를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사 체외 준수의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 프로바이오틱 연쇄상구균 세포 레바리우스가 상피 세포주에 대한 폐렴구균 부착을 억제하는 능력을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 CCL 23 상피 세포 단층을 준비함으로써 달성됩니다. 24웰 플레이트에서 다음 슬로바르(slovar)와 폐렴구균(pneumococci)을 순차적으로 단층에 첨가하고 세포를 배양합니다.

마지막 단계에서는 웰을 세척하여 비부착성 박테리아를 제거합니다. CCL 23 상피 세포를 용해시키고 웰 내용물을 수확합니다. 궁극적으로, 폐렴구균 순응도에 대한 살리바리우스의 영향은 관련 폐렴구균의 수를 정량화하여 평가할 수 있습니다.

이 방법은 프로바이오틱스가 폐렴구균과 같은 박테리아 병원체의 부착을 억제할 수 있는지 여부와 같은 감염병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 방법에 대한 아이디어는 락토바실러스 최면, GG 및 기타 프로바이오틱스가 호흡기에서 사용될 수 있는 가능성을 조사하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생들에게 제인 매닝과 선이 될 것입니다 실험은 융합의 배양으로 나뉘기 전날에 23 상피 세포를 CCL하고, 그 후에 150, 멸균 50 밀리리터 관에 있는 밀리리터 농도 당 000의 세포에 Prewarm 매체에서 그(것)들을 희석합니다.

다음으로 처리된 24웰 조직 배양 플레이트에 웰당 1ml의 세포를 파종하고 밤새 세포를 배양합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 루프를 사용하여 각 박테리아 배양액의 10-12 개의 잘 분리 된 콜로니를 10 밀리리터의 토드 휴이트 육수와 0.5 %의 효모 추출물로 접종합니다. 실험 당일 14-16시간 동안 배양물을 잠시 소용돌이치고 배양합니다.

각 박테리아 배양물을 3-5초 동안 소용돌이친 다음 100마이크로리터의 폐렴구균과 100마이크로리터의 살리바리우스를 10밀리리터의 육수가 들어 있는 라벨링된 예열 튜브에 추가합니다. 접종된 튜브를 3-5초 동안 소용돌이치고 섭씨 37도에서 배양하여 배양물을 중간 로그 단계로 성장시킵니다. CCL 23 세포 배양의 80% 이상 유창성을 확인한 후, 전사 피펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거하고 세포 단층을 방해하지 않도록 플레이트를 약간 기울인 다음 약 500마이크로리터의 사전 예열 PBS를 추가하고 전사 피펫으로 액체를 부드럽게 제거하여 웰을 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 단층을 보존하는 데 도움이 되도록 세척하는 동안 플레이트를 기울이십시오. 각 웰에 500마이크로리터의 예열 배지를 추가하고 박테리아 배양을 준비하는 동안 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 먼저, absorbent 600에서 levarius 배양 1ml의 광학 밀도를 측정합니다.

그런 다음 Sal Levarius 배양액 5ml를 10ml 튜브로 옮기고 실온에서 1, 870Gs에서 4분 동안 튜브로 원심분리합니다. 스내트 Resus를 버린 후, 펠릿을 200-1000 마이크로 리터의 포인트 85 % 염화나트륨 판독 값에 따라 약 1.5 곱하기 10에서 밀리리터 당 9 번째 식민지 형성 단위의 최종 농도로 현탁시킵니다. 정확한 박테리아 수를 추가하는 것은 실험에서 가장 까다로운 부분인데, 추가된 박테리아의 실제 수는 다음 날 집락 계수가 수행될 때까지 결정되지 않기 때문입니다.

이제 재현탁된 타액 접종물을 high라고 표시된 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. 고농도를 1에서 10, 1에서 100으로 85% 염화나트륨으로 희석하여 희석 사이에 분석 와류 튜브에 대한 중간 및 저농도의 alvar를 만들어 헤파린 제어 웰을 생성합니다. 각 대조군 웰에서 40마이크로리터의 매체를 제거하고 50마이크로리터의 헤파린을 웰당 밀리리터당 100단위의 최종 농도에 추가합니다.

CCL 23 셀에만 10마이크로리터의 포인트, 85% 염화나트륨을 추가하고 CCL 23 셀과 폐렴구균만 모든 SIV 영역 농도를 완전히 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 희석되지 않은 1 개에서 10 개, 1에서 100 개의 다양한 농도를 적절한 웰에 첨가하여 세포와의 세균 접촉을 촉진합니다. 단층 판을 실온에서 114Gs로 3 분 동안 원심 분리 한 다음 세포가 배양하는 동안 한 시간 동안 플레이트를 배양하고, 타액 스톡을 85 % 염화나트륨 포인트로 희석하고, 멸균 스프레더를 사용하여 10에서 마이너스 5, 10에서 마이너스 6 및 10에서 마이너스 7 희석액을 말 혈액 한천 플레이트에 복제하여 분산시킵니다.

하룻밤 동안 거꾸로 된 위치로 플레이트를 배양하여 salvers incubation으로 단층의 끝을 향합니다. 폐렴구균 배양의 광학 밀도를 측정한 다음 1ml의 세포를 스핀다운합니다. Resus는 OD 판독값에 따라 300-2000 마이크로 리터의 포인트 85 % 염화나트륨에 펠릿을 현탁시켜 밀리리터 당 약 1 억 5 천만 콜로니 형성 단위의 최종 농도로 만듭니다.

그런 다음 음성 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 10마이크로리터의 희석되지 않은 폐렴구균을 추가하고 24웰 플레이트를 다시 원심분리한 다음 배양 단계에서 3시간 동안 공동 배양을 배양합니다. 폐렴구균 스톡을 살리바리우스와 유사한 방식으로 연속적으로 희석하고 플레이팅합니다. 3시간 동안 배양한 후 현미경으로 세포에 세포요법 효과가 있는지 확인합니다.

이제 각 웰에서 매체를 제거하고 하나의 XPBS로 공동 배양물을 세 번 부드럽게 세척하여 비부착 박테리아를 제거하고 단층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 7 분 동안 0.1 % Dig toin의 200 마이크로 리터와 5 % 이산화탄소로 셀을 lys. 다음으로 각각에 800마이크로리터의 THB를 추가합니다.

웰 위아래로 몇 번 피펫팅하고 각 웰의 세포 현탁액을 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브로 수확합니다. 마지막으로, 부착된 폐렴구균을 연속적으로 희석한 다음 다음 날 적절한 희석 플레이트에서 집락을 계산합니다. 이 표에서 폐렴구균과 알바를 정량화하기 위해, 슬로바르 첨가 1시간 후 CCL 23 세포에 폐렴구균을 첨가한 대표적인 실험의 결과를 보여줍니다.

폐렴구균 순응도는 생존 가능한 개수와 lit 모두에 의해 정량화되었습니다. A-Q-P-C-R 결과는 박테리아의 절대 수와 순응도 비율 모두에 대해 두 방법 간에 일치했습니다. 폐렴구균만을 함유하고 있는 웰에서 부착된 폐렴구균의 수로 정규화됨.

헤파린은 폐렴구균 순응을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에 대조군으로 사용됩니다. 따라서, 폐렴구균 단독요법에 비해 폐렴구균과 헤파린을 병용한 샘플에서 순응도가 약 40% 이상 감소한 것은 성공적인 분석법임을 나타냅니다. 타액은 용량 의존적 방식으로 폐렴구균 순응을 억제하기 때문에 1개의 폐렴구균에 약 10개의 타액 농도가 높은 타

이러한 이식편은 살리바리우스를 첨가할 때, 폐렴구균 동시 투여 1시간 전 또는 폐렴구균 1시간 후에 폐렴구균이 CCL 23 세포에 순응하는 것을 보여줍니다. Alvar는 폐렴구균 투여 전에 첨가할 때 폐렴구균 순응도를 억제하는 데 더 효과적인데, 이는 Alvar의 고용량 및 중용량 모두 사전 에디션 분석에서 폐렴구균 순응도를 유의하게 감소시켰기 때문입니다. Coit 판과 사후 판 분석은 고용량의 Slovar만이 폐렴구균 순응을 억제했습니다.

따라서 이 동영상을 시청한 후에는 프로바이오틱스 연쇄상구균 세포 영역에 의한 폐렴구균 부착 억제를 측정하기 위해 체외 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.