K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

본 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내 막 단백질의 확산 계수를 측정하는 것입니다. 이는 우선 GFP 태그 단백질을 발현하는 세포를 배양한 다음, 초점을 세포막에 맞춘 회전 디스크 현미경(spinning disc microscope)으로 타임랩스 이미지 시퀀스를 획득함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이미지 스택에서 막이 평평하고 이동하는 소기관이 없는 영역을 잘라내어 선택하는 것입니다.

다음으로, 케이스 기반 이미지 상관 분광법(case-based image correlation spectroscopy) 소프트웨어를 사용하여 크롭된 영역을 분석합니다. 마지막 단계는 Excel에서 확산 도표의 평균을 내는 것입니다. 결과적으로, kicks와 결합된 살아있는 세포 현미경 분석을 통해 막 단백질의 확산 계수를 측정합니다.

이 방법은 다양한 조건에서 막 단백질의 확산 계수를 구하는 것과 같이 막 생물물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. kicks 코드를 처음 사용할 때는 MATLAB을 열고 파일(file)을 클릭하십시오. 그런 다음 경로 설정(set path)을 선택하고, 하위 폴더 포함 추가(add with sub folders)를 클릭하여 컴퓨터에서 kicks 코드가 위치한 폴더를 찾으십시오.

확인을 클릭하십시오. 획득 과정 중 MATLAB을 저장하고 닫기 전에, 이미징이 진행되는 동안 막의 초점을 계속해서 유지하는 것이 중요합니다. 형광이 균일하게 분포된 막의 평평한 부분에서 직사각형 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.

움직이는 세포 소기관과 돌출된 막 영역은 제외하십시오. K squared 플롯의 충분한 통계적 유의성을 확보할 수 있도록 크롭 크기를 선택합니다. 해당 영역을 크롭하여 tiff 파일로 저장하십시오.

적절한 폴더에 파일을 저장하십시오. 동일한 영상에서 추출한 크롭(crop) 이미지가 여러 개인 경우, stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif 등과 같이 숫자를 증가시켜 파일 이름을 지정하십시오. 분석을 수행하려면 먼저 MATLAB을 실행하고 명령 창에 ICS gooey를 입력한 후 Enter 키를 눌러 ICS를 실행하십시오.

GUI는 ICS Gooey의 이미지 상관 분광법 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램의 실행 파일 이름입니다. kicks 탭을 클릭하십시오. MATLAB code라는 폴더 이름의 폴더를 찾으십시오.

파일 이름이 scripts인 파일로 스크롤하여 더블 클릭으로 엽니다. 이 파일은 에디터라고 합니다. 에디터에서.

스크롤하여 kicks 데이터 세트를 로드하십시오. 그런 다음 파일 이름과 폴더 위치를 복사하거나 명령줄에 입력하십시오. 명령줄 아래의 폴더 위치입니다.

분석할 프레임 수를 설정하십시오. 데이터 시리즈 내의 모든 연속된 동영상에 동일한 설정을 사용하십시오. 이후 프레임에서 초점 드리프트(focus drift)가 발생하는 경우.

이들은 에디터의 분석에서 제외되어야 합니다. 저장(save)을 클릭한 다음, 평가(evaluate)를 클릭하십시오. 이제 셀 데이터셋이 GUI의 분석 창에 있는 분석 소프트웨어로 로드되었습니다.

먼저 T-cell 체크박스의 선택을 해제하여 분석 설정을 입력하십시오. 그런 다음 분석할 타임랙(timelag) 수를 입력하십시오. 최대 K squared 값을 입력하십시오.

초기 값은 보통 20에서 50 사이입니다. 최적의 값이 결정될 때까지 분석을 반복해야 하며, 이후 데이터 시리즈의 모든 후속 영화에 해당 설정을 적용해야 합니다. 선택한 설정이 적절한 케이스 제곱 플롯(case square plots)과 선형 확산 플롯(linear diffusion plot)으로 입증되는 것과 같이 데이터에 잘 부합하는지 항상 확인하십시오.

다음으로, store settings를 클릭하고 진행합니다. 그다음 yes를 클릭하여 모든 그래프를 표시합니다. load image series를 클릭한 후 workspace를 클릭합니다.

작업 영역에서 가져오기를 클릭하기 전에 이미지 시리즈 크롭을 선택하십시오. 이제 픽셀 크기 상자에 이미징 시스템 수집 설정을 입력하십시오. 이미지 스택이 획득된 이미징 시스템의 투영 픽셀 크기를 입력하십시오.

ROI 선택을 클릭하고 하나를 입력하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하고 전체 이미지를 사용하십시오. 킥 분석 수행을 클릭하고 예 를 클릭하여 부동 필터링을 수행하십시오.

결과는 이미지 형태로 자동적으로 열립니다. 설정 창, 세포 정보 창, 그리고 다이내믹스 창 내의 광물리학 창을 최소화하십시오. 다이내믹스 플롯이 데이터의 선형 피팅을 통해 음의 기울기와 일치하는지 확인하십시오. 이는 데이터 포인트들이 상관관계를 가지며 자유 확산(free diffusion)으로 가정할 수 있음을 의미합니다.

특정 시간 지연(time lag) 및 K squared 설정에 대한 확산 계수를 기록하십시오. K squared 플롯의 데이터 포인트들은 지정된 시간 라인 주변에 밀집되어 있어야 합니다. Lags 체크 박스를 선택하고, 'save open figures as images'를 클릭하여 결과 파일을 이미지로 저장하십시오.

새 폴더에 저장한 다음, 현재 데이터 지우기(clear current data)를 클릭하고 다음 작물의 분석을 계속하십시오. 이전에 설정한 작물 이름을 사용하여 각 ROI의 개별 확산 계수를 스프레드시트에 입력하고, 시간 지연(time lag) 횟수와 K 제곱 값을 반드시 기록하십시오. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 평균 확산 계수와 표준 편차를 계산하십시오.

통계적 차이를 평가하기 위해 MOV Smirnoff 검정 또는 student's T-test를 수행합니다. 5% 유의 수준을 사용하여 세포 간의 정량적 비교를 수행할 수 있습니다. 확산 도표의 스프레드시트 버전은 분석 소프트웨어에 의해 각 작물별로 생성되었으며, 각 시간 지연(time lag)에 따른 조건별 데이터를 평균화한 것입니다.

논문이나 발표 자료에 사용할 새로운 평균 확산 도표를 생성하십시오. 여기 제시된 결과는 EGFP가 표지된 Aquaporin 3의 타임랩스 이미지 시퀀스입니다. 이는 스피닝 디스크 현미경을 사용하여 세포막에 초점을 맞추어 촬영한 신장 상피 세포인 생체 내 MDCK 세포의 이미지입니다.

여기에 세포 이미지와 함께 선택할 크롭 영역을 사각형으로 표시한 예시 ROI 크롭 이미지가 제시되어 있습니다. 2차원 확산만을 시각화하기 위해 막이 균일하고 평평한 세포 주변부에서 크롭하는 것이 중요합니다. 세포 소기관, 소포 및 막 돌출부는 피해야 하며, 분석을 위해 타임랩스 동안 드리프트가 발생하지 않는 것이 중요합니다.

이 대표적인 크롭(crop)은 이동하는 소포가 있어 확산 계수에 영향을 줄 수 있으므로 분석 및 킥(kicks) 단계에서 제외되었습니다. 막에 구멍이 있어 제외된 또 다른 크롭의 예가 여기에 표시되어 있습니다. 킥을 통해 생성된 한 가지 크롭의 확산 플롯이 여기에 제시되어 있습니다.

이 방법은 형광 단백질, 염료 또는 양자점으로 표지된 단백질의 확산 계수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 확산 플롯 곡선의 기울기는 단순히 확산 계수의 음수 값입니다. 여기에서 EGFP로 표지된 Aquaporin 3의 예로 제시된 계산된 확산 플롯에는 타임 랙(time lag)이 너무 많습니다. 이 경우, 확산 플롯이 선형이 되도록 타임 랙 수를 줄여 분석을 다시 수행하였습니다.

전형적인 케이스 제곱 플롯(case squared plot)이 여기에 제시되어 있습니다. 이는 해당 K 제곱 플롯들에서 선택된 시간 지연(time lag)에 대한 방사형 평균 및 로그 변환된 상관 곡선입니다. 기울기를 시간 지연에 대해 플롯하면 앞서 보여준 확산 플롯(diffusion plot) 결과가 나타납니다.

K squared 플롯을 검사할 때, 해당 K squared 플롯으로부터 피팅 상태를 평가하는 것이 중요합니다. 기울기가 음수여야 하며 노이즈 플로어(noise floor)까지 선형적으로 감쇠해야 하므로, 크롭(crop) 영역이 너무 작아 분석이 불가능하다는 결론을 내릴 수 있습니다. 더 큰 K squared 값에서 잔차가 증가함에 따라 피팅 상태가 더 이상 좋지 않다고 판단되므로, 최대 K squared 값을 낮추어 이 K squared 플롯을 재분석해야 합니다.

이 경우, 더 낮은 최대 K 제곱 값을 입력하여 분석을 다시 실행해야 합니다. 여기에는 10개의 크롭(crop)에 대해 평균을 낸 평균 확산 도표가 표시되어 있습니다. 확산 도표는 분석 결과인 Excel 파일에서 확인되었으며, 이를 통해 도출되었습니다.

AQUAPORIN 3 EGFP 확산 계수는 다음 절차에 따라 계산됩니다. 약물 처리 후 확산 계수가 변화하는지, 그리고 막 내의 지질 환경이나 단백질-단백질 상호작용에 변화가 생겼을 가능성이 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 다양한 약물을 첨가한 후 막 단백질의 확산 계수를 측정하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.