문화를 셀에 충격파 응용 프로그램

본 절차의 전반적인 목적은 in vitro 충격파 처리 중 방해되는 물리적 효과를 배제하여 재현 가능한 결과를 얻는 것입니다. 이는 먼저 세포 배양 플라스크를 배양 배지로 완전히 채운 후, 플라스크를 가열된 워터배스에 넣음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 어플리케이터를 워터배스에 결합할 때 초음파 젤을 충분한 양으로 사용하는 것입니다.

다음으로, 어플리케이터를 워터배스 막에 수평으로 밀착시킵니다. 마지막 단계는 세포가 파동의 초점 내에 위치하도록 충격파 발생원을 세포 배양 플라스크의 중심과 일직선이 되게 맞추는 것입니다. 최종적으로, 실시간 PCR과 사이토카인 어레이를 사용하여 분석을 수행함으로써 관심 유전자와 사이토카인의 변화를 확인할 수 있습니다.

기존의 세포 배양액에 단파를 직접 조사하는 방법들이 배양액에서 주변 공기로 넘어가는 전이 지점에서의 파동 반사 효과를 고려하지 않는다는 점을 발견했을 때, 처음으로 이 모델에 대한 아이디어를 얻었습니다. 본 절차의 시연은 저희 연구 그룹의 박사 과정 학생인 Dr.Chante가 진행하겠습니다. 우선, 수돗물 3.5 L를 37 °C로 가열하십시오.

그런 다음 가열된 물을 항온 수조로 옮깁니다. 수위는 항온 수조 상단에서 3cm 아래여야 하며, 멤브레인이 완전히 잠겨야 합니다. 이어서 온도 센서를 전원 공급 장치에 연결하고, 항온 수조 뒷벽의 피팅에 온도 센서를 장착합니다.

그런 다음 물을 저으면서 히터를 전원 공급 장치에 지속적으로 연결하고, 물을 37 °C의 안정적인 온도로 가열합니다. 무균 조건 하에서 세포를 T 25 배양 플라스크에 분주합니다.

밤새 배양하면 세포 밀도가 90%의 합류도(confluency)에 도달하게 됩니다. 그런 다음 플라스크를 수직으로 세우고, 오염을 방지하기 위해 플라스크 목 아랫부분까지 배양액을 채웁니다. 배양액이 플라스크의 목이나 밀폐 캡에 닿지 않도록 주의하십시오.

다음으로 배스 내의 물로 인한 오염을 방지하기 위해 필터가 없는 고체 캡으로 플라스크를 닫습니다. 그 후 파라필름으로 캡을 밀봉합니다. 플라스크 밀봉이 완료되면 스탠드에 고정합니다.

그런 다음 고정된 플라스크를 항온수조에 넣고 세포 배양 플라스크의 중앙을 맞춥니다. 충격파 발생기 멤브레인의 중심 부분과 항온수조의 멤브레인에 초음파 전도 젤을 충분히 도포합니다. 그 후 발생기를 멤브레인에 연결하고, 그 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

다음으로, 충격파 어플리케이터를 멤브레인 중앙에 대고, 전체 세포 성장 영역이 처리될 수 있도록 세포 배양 플라스크와 수평 및 수직으로 정렬되었는지 확인합니다. 그런 다음 예비 실험을 수행하여 충격파 어플리케이터와 배양 플라스크 사이의 이상적인 거리와 정확한 처리 매개변수를 설정합니다. 충격파 장치 작동 중에 배양 플라스크와 어플리케이터가 안정적인 위치를 유지하도록 하십시오.

최적의 거리가 결정되면, 원하는 충격파 처리 파라미터 하에서 실험을 수행합니다. 충격파 처리가 완료되면, 수조에서 세포 배양 플라스크를 꺼내 종이 타월로 닦아내고 플라스크의 외표면을 소독합니다. 다음으로, 플라스크 내의 배지를 원심분리 튜브로 옮깁니다.

일반적인 원심분리 조건에서 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠렛을 2 mL의 세포 배양 배지에 다시 현탁한 후, 5 mL의 세포 배양 배지가 들어 있는 플라스크로 세포 현탁액을 옮기고, 세포 분석 실험에 필요한 합류도까지 세포를 배양합니다. 인간 제대정맥 내피세포의 실시간 PCR 분석 결과, 충격파 처리 후 tie2 mRNA 수치가 상향 조절되었음을 확인하였습니다.

이는 충격파 치료가 내피세포 증식 및 혈관 형성을 증가시켰음을 시사합니다. 배꼽 정맥의 사이토카인 수치를 사이토카인 어레이를 사용하여 정량적으로 분석하였습니다.

두 가지 염증성 사이토카인인 IL six와 IL eight 또한 유의미하게 증가한 것으로 나타났으며, 이 두 물질은 혈관 형성 과정 이후에 수반되는 염증에 관여합니다. 이 기술은 충격파 기초 과학 분야의 수많은 연구자가 인 비트로(in vitro) 실험을 통해 단일 세포 유형에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 우리는 더 많은 연구자가 충격파 과학에서 재현 가능하고 비교 가능한 결과를 얻기 위해 이 모델을 사용하도록 독려하기를 바랍니다.