성을 가진 작은 항균 펩타이드인 박테리오신 (bacteriocin)에 의해 매개됩니다. 여기에서는 박테리오신 활성 및 억제 스펙트럼, 박테리오신 특이적 면역 및 분비된 정족수 감지 펩타이드의 검출을 특성화할 수 있는 최적화된 박테리아 오버레이 분석에 대해 설명합니다.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

이 연구는 gavaging 정확한 양의 신생아 쥐에 probiotics의 과정을 자세히 설명합니다. 실험 설정 포함 하도록 최적화 되었다 하지만 probiotic 주입, 관리의 방법 및 내장에 있는 박테리아의 정량화에 국한 되지 않습니다.

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P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

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학습하세요 생균제 Streptococcus salivarius가 Streptococcus pneumoniae의 상피세포 부착을 억제하는 능력을 평가하는 체외 부착 분석법을 통해. 이 방법은 폐렴구균 식민화 예방 전략 개발에 기여합니다.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사

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