Name: 4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 학습하세요 4D 공 촛점 시간 경과 이미징에서 샘플 편차를 수정하는 방법을 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여. 이 기법은 세포 이동 추적 정확도를 높여 발달 생물학 연구에 필수적입니다.

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우리는 가비 마틴이 작업을 시작하고 피지와 ImageJ에 프로젝트 참여자의 모든 EMBO2010 3D 발달 이미징 워크숍의 주최자에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 4D 시간 경과 이미징 실험 화상 획득을 위해 사용되는 설정은 사용되는 장비에 따라 달라질 것이다. 여기, 핀홀 크기, 대물의 개구, 시료의 굴절률과 시료가 내장 된 매체의 파장 : 광학 부 샘플 공 초점 현미경의 능력은 여러 가지 요인에 의존한다. 선택된 공 촛점 핀홀 사이즈 채집 광학 부재의 두께를 결정한다. 작은 핀홀이 얇은 광학적 부분 z 축 해상도를 증가하지만 캡처 빛의 양을 감소를 일으킬 것이다. 큰 핀홀이 Z 축 해상도를 감소하지만 캡처되는 광량을 증가 광학 부재의 두께를 증가시킬 것이다. 이전의 교정에 4D 데이터를 수집하는 동안 고려해야 할 추가 요소는 다음과 같습니다 : <ol><li> D를 제거하거나 제한 표류 스캔 속도를 최적화단일 시간 지점의 캡처를 uring. 따라서 이미지 수집을위한 시간은 시간 점 사이의 간격의 작은 분획이어야한다. </li><li> 그것은 필요한 보정을 확인할 수는 없습니다로 완벽하게 반복 구조, 또는 그리드, 등록을위한 구조로서 적합하지 않다. 무작위로 배포 구슬 또는 고르지 구조는 모호 등록을 허용합니다. </li><li> 드리프트가 예상되는 경우, 그 영역은 화상 스택 내에 남아 있도록하기 위해 스캐닝 영역과 상하 초점 한계를 증가시킨다. </li><li> 확보에 더하여, 그 구조를 해결 연구되고 동적 이벤트의 시간 해상도를 제공하기 위해 샘플링 레이트를 설정하기위한 적절한 공간 해상도가있다. 참고 : 이미지의 시간 점 사이의 시간 따라서 정기적으로 반복 이벤트 사이의 최소 절반 시간 간격하고 불규칙한 이벤트를 감소해야한다. </li></ol> 2. 공 촛점 D 열기ataset 오픈 소스 패키지 피지 현미경 실험에서 수집 된 데이터를 다수의 프로세스를 수행하기위한 사전 설치된 플러그인을 포함하는 ImageJ에 프로그램의 분포입니다. 소프트웨어는 쉽게 플러그인 업데이트 아키텍처를 제공하고,이 프로토콜에 사용되는 정확한 3D 드리프트 플러그인의 복사본을 포함한다. 이 소프트웨어는 오픈 현미경 환경의 바이오 형식의 가져 오기 플러그인의 사용을 통해 독점 현미경 이미지 포맷의 광대 한 배열의 가져 오기를 지원합니다. <ol><li> 피지 프로그램을 설치합니다 (http://fiji.sc/Downloads). </li><li> 궤적 바이오 형식 가져 오기 플러그인을 사용하여 획득 한 데이터 집합을로드합니다. </li><li> 데이터 세트는 프로그램에 할당 된 메모리보다 큰 경우, 메모리 관리부 내에 &quot;사용하는 가상 스택 옵션&quot;을 선택한다. </li></ol> 3. 후 처리에 3D 개체의 드리프트 보정 오랜 시간이 경과하는 과정에서임베디드 때에도 샘플 이동할 수 실험. 어떤 움직임을 보정하고 묘화 이주 이벤트를 분석 할 수 있도록, 화상의 후 처리가 수행 될 수있다. 모든 이미지 후 처리는 명확하게이 작품에서 파생 된 분석의 방법에서 기술되어야한다. <ol><li> 데이터 집합이로드되면, 올바른 3D 드리프트 플러그인을 실행합니다. </li><li> 여러 콘텐츠 채널이있는 경우, 이미지를 등록하는 데 사용되는 채널을 선택한다. 이 이상적으로 오히려 어떤 철새 나 모바일 요소보다 샘플 내에서 정적 구조를 표현한다. 이것이 가능하지 않은 경우, 최소한의 움직임 채널 선택해야합니다. </li><li> 이 분석에 사용되는 시스템에서 사용 가능한 RAM 원래 데이터 세트의 적은 배 이상의 크기 인 경우, 사용하는 가상 스택 옵션을 선택한다. 이는 오히려 RAM으로 파일을 저장하는 것보다 화상 시퀀스로서 등록 hyperstack를 저장할 것이다. <ol><li> 출력 각각에 플러그인의 폴더를 선택합니다 - 지금 수정GES 파일. 별도의 이미지 파일은 각 Z 위치에서 각 채널에 대해 생성됩니다. </li></ol></li><li> 플러그인은 다음 데이터 집합에 적용되는 필요한 보정을 결정하기 위해 각 시간 점 사이의 쌍대 위상 상관 관계 분석을 실시한다. </li></ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

오랜 시간 경과 현미경 실험에서 파생 된 데이터 세트의 샘플 드리프트를 해결하기 위해 후 처리 소프트웨어를 사용하는 우리의 능력은 요인에 의해 제한됩니다. 샘플의 철새 이동 대 드리프트를 식별 할 수있는 기능은 사용 된 세포 마커에 따라 달라집니다. 어느 널리 샘플 내에서 표현이나 이미지 수집하는 동안 철새 이벤트에 관련되지 않은 세포 마커 드리프트 보정을위한 최고의 소스를 제공합니다. 플러그인은 시간 포인트 간의 이동을 등록하는 단일 채널을 사용하고 수집 한 이미지의 모든 채널이 등록을 적용한다. 따라서, 그 샘플에서이 형광 마커를 사용하는 것이 유리할 수있다. 실험 기간 동안 떨어져 드리프트에서 이동 될 것으로 예상되지 않습니다 라벨 구조에 대한 하나의 추적 할 셀이나 구조에 대한 마커 및 제 표식. 등록은 하나의 채널 데이터 세트에서 수행 할 수 있지만, 만약 그렇다면 일의 대부분전자 데이터가 이동할 것으로 예상 단지 작은 비율로 이미지에 고정해야합니다. 화상의 큰 비율이 이동은 측정 된 움직임의 감소의 결과로, 어떤 드...

공 촛점 이미징 널리 형태의 세포의 움직임과 변화를 따라 세포 및 발달 생물학에 사용됩니다. 다른 초점면에 광학 섹션의 일련 캡처 허용 후 3D 데이터 세트의 시간 경과 시리즈를 생성하여 네 차원 (4D)으로 확장 될 수있는 샘플의 3 차원 (3D) 모델의 생성. 4D 데이터 세트의 생성은 세포의 움직임과 행동의 상세한 측정을 할 수 있습니다. 장기간의 시간 경과 실험에서는 샘플의 움직임을 관찰하는 것이 일반적입니다. 이는 하드웨어 제어 단계와 초점 위치에서 약간의 부정확으로 인해 발생할 수 있습니다. 다른 사람의 경우, 드리프트 샘플 장착 미디어 내에서 샘플 성장과 유연성에 의해 유도 된 운동의 결과이지만. 방법은 하드웨어를 중심으로 시스템을 개선하고 설치 매체의 증가 강성 등의 이러한 움직임을 보상하거나 제한하기 위해 존재한다. 그러나, 이러한 접근법에 의한 촬상으로의 많은 경우에 적용 할 수 없다등 최대 샘플 유지 보수 및 성장에 적합한 조건을 제공해야합니다. 오픈 소스 소프트웨어 솔루션은 ImageJ에 또는 피지 StackReg 및 TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 플러그인을 사용하여, 시간이 지남에 따라 2 차원 운동의 보정을 위해 존재하지만, 이들은 수 없습니다 4D 데이터 세트에 적용 할. 샘플의 드리프트를 교정하기 위해 우리는 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지 1을 활용하는 플러그인 (올바른 3D 드리프트)를 개발했습니다. 우리의 플러그인은 입체 시간 경과 실험 샘플 드리프트의 결과로서 발생하는 움직임을 보정하기 위해 위상 상관 등록을 수행 할 수있다. 위상 상관 관계 (6) 이미지 사이의 변환을 결정하는 계산 효율적인 방법입니다. 여기에 설명 플러그인 Preibisch 외. (7)에 의해 개발 된 위상 - 상관 라이브러리를 이용한다. 멀티 채널 실험에서, 플러그인은 determi에 하나의 채널을 이용필요한 보정 NE. 이 보정은 다음 4D 데이터 세트의 등록 결과 추가적인 채널에 적용된다. 제브라 피쉬 모델 시스템에서 많은 시간, 심지어 며칠 8의 기간 동안 시간 경과 촬상을 행할 수있다. 제브라 피쉬를 장착하기위한 일반적인 방법은 운동 9-11을 제한, 저 융점 아가 로스 (0.8 ~ 1.5 %)에서 마취 라이브 배아를 포함하는 것입니다. 이동이 규제되는 동안 샘플의 성장이 정지 한 위치를 이동 시야 내의 세포의 결과 발생한다. 배아에서 세포의 이동을 수행하기 위해 먼저 전체 샘플의 움직임을 보정 할 필요가있다. 이 프로토콜은 제브라 시험편으로 개발되었고, 화상 체절 개발 (12)에 이용되었지만 어떠한 4D 촛점 집합에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(트리카인)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>저겔화 온도 아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 집게</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>일회용 3ml 눈금</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 전사 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9cm 박테리아 등급 페트리 접시</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜빙</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-710 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

4d 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

사차원 (4D) 공 초점 데이터 세트의 생성; 시간이 지남에 따라 3D 이미지 시퀀스로 구성된; 발달 과정에 관여 세포의 동작을 캡처 할 수있는 훌륭한 방법을 제공합니다. 세포의 움직임을 추적하고, 수행하는 기능은 화상 획득 동안에 샘플의 드리프트 또는 어떤 경우에는 증가로 인해 발생하는 샘플의 움직임에 의해 제한된다. 드리프트 및 / 또는 성장에 의해 영향을받는 데이터 세트에서 추적 셀은 셀 위치의 분석으로이 운동을 통합 할 것입니다. 이 샘플 내에서 정적 구조의 명백한 움직임의 원인이 될 수 있습니다. 따라서 이전의 세포 추적에 대한 모든 샘플 드리프트 수정해야합니다. ImageJ에 2,3의 오픈 소스 피지 분배 (1)과 통합 궤적 도구 4를 사용하여, 우리는 공 초점 데이터 세트에서 잘못된 샘플의 움직임을 제거 할 수있는 올바른 3D 드리프트 플러그인을 개발했다. 이 프로토콜은 효율적으로 초점 포에 샘플 번역 또는 변경에 대한 보상연장 된 시간 경과 실험을 통해 세포의 움직임을 시각화하고 측정하는 능력을 유지하면서 사차원 촛점 데이터 세트마다 포인트를 등록하는 단계 상관을 이용함으로써 구성비.

13 - 개발 제브라 피쉬에서 빠른 근육 세포는 19시간 후 수정 (체절 단계 20)에서 다핵 섬유로 융합. 핵의 움직임과 우리가 근육의 모든 레이블을하는 골격 α-액틴 프로모터의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 형질 전환 균주를 사용하여 4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 실시 근육 세포의 융합을 시각화하기 위해 전지 (14)과 mCherry이 핵을 레이블, 핵 이행 순서로 태그 적색 형광 단백질을 코딩 RNA를 주입했다. 주입 된 형질 전환 배아는 저 융점 아가로 오스 및 2 시간의 기간에 걸쳐 2.0 ㎛의 간격으로 20 분 간격으로 촬영 된 광 (71) 부분으로 구성된 이미지 시퀀스에 장착 하였다. 약 7 ㎛, 샘플 드리프트는 중첩 된 이미지의 (그림 1A)와 nucl의 명백한 움직임을 흔들림의 결과로, 시간 경과 실험의 과정을 통해 관찰되었다에이 시간에 (그림 1B). 플러그인의 응용 프로그램이 등록 된 이...

시간 경과 현미경은 개발 프로세스의 시각화를 할 수 있습니다. 화상 취득 동안에 성장 또는 샘플의 드리프트가 정확하게 따르고 개발 중에 세포의 움직임을 측정하는 능력을 감소시킨다. 우리는 시간에 따른 입체 샘플 드리프트 보정하기 위해 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명한다.

4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

타임랩스 현미경(TimeLapse Microscopy)을 통해 이미지 상에서 발생하는 시료의 발달, 성장 또는 드리프트(drift) 과정을 시각화할 수 있습니다. 영상 획득 과정에서 세포의 이동을 추적하거나 따라가는 것이 어려울 수 있으며, 이에 따라 다음과 같은 프로토콜을 수행합니다. 본 프로토콜에서는 오픈 소스 영상 처리 소프트웨어를 사용하여 시간에 따른 3차원 드리프트를 보정합니다.서로 다른 초점 평면에서 일련의 광학 섹션을 캡처하면 샘플의 3차원 모델을 생성할 수 있습니다. 이는 3D 데이터 세트의 타임랩스 시리즈를 생성함으로써 4차원으로 확장될 수 있습니다. 장기간의 타임랩스 실험에서는 샘플의 움직임이 관찰되는 경우가 흔합니다.이는 스테이지를 제어하는 하드웨어의 슬라이딩 정확도 및 초점 위치로 인해 발생할 수 있으며, 다른 경우에는 샘플의 성장이나 마운팅 매질 내의 유연성으로 인한 움직임의 결과로 드리프트가 발생할 수 있습니다. 하드웨어 포커싱 시스템의 많은 개선과 마운팅 매질의 강성 증가를 통해 이러한 움직임을 제한하고 보정하는 방법들이 존재합니다. 그러나 샘플의 유지 및 성장에 적합한 조건을 제공하기 위해 필요한 이미징 설정으로 인해 많은 경우 이러한 접근 방식을 적용할 수 없습니다. 샘플 드리프트를 해결하기 위해, 당사는 오픈 소스 이미지 처리 플랫폼인 Fiji를 활용하는 플러그인을 개발하였습니다.당사의 correct 3D drift 플러그인은 다채널 실험의 3차원 타임랩스 실험에서 롤(role) 또는 시료 드리프트로 인해 발생하는 움직임을 보정하기 위해 위상 상관 등록(phase correlation registration)을 형성할 수 있습니다. correct 3D drift 플러그인은 하나의 채널을 활용하여 필요한 보정값을 결정합니다. 이후 이 보정값이 추가 채널들에 적용되어 4D 데이터 세트의 등록이 이루어집니다.오픈 소스 무료 웹 패키지입니다. Fiji는 Image J 프로그램의 배포판 포크(fork)로, 현미경 실험에서 수집된 데이터에 대해 수많은 프로세스를 수행할 수 있도록 사전 설치된 플러그인들을 포함하고 있습니다. Fiji는 더 쉬운 플러그인 아키텍처를 제공하며 기본 설치 항목에 포함되어 있습니다.설치가 완료되면 이번 분석에 사용할 세 가지 EG 플러그인 복사본을 준비하고 Fiji를 실행하십시오. Fiji는 방대한 종류의 독점적인 현미경 이미지 포맷의 임포트를 지원합니다. 이는 드래그 앤 드롭 방식이나 사용자의 Open microscopy environment를 통해 수행할 수 있습니다.Bio-formats 임포트 플러그인입니다. 데이터 세트가 시스템에 설치된 메모리 용량을 초과하는 경우, 이미지 파일을 가상 스택으로 열고 메모리 관리 옵션을 사용하십시오. 본 분석에 사용될 데이터 세트는 GFP가 골격근에서 발현되는 ACTA1 GFP 형질전환 제브라피쉬의 3차원 시계열 실험을 통해 생성되었습니다.핵을 시각화하기 위해 이 형질전환 라인에 핵 국소화 M cherry를 주입하였습니다. 이러한 형광층을 더 잘 나타내기 위해, 컬러 채널 도구에서 각 채널의 룩업 테이블(lookup tables)을 변경할 수 있습니다. 수집된 시계열 과정 동안 제브라피쉬 샘플이 시야 내에서 표류한 것으로 보입니다. 이러한 표류를 수정하기 위해 Fiji에 설치된 플러그인의 등록(registration) 하위 메뉴에서 Correct 3D Drift 플러그인을 실행하였습니다.샘플 내에서 널리 발현되거나 이미지 획득 중의 마커 이벤트에 관여하지 않는 셀 마커가 드리프트 보정을 위한 최적의 소스가 됩니다. 이 예제에서는 채널 1의 GFP 형광인 ACTA1을 사용합니다. 시스템의 메모리가 제한적인 경우, 가상 스택(virtual stack) 옵션을 선택하고 Correct 3D drift 플러그인을 실행하십시오.보정된 데이터셋은 샘플의 이동을 수용하기 위해 원래보다 더 큰 캔버스 크기를 갖게 됩니다. 광학 절편의 최대 투영 이미지를 생성하면, 보정된 샘플에서 제거된 드리프트를 비교할 수 있습니다.최대 강도 투영(Maximum Intensity Projection)은 데이터 세트에서 차원을 제거하지만, 드리프트 보정(drift Correction) 결과를 빠르게 검토하는 데 유용한 방법입니다. 여기에서는 보정된 데이터 세트와 보정되지 않은 데이터 세트의 각 타이 포인트(tie point)에 대한 최대 투영 이미지를 확인할 수 있습니다. 이 타임랩스 실험을 단일 이미지로 투영하면, 짧은 타임랩스 실험에서도 발생할 수 있는 드리프트의 양이 분명하게 나타납니다.샘플의 한 채널에서 등록된 드리프트 보정 사항은 해당 이미지 스택에 포함된 다른 모든 채널에도 동일하게 적용됩니다. 시스템의 메모리가 제한적인 경우의 드리프트 보정 절차는 약간 다릅니다. 바이 포맷(Bio-Formats) 가져오기 메뉴와 Correct 3D Drift 플러그인 팝업 메뉴 모두에서 가상 스택 사용(Use virtual stack) 옵션을 선택하십시오.이 옵션을 선택하면, 플러그인이 타임랩스 실험의 각 채널 슬라이스 및 시간 지점별로 개별 이미지 파일을 내보낼 위치를 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 생성된 가상 스택에는 이전 예제와 동일한 드리프트 보정이 적용되어 있습니다. 선택한 저장 위치를 열면, 생성된 결과 개별 이미지 시퀀스 파일들을 확인할 수 있습니다.이 파일 모음을 열려면 이미지 시퀀스 가져오기 도구를 사용하십시오. 결과 파일은 채널, 광학 단면 또는 시간 지점이 분리되지 않은 상태로 생성됩니다. 이러한 특징들을 시각화하려면 로그 파일의 데이터를 사용하여 스택을 하이퍼스택으로 변환하고, 수집된 채널 수, 광학 슬라이스 수 및 시간 지점 수를 입력하십시오. 타임랩스 실험에서 표시되는 색상을 조정하기 위해 룩업 테이블을 다시 변경할 수 있습니다.본 프로토콜은 여러 시간 지점(time point) 사이에서 발생하는 드리프트를 보정합니다. 단일 시간 지점의 캡처 중에 발생하는 드리프트는 본 프로토콜로 보정할 수 없습니다. 각 시간 지점의 캡처 시간을 단축할 수 있는 이미지 획득 파라미터를 사용할 것을 권장합니다. 후처리 소프트웨어를 통해 드리프트를 보정함으로써, 시료의 드리프트로 인해 손실되었을 세포의 움직임을 분석하고 측정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세 개의 시험 샘플의 제조 방법들이 최적화 STORM 현미경의 성능을 평가하는 데 사용될 수를 기술한다. 이 예제를 사용하여 우리는 원시 데이터를 수집 한 후 약 30 ~ 50 nm의 해상도의 세포에서 최고 해상도의 이미지를 얻기를 처리하는 방법을 보여줍니다.

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행...

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

이 프로토콜은 Fibrin 혈전을 사용하여 샘플 고정응용을 설명하고, 표류를 제한하며, 라이브 이미징 중에 시약을 첨가및 세척할 수 있도록 합니다. 시료는 커버슬립의 표면에 배양 배지를 함유하는 피브리노겐의 한 방울로 전달되며, 그 후 중합화가 혈전을 첨가하여 유도된다.

라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

이 작품은 원자 분해능 투과 전자 현미경 이미징에서 원자 위치 추적을 위한 워크플로우를 제공합니다. 이 워크플로우는 오픈 소스 Matlab 앱(EASY-STEM)을 사용하여 수행됩니다.

전자 현미경 검사를 통한 피오피터 정밀 원자 위치 추적

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

학습하세요 4D 공 촛점 시간 경과 이미징에서 샘플 편차를 수정하는 방법을 오픈 소스 소프트웨어를 활용하여. 이 기법은 세포 이동 추적 정확도를 높여 발달 생물학 연구에 필수적입니다.

4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

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