Name: K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 배우세요 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수를 k-공간 이미지 상관 분광학(kICS)으로 측정하는 방법을. 생세포 현미경을 활용한 이 기법은 막 단백질 역학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 LNN에 룬드 벡 주니어 그룹 리더 원정대에 의해 지원되었다. PWW는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)의 보조금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 디스크 현미경을 회전에 액세스 남부 덴마크 대학에서 덴마크 분자 바이오 이미징 센터 감사합니다.

KICS 분석 세포막에서 EGFP-태그 된 단백질의 취득은 표면 형광 현미경 TIRF 설정 또는 그 막의 이미지를 얻기위한 설정 회전 디스크 현미경에서 수행 될 수있다. 영상 프레임 간의 카메라 화소 크기뿐만 아니라 시간은 분석을 위해 필요하다. 4-30 Hz의 프레임 속도 100-1,200 프레임 이미지 시퀀스가​​ 분석을 위해 사용될 수있다. 획득 동안, 영상의 재생 시간에 걸쳐 초점 멤브레인을 유지하고 형광이 균일하게 분포되는 평막의 일부분에 집중하는 것이 중요하다. , 소포 이동 막 지역 및 세포 소기관을 돌출하는 것은 나중에 분석 과정에서 잘릴 수 있습니다. 셀의 제공된 드리프트 나 움직임이 없도록 획득 시간이 선택되어야한다. MATLAB에 대한 한국 통신 학회 코드 스크립트를 얻으려면, 폴 현자 문의 (Paul.Wiseman @ McGill.ca). 첫 번째 시간은 한국 통신 학회 코드는 오픈 MAT에게 사용LAB 및 파일을 클릭 한 다음 설정 경로, 다음 하위 폴더 추가를 클릭하고 KICS 코드가있는 컴퓨터의 폴더를 찾을 수 있습니다. 그런 다음 확인을 클릭 저장 부근에 있습니다. 이제 다음의 점에 설명 된 작물의 분석을 계속합니다. 1. TIFF 스택으로 영상 분석 프로그램에 관심있는 이미지 시퀀스 가져 오기 stack1.tif : 이름으로 파일을 저장합니다. <ol><li> 막 움직이는 세포의 세포 기관을 제외하고 막 영역을 돌출의 평평한 부분에 관심 (ROI)의 사각형 영역을 선택합니다. 충분한 통계가 좋은 K 2 플롯에 대해 생성되도록 작물의 크기가 선택됩니다. </li><li> 지역 자르기 및 해당 폴더에 TIFF 파일로 작물을 저장합니다. 같은 영화에서 여러 가지 작물이있는 경우, 예를 들면 &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif를&quot;숫자 증가를 사용합니다. </li><li> 로컬 작물이 들어있는 폴더를 배치컴퓨터가 아닌 서버에서, 한국 통신 학회의 분석을하고있다. </li></ol> 2. 분석을 수행 할 하나 분석 소프트웨어 하나에 작물을 가져 <ol><li> 명령 창을 눌러 열려 MATLAB 및 유형 &quot;icsgui은&quot;을 입력합니다. ICS는 GUI 화상 상관 분광법 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램을위한 실행 파일 이름이다. </li><li> ICS의 GUI에서 &quot;한국 통신 학회&quot;탭을 클릭합니다. 분석 윈도우의 스크린 샷은도 1에 도시된다. </li><li> 폴더 이름 &quot;MATLAB 코드로&quot;폴더를 찾아 파일 이름을 &quot;스크립트&quot;로 파일을 이동하고 그것을 더블 클릭하여 엽니 다. 또한, 파일을 마우스 오른쪽 클릭하고 &quot;MATLAB으로 열기&quot;또는 파일로 이동, MATLAB에서 열고 스크립트 파일을 열기를 선택합니다. 이 파일은 편집기라고합니다. </li><li> 편집기 스크롤 &quot;로드 KICS 데이터 세트&quot;에, 다음 명령 행에 복사 또는 형식 파일 이름과 폴더 위치에서 시작IMG = 예 &quot;: 사용자 문서 AQP3dynamics stack1crop.tif C&quot;와. 예를 들어, [1:500] - 폴더 위치 아래의 명령 행에서 분석 할 프레임 수를 설정합니다. 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 포커스 드리프트하기의 범위 내에있는 경우, 이들 분석에서 제외한다. </li><li> 편집기에서 &#39;저장&#39;을 클릭 한 다음 &quot;셀을 평가&quot;를 클릭합니다. 데이터 집합은 이제 분석 소프트웨어에에로드됩니다. </li><li> GUI에서 한국 통신 학회 분석 창에서 분석을위한 설정을 입력합니다 : <ol><li> &quot;T 세포&quot;상자를 지 웁니다. </li><li> 입력 시간의 수는 분석 될 떨어진다. 타임 래그 (τ)의 수는 확산 플롯에 영향을 미칠 것이며, 확산 플롯 선형이되도록 선택되어야한다. 25을 입력 시작하고 확산 음모 선형 곳으로 감소. τ는 수이다 KICS 분석를 비교 타임 래그와 시간 차이는 시간 B이며etween 한 프레임과 다음. 선형 플롯을주는 작은 값을 선택해야합니다. 시간의 최대 수는 선형 피팅은 높은 값이 끼워 줄 수없는 데이터를 생성 할 것이다 가리지 얻어 지도록 선택된다 떨어진다. </li><li> 최대 K 2 값을 입력합니다 (그림 1 원 1 참조), 일반적으로 20 ~ 50입니다. 좋은 K 2 플롯 라인을 따라 분포되어 많은 데이터 포인트가되는 플롯이다. (70)를 입력 시작하고 K 2 및 확산 음모를 평가 한 후 감소와 가장 낮은 값을 선택 곳 직선 주위의 데이터 포인트 클러스터. 이 K 값은 푸리에 공간에서 공간적 K-벡터의 크기의 제곱이다. 좋은 K 2 플롯 : 초기 분석은 최고의 가치가 결정 될 때까지, 다음 선택한 설정이 데이터에 잘 맞는을주고 있는지 확인 항상 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용하지만 반복해야합니다및 선형 확산 플롯. </li><li> &quot;저장 설정을 계속 진행&quot;을 클릭합니다. </li><li> 모든 그래프를 표시하기 위해 &quot;예&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;로드 이미지 시리즈&quot;(그림 1의 원 2 참조)을 클릭 한 후 &quot;작업 공간&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;imgSerCrop&quot;를 선택한 다음 &quot;작업 영역에서 가져 오기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 촬상 시스템 모음 설정을 입력하세요. 박스 &quot;화소 사이즈」화상 스택을 취득하는 촬상 시스템의 투영 화소의 크기를 입력한다. AQP3-EGFP를 들어, 0.111 사용 하였다. 상자 &quot;프레임 사이의 시간 (초)을 입력합니다&quot;에서 0.1150는 AQP3-EGFP를 사용 하였다. </li><li> &quot;1&quot;, 확인을 클릭하고 &quot;전체 이미지를 사용하여&quot;입력 &quot;의 ROI를 선택&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;할 일 한국 통신 학회 분석&quot;을 클릭하고 &quot;움직 필터링&quot;을 수행하는 예를 클릭합니다. 결과는 이미지로 자동으로 열립니다. </li><li> 설정 창을 최소화, 셀 정보 진열창을 최소화w 및 광 물리학 창을 최소화한다. 역학 창에서 역학 플롯은 데이터 포인트의 상관 관계 무료 확산 간주 될 수 있음을 의미하는 음의 기울기를 가진 라인에 데이터의 선형 적합을 표시되는지 확인합니다. 특정 시간 지연에 대한 확산 계수를 기록하고이 설정을 (그것의 적당한 표준 편차에주의 할 필요가 없다) K. K 2 그래프의 데이터 포인트는 떨어진다 주어진 시간 동안 라인 주위에 클러스터해야합니다. </li><li> 진드기 상자 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 한 후 결과 파일을 저장하려면 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 클릭합니다. C 아래에 새 폴더에 저장 : 사용자 문서 AQP3diffusion을 . &quot;분명 현재의 데이터&quot;를 클릭하고 다음 작물의 분석을 계속합니다. </li></ol></li></ol> 계산 된 확산 계수 3. 평균은 분석 데이터의 개요를 계산한다 <ol><li> spre의 각 투자 수익 (ROI)에서 각각의 확산 계수를 입력adsheet (τ를 기록하고 2 값을 K해야합니다), 위의 설정과 작물의 이름을 사용합니다. </li><li> 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 확산 계수의 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 또는 학생 5 %의 유의 수준을 사용하여 통계적인 차이를 평가하는 t-검정을 수행합니다. 세포 (예를 들어 nontreated 대 처리) 사이 Quantitave 비교는 할 수있다. </li><li> 각각의 작물에 대해 분석 소프트웨어에 의해 생성하고, 각각의 타임 래그의 각 조건에 대해 데이터를 평균 하였다 확산 플롯의 스프레드 시트의 버전을 연다. 논문이나 프리젠 테이션을 표시하기위한 새로운 평균 확산 음모를 생성합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 논문은 형광 단백질 태그로 단백질의 현미경 화상으로부터 확산 계수를 결정하기 위하여 통신 학회 분석 방법을 적용하는 방법의 상세한 단계별 개요를 제시했다. 분석 라벨링 밀도 매우 광범위한 동적 범위를 가진 프로브 선택 독립적이며, 따라서 또한 양자점뿐만 아니라 염료 등 EGFP 같은 형광 단백질로 표지 단백질에 적용될 수있다. 단백질 유효 확산 계수를 계산하기 위해 최적화 된 몇몇 중요한 단계가있다. 만 막에 이미지를 표시 단백질에 필수적이다. 분석 할 이미지 시퀀스에서 소포 또는 세포 내 소기관으로 이동 같은 추가 오브젝트가있는 경우, 이러한 확산 계수의 과소 또는 과대 평가를 초래 계산 된 확산 계수에 기여한다. 위에 나열된 단계에 따라, 한국 통신 학회의 GUI 코드는 사용자 친화적입니다차 분석은 빠르다. 확산 계수의 평균과 유의 한 값의 신속한 생성을 용이 래그 타임의 함수로서 원형 평균화 및 슬로프 확산 플롯의 ...

세포막 단백질의 사 차원 시공간 조직 횡 이동성 단단히 규제 및 단백질 기능, 활성 및 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 할 수있다. 세포막 단백질의 측면 확산은, 전통적으로 양자점의 저속 촬상로부터 단일 입자의 확산 계수를 산출하거나 표시된 세포막 단백질 2-4 염색에 의해 연구되었다. 이 방법은 단백질 폴딩과 기능을 손상시킬 수 있으므로, 일부 단백질을 얻을 수없는 양자점 나 염료 라벨링 세포막 단백질의 세포 외 태그의 삽입을 필요로한다. 양자점의 입체 볼륨은 단백질 5의 확산 속도를 느리게하고, 또한, 인구의 단백질의 단지 작은 부분이 양자 도트로 표시되어 보여왔다,이 분수는 총 대표적인 경우는 알려져 있지 않다 세포막 단백질의 풀. 단일 입자 TRA양자점 표지 단백질의 이미지 시리즈에서 확산 계수의 요리하는 (SPT) 측정 매핑 두 차원 가우스와 함께 입자의 이미지가 피크 위치 광범위한 분석 알고리즘 다음에 적합하다을 포함한다. 분석 기술 입자 궤적에 현미경 점 분포 함수 (전형적 이차원 공간 가우시안) 및 입자 위치의 후속 링크의 근사치에 경과 시퀀스의 각 화상 프레임에 피팅 유용한 비 - 선형 곡선을 필요 계산적 매우 집약적 단일 분자 6,7의 움직임. 최근에 개발 된 이미지 상관 기법은 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)는 찬란 세포막 단백질을 태그 확산 계수의 상대적으로 간단한 측정을 가능하게한다. 일상적 KICS 의해 형광 단백질로 표지 막 단백질의 확산 계수를 계산하는 가능성 보유 고유 도구전통적인 양자에 비해 여러 장점이 SPT 분석 점 : 세포 라벨링 소모 세포 태그와 시간의 삽입은 없음 (형광 단백질을 발현하는 세포주가 사용될 수있다) 요구되지 않는다; 확산 계수는 양자 점으로 표시된 부분 집합에 비해 형광 단백질의 전체 풀에서 추출된다; 분석은 단일 단백질을 추적 할 필요없이 간단하고, 분석은 추가적인 사용자 프로그래밍 대한 요구와 함께 기존의 코드를 사용하여 수행 될 수있다. 는 확산 계수의 고속 연산 및 계산을 가능하게 평균화 기법이므로 방법은 빠르다. 단백질 인구 이러한 급속한 확산 측정 근면 SPT 방법으로 인구의 서브 세트에 대해 얻은 분자량보다 상세한 교통 정보를 보완. KICS 시간 먼저 푸리에 공간으로 변환 된 형광 현미경 이미지 시퀀스의 상관 관계를, 이에 플로리다를 분리분자 수송 1에 의한 것과 광 물리학에 의한 uorescence 변동. 결과적으로, 통신 학회는 수밀도를 결정 속도를 흐르게하고, 복잡한 광표백 의해 공정한 지거나, 형광의 점멸 중에 확산의 형광 분자를 표지 할 수있다. 이것은 통신 학회 신속 정의 기입 알고리즘 없이도 형광 표지 된 세포 막 단백질의 확산 동성을 결정하기위한 유용한 도구를 만든다. 게다가 형광 표지 된 단백질은 KICS 또한 양자점 표지 된 막 단백질 (8)에 적용될 수있다. 이 문서는 코드와 방법에 생성 된 플롯을 평가하는 방법을 사용하는 방법, 작물을 배치하는 방법을 보여줌으로써 EGFP-태그 세포막 단백질의 확산 계수를 추출하기 위해 한국 통신 학회를 사용하는 방법을 단계별로 소개를 제공하는 확산에서 계수가 추출된다. 예로서, 반 내부 전반사에 디스크 현미경 세트를 회전하여 얻어진 데이터는 형광EGFP 태그 신장 물 채널 단백질 아쿠아 포린 -3 (AQP3)의 후부 (TIRF) 모드가 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp; region=DK">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free medium</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp; region=DK">D8418 </A></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 현미경</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

k-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 egfp-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

측면 확산과 세포막 단백질의 구획화 단단히 세포에서 조절되고, 따라서, 이러한 프로세스를 연구하는 세포막 단백질 기능 및 규제에 새로운 통찰력을 밝힐 것이다. 최근 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS) (1)는 직접 프로브 광 물리학에 의해 도입 된 체계적인 편견을 피할 찬란 태그 세포막 단백질의 이미지에서 확산 계수의 일상적인 측정을 가능하게하기 위해 개발되었다. 분석을위한 이론적 근거는 복잡하지만,이 방법은 단백질의 확산 계수를 측정하기 위해 개방 코드를 사용 비전문가에 의해 구현 될 수있다. 한국 통신 학회는 상호 (K-) 공간에 각 이미지의 푸리에 변환 한 후 형광 현미경 이미지 스택에서 시간 상관 함수를 계산합니다. 이어서, 원형 평균화, 자연 대수는 변환 및 선형 산출 상관 함수에 확산 계수를 적합하다. 이논문은 한국 통신 학회를 통한 이미지 분석 및 확산 계수의 측정에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 먼저, 형광 표지 된 세포막 단백질의 높은 프레임 레이트 콘텐츠의 시퀀스는 형광 현미경을 이용하여 획득된다. 그런 다음, 관심 (ROI) 막 영역을, 세포 내 소기관을 피하고 소포를 이동하거나 돌출의 영역이 선택됩니다. 투자 수익 (ROI) 스택은 자유롭게 사용할 코드로 가져 여러 정의 된 매개 변수 (방법 섹션을 참조하십시오) 한국 통신 학회 분석을 위해 설정됩니다. 프로그램은 K-시공간 상관 함수에서 플롯 &quot;슬로프의 기울기&quot;이 발생하고, 확산 계수는 플롯의 기울기로부터 계산된다. 아래 정식 예로 EGFP 태그로 신장 수로 아쿠아 포린 -3 이용한 세포막 단백질의 확산 계수를 측정하는 단계별 KICS 절차이다.

KICS로 분석하기에 적합한 화상 스택을 획득하기 위해, 다른 현미경 시스템이 사용될 수있다. 그것은 에피 형광 현미경 등 TIRF 또는 스피닝 디스크 설정으로부터 이미지 시퀀스를 분석하는 것이 가능하다. 막 어떤 큰 움직이는 세포 소기관없이 또는 소포 / 움직이는 물체 평면해야합니다. 이 논문은 23.4 ㎐의 프레임 속도 원형질막으로 설정된 초점 회전 디스크 현미경에 결상 라이브 MDCK 세포에서 EGFP 태그 AQP3의 시간 경과 이미지 시퀀스를 나타낸다. 포커스는 기저 (바닥) 원형질막으로 설정 하였다. 데이터는 최근 AJP 셀 (13)에 게시되었습니다. 도 2A는 셀의 이미지를 나타낸다. scalebar는 10mm이며, 예를 들어 ROI 작물은 사각형으로 표시됩니다. 작물의 선택을위한 그것 막이 균일하고 평평한 이렇게 단지 이차원 확산이 가시화되어있다 셀의 주변부에 잘라내는 것이 중요하다. CELL 소기관, 소포 및 막...

이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

본 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내 막 단백질의 확산 계수를 측정하는 것입니다. 이는 우선 GFP 태그 단백질을 발현하는 세포를 배양한 다음, 초점을 세포막에 맞춘 회전 디스크 현미경(spinning disc microscope)으로 타임랩스 이미지 시퀀스를 획득함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이미지 스택에서 막이 평평하고 이동하는 소기관이 없는 영역을 잘라내어 선택하는 것입니다.다음으로, 케이스 기반 이미지 상관 분광법(case-based image correlation spectroscopy) 소프트웨어를 사용하여 크롭된 영역을 분석합니다. 마지막 단계는 Excel에서 확산 도표의 평균을 내는 것입니다. 결과적으로, kicks와 결합된 살아있는 세포 현미경 분석을 통해 막 단백질의 확산 계수를 측정합니다.이 방법은 다양한 조건에서 막 단백질의 확산 계수를 구하는 것과 같이 막 생물물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. kicks 코드를 처음 사용할 때는 MATLAB을 열고 파일(file)을 클릭하십시오. 그런 다음 경로 설정(set path)을 선택하고, 하위 폴더 포함 추가(add with sub folders)를 클릭하여 컴퓨터에서 kicks 코드가 위치한 폴더를 찾으십시오.확인을 클릭하십시오. 획득 과정 중 MATLAB을 저장하고 닫기 전에, 이미징이 진행되는 동안 막의 초점을 계속해서 유지하는 것이 중요합니다. 형광이 균일하게 분포된 막의 평평한 부분에서 직사각형 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.움직이는 세포 소기관과 돌출된 막 영역은 제외하십시오. K squared 플롯의 충분한 통계적 유의성을 확보할 수 있도록 크롭 크기를 선택합니다. 해당 영역을 크롭하여 tiff 파일로 저장하십시오.적절한 폴더에 파일을 저장하십시오. 동일한 영상에서 추출한 크롭(crop) 이미지가 여러 개인 경우, stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif 등과 같이 숫자를 증가시켜 파일 이름을 지정하십시오. 분석을 수행하려면 먼저 MATLAB을 실행하고 명령 창에 ICS gooey를 입력한 후 Enter 키를 눌러 ICS를 실행하십시오.GUI는 ICS Gooey의 이미지 상관 분광법 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램의 실행 파일 이름입니다. kicks 탭을 클릭하십시오. MATLAB code라는 폴더 이름의 폴더를 찾으십시오.파일 이름이 scripts인 파일로 스크롤하여 더블 클릭으로 엽니다. 이 파일은 에디터라고 합니다. 에디터에서.스크롤하여 kicks 데이터 세트를 로드하십시오. 그런 다음 파일 이름과 폴더 위치를 복사하거나 명령줄에 입력하십시오. 명령줄 아래의 폴더 위치입니다.분석할 프레임 수를 설정하십시오. 데이터 시리즈 내의 모든 연속된 동영상에 동일한 설정을 사용하십시오. 이후 프레임에서 초점 드리프트(focus drift)가 발생하는 경우.이들은 에디터의 분석에서 제외되어야 합니다. 저장(save)을 클릭한 다음, 평가(evaluate)를 클릭하십시오. 이제 셀 데이터셋이 GUI의 분석 창에 있는 분석 소프트웨어로 로드되었습니다.먼저 T-cell 체크박스의 선택을 해제하여 분석 설정을 입력하십시오. 그런 다음 분석할 타임랙(timelag) 수를 입력하십시오. 최대 K squared 값을 입력하십시오.초기 값은 보통 20에서 50 사이입니다. 최적의 값이 결정될 때까지 분석을 반복해야 하며, 이후 데이터 시리즈의 모든 후속 영화에 해당 설정을 적용해야 합니다. 선택한 설정이 적절한 케이스 제곱 플롯(case square plots)과 선형 확산 플롯(linear diffusion plot)으로 입증되는 것과 같이 데이터에 잘 부합하는지 항상 확인하십시오.다음으로, store settings를 클릭하고 진행합니다. 그다음 yes를 클릭하여 모든 그래프를 표시합니다. load image series를 클릭한 후 workspace를 클릭합니다.작업 영역에서 가져오기를 클릭하기 전에 이미지 시리즈 크롭을 선택하십시오. 이제 픽셀 크기 상자에 이미징 시스템 수집 설정을 입력하십시오. 이미지 스택이 획득된 이미징 시스템의 투영 픽셀 크기를 입력하십시오.ROI 선택을 클릭하고 하나를 입력하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하고 전체 이미지를 사용하십시오. 킥 분석 수행을 클릭하고 예 를 클릭하여 부동 필터링을 수행하십시오.결과는 이미지 형태로 자동적으로 열립니다. 설정 창, 세포 정보 창, 그리고 다이내믹스 창 내의 광물리학 창을 최소화하십시오. 다이내믹스 플롯이 데이터의 선형 피팅을 통해 음의 기울기와 일치하는지 확인하십시오. 이는 데이터 포인트들이 상관관계를 가지며 자유 확산(free diffusion)으로 가정할 수 있음을 의미합니다.특정 시간 지연(time lag) 및 K squared 설정에 대한 확산 계수를 기록하십시오. K squared 플롯의 데이터 포인트들은 지정된 시간 라인 주변에 밀집되어 있어야 합니다. Lags 체크 박스를 선택하고, 'save open figures as images'를 클릭하여 결과 파일을 이미지로 저장하십시오.새 폴더에 저장한 다음, 현재 데이터 지우기(clear current data)를 클릭하고 다음 작물의 분석을 계속하십시오. 이전에 설정한 작물 이름을 사용하여 각 ROI의 개별 확산 계수를 스프레드시트에 입력하고, 시간 지연(time lag) 횟수와 K 제곱 값을 반드시 기록하십시오. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 평균 확산 계수와 표준 편차를 계산하십시오.통계적 차이를 평가하기 위해 MOV Smirnoff 검정 또는 student's T-test를 수행합니다. 5% 유의 수준을 사용하여 세포 간의 정량적 비교를 수행할 수 있습니다. 확산 도표의 스프레드시트 버전은 분석 소프트웨어에 의해 각 작물별로 생성되었으며, 각 시간 지연(time lag)에 따른 조건별 데이터를 평균화한 것입니다.논문이나 발표 자료에 사용할 새로운 평균 확산 도표를 생성하십시오. 여기 제시된 결과는 EGFP가 표지된 Aquaporin 3의 타임랩스 이미지 시퀀스입니다. 이는 스피닝 디스크 현미경을 사용하여 세포막에 초점을 맞추어 촬영한 신장 상피 세포인 생체 내 MDCK 세포의 이미지입니다.여기에 세포 이미지와 함께 선택할 크롭 영역을 사각형으로 표시한 예시 ROI 크롭 이미지가 제시되어 있습니다. 2차원 확산만을 시각화하기 위해 막이 균일하고 평평한 세포 주변부에서 크롭하는 것이 중요합니다. 세포 소기관, 소포 및 막 돌출부는 피해야 하며, 분석을 위해 타임랩스 동안 드리프트가 발생하지 않는 것이 중요합니다.이 대표적인 크롭(crop)은 이동하는 소포가 있어 확산 계수에 영향을 줄 수 있으므로 분석 및 킥(kicks) 단계에서 제외되었습니다. 막에 구멍이 있어 제외된 또 다른 크롭의 예가 여기에 표시되어 있습니다. 킥을 통해 생성된 한 가지 크롭의 확산 플롯이 여기에 제시되어 있습니다.이 방법은 형광 단백질, 염료 또는 양자점으로 표지된 단백질의 확산 계수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 확산 플롯 곡선의 기울기는 단순히 확산 계수의 음수 값입니다. 여기에서 EGFP로 표지된 Aquaporin 3의 예로 제시된 계산된 확산 플롯에는 타임 랙(time lag)이 너무 많습니다. 이 경우, 확산 플롯이 선형이 되도록 타임 랙 수를 줄여 분석을 다시 수행하였습니다.전형적인 케이스 제곱 플롯(case squared plot)이 여기에 제시되어 있습니다. 이는 해당 K 제곱 플롯들에서 선택된 시간 지연(time lag)에 대한 방사형 평균 및 로그 변환된 상관 곡선입니다. 기울기를 시간 지연에 대해 플롯하면 앞서 보여준 확산 플롯(diffusion plot) 결과가 나타납니다.K squared 플롯을 검사할 때, 해당 K squared 플롯으로부터 피팅 상태를 평가하는 것이 중요합니다. 기울기가 음수여야 하며 노이즈 플로어(noise floor)까지 선형적으로 감쇠해야 하므로, 크롭(crop) 영역이 너무 작아 분석이 불가능하다는 결론을 내릴 수 있습니다. 더 큰 K squared 값에서 잔차가 증가함에 따라 피팅 상태가 더 이상 좋지 않다고 판단되므로, 최대 K squared 값을 낮추어 이 K squared 플롯을 재분석해야 합니다.이 경우, 더 낮은 최대 K 제곱 값을 입력하여 분석을 다시 실행해야 합니다. 여기에는 10개의 크롭(crop)에 대해 평균을 낸 평균 확산 도표가 표시되어 있습니다. 확산 도표는 분석 결과인 Excel 파일에서 확인되었으며, 이를 통해 도출되었습니다.AQUAPORIN 3 EGFP 확산 계수는 다음 절차에 따라 계산됩니다. 약물 처리 후 확산 계수가 변화하는지, 그리고 막 내의 지질 환경이나 단백질-단백질 상호작용에 변화가 생겼을 가능성이 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 다양한 약물을 첨가한 후 막 단백질의 확산 계수를 측정하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

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여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

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우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

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이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.

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