4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

TimeLapse Microscopy를 사용하면 이 이미지에서 발생하는 샘플의 발달, 성장 또는 드리프트 과정을 시각화할 수 있습니다. 획득으로 인해 세포의 움직임을 추적하거나 추적할 수 없게 될 수 있으며, 이는 다음 프로토콜입니다. 우리는 오픈 소스 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 시간 경과에 따른 3차원 드리프트를 수정합니다.

서로 다른 초점면에서 일련의 광학 단면을 캡처하면 샘플의 3차원 모델을 생성할 수 있습니다. 이는 3D 데이터 세트의 타임랩스 시리즈를 생성하여 4차원으로 확장할 수 있습니다. 장기간의 타임랩스 실험에서는 샘플 움직임을 관찰하는 것이 일반적입니다.

이는 하드웨어 제어 단계 및 초점 위치의 슬라이딩 정확도로 인해 발생할 수 있으며, 다른 경우에는 샘플 성장 또는 장착 매체 내의 유연성으로 인한 움직임의 결과로 드리프터가 발생하며, 하드웨어 초점 시스템의 많은 개선과 장착 매체의 강성 증가로 이러한 움직임을 제한하기 위해 보상하기 위해 존재합니다. 그러나 이러한 접근 방식은 샘플 유지 관리 및 성장을 교정하기 위한 적절한 조건을 제공하는 데 필요한 이미징 설정으로 인해 많은 경우에 적용할 수 없습니다. 샘플 드리프트를 위해 피지의 오픈 소스 이미징 처리 플랫폼을 활용하기 위한 플러그인을 개발했습니다.

우리의 올바른 3D 드리프트 플러그인은 다중 채널 실험의 3차원 타임랩스 실험에서 역할 또는 샘플 드리프트로 발생하는 움직임을 수정하기 위해 위상 상관 등록을 형성할 수 있습니다. 올바른 3D 드리프트 플러그인은 하나의 채널을 사용하여 필요한 보정을 결정합니다. 그런 다음 이 보정은 추가 채널에 적용되어 4D 데이터 세트가 등록됩니다.

오픈 소스 무료 웹 패키지. Fiji는 현미경 실험에서 수집된 데이터에 대해 수많은 프로세스를 수행하기 위해 사전 설치된 플러그인이 포함된 배포 포크인 Image J 프로그램입니다. 피지는 더 쉬운 플러그인 아키텍처를 제공하며 기본 설치에 포함됩니다.

설치가 완료된 후 이 분석에 사용할 올바른 세 개의 EG 플러그인 사본 Open Fiji. 피지는 광범위한 독점 현미경 이미지 형식의 가져오기를 지원합니다. 이는 드래그 앤 드롭 또는 사용자, Open microscopy 환경을 통해 달성할 수 있습니다.

바이오 형식 가져오기 플러그인. 데이터 세트가 시스템에 설치된 메모리 크기를 초과하는 경우 이미지 파일을 가상 스택 및 메모리 관리 옵션으로 엽니다. 이 분석에서 사용할 데이터 세트는 GFP가 골격근에서 발현되는 ACTA one, GFP 형질전환 제브라피시의 3차원 시계열 실험에서 생성되었습니다.

핵을 시각화하기 위해 이 형질전환 라인에는 이러한 형광층을 더 잘 표현하기 위해 M 체리를 국소화하는 핵이 주입되었으며, 색상 채널 도구에서 이러한 각 채널에 대한 조회 테이블을 변경할 수 있습니다. 수집된 시계열 동안, 지퍼 물고기 샘플이 시야에서 표류한 것으로 보입니다. 그녀는이 드리프트를 수정하고 피지에 설치된 플러그인의 등록 하위 메뉴에서 올바른 3D 드리프트 플러그인을 열었습니다.

샘플 내에서 널리 발현되거나 이미지 획득 중 마케터리 이벤트에 관여하지 않는 판매자 마커는 드리프트 보정을 위한 최상의 소스를 제공합니다. 이 예에서는 채널 1의 ACTA 1, GFP 형광입니다. 시스템의 메모리가 제한된 경우 가상 스택 옵션을 선택하고 올바른 3D 드리프트 플러그인을 실행하도록 허용합니다.

수정된 데이터셋은 원본에 비해 캔버스 크기가 더 커집니다. 샘플의 움직임을 수용합니다. 광학 섹션의 최대 프로젝션 이미지를 생성하면 수정된 샘플에서 제거된 드리프트를 비교할 수 있습니다.

최대 강도 투영은 데이터 세트에서 차원을 제거하지만 드리프트 보정의 결과를 빠르게 검사하는 데 유용한 접근 방식입니다. 여기에서 수정된 데이터 세트와 수정되지 않은 데이터 세트의 각 접합점에 대한 최대 투영 이미지를 볼 수 있습니다. 이 타임랩스 실험을 단일 이미지로 투사할 때 짧은 타임랩스 실험에서도 발생할 수 있는 드리프트의 양이 분명합니다.

샘플의 한 채널의 드리프트를 등록하여 수행한 수정 사항은 이 이미지 스택에 포함된 다른 모든 채널에도 적용됩니다. 시스템의 메모리가 제한된 경우 드리프트 수정 절차가 약간 변경되었습니다. buy format, import 메뉴 및 올바른 3D drift plugin 팝업 메뉴 모두에서 사용된 가상 스택 옵션을 선택합니다.

이 옵션을 선택하면 플러그인이 타임랩스 실험의 각 채널 슬라이스 및 시점에 대해 개별 이미지 파일을 내보낼 수 있는 위치를 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 생성된 가상 스택에는 이전 예제와 동일한 드리프트 수정이 포함되어 있습니다. 선택한 저장 위치를 열면 생성된 개별 이미지 시퀀스 파일이 표시됩니다.

이 파일 컬렉션을 열려면 이미지 시퀀스 가져오기 도구를 사용합니다. 결과 파일은 채널, 광학 섹션 또는 시점을 분리하지 않습니다. 이러한 기능을 시각화하려면 로그 파일의 데이터를 사용하여 스택을 하이퍼 스택으로 변환하고, 채널 수, 광학 슬라이스 및 수집된 타이 포인트를 입력하고, 룩업 테이블을 다시 변경하여 타임랩스 실험의 표시되는 색상을 조정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 단일 시점의 캡처 내에서 발생하는 드리프트는 이 프로토콜로 수정할 수 없는 시점 간에 발생하는 드리프트를 수정합니다. 이미지 획득에 사용되는 매개변수는 각 시점을 캡처하는 데 걸리는 시간을 줄이는 것이 좋습니다. 후처리 소프트웨어에서 drift를 보정할 수 있는 기능을 통해 시료의 drift에 의한 기술일 수 있는 세포 이동을 분석 및 측정할 수 있습니다.