의 자동 분리 C. 엘레 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

다음 실험의 전반적인 목표는 군집화의 기여도와 이와 관련된 손상이 바다의 우아함에서 선천성 면역 반응 시작에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이것은 병원체에 의해 다양하게 군집화된 벌레 개체군을 생산하는 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 발현하는 슈도모나스 아로사(pseudomonas arosa)에 젊은 성인 바다 우아함의 동기화된 개체군을 노출시킴으로써 달성됩니다. 차등적으로 세척한 후, 식민지화된 벌레 개체군은 완전히 식민지화된 벌레와 비식민지화된 벌레의 두 극단에 초점을 맞춘 순수한 개체군으로 분리됩니다.

다음으로 이러한 집단에서 RNA를 추출하고 비병원성 대장균에서 자란 기생충과 비교하여 면역 유전자 발현을 평가합니다. 면역 반응과 군집화 사이의 관계를 조사하기 위해 p arosa에 대한 바다 우아함의 선천적 면역 반응이 병원체 집락화와 분리될 수 있음을 보여주는 결과를 얻었습니다. 바다 우아함에서 면역 반응 시작을 연구하는 다른 접근 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은 따뜻한 개체군에서 감염의 다양성을 해결하여 감염 과정의 다양한 측면을 구분할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 바다의 우아함, 선천성 면역 반응 시작의 기초가 무엇인지와 같은 선천성 면역 및 높은 처리량 방식으로 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 유전적 또는 환경적 조작이 병원체 집락화에 저항하는 능력에 미치는 영향은 무엇입니까? 시작하려면 많은 벌레가 무덤 단계에 도달할 때까지 대장균 박테리아가 뿌려진 여러 선충, 성장 배지 또는 NGM 플레이트에서 벌레를 성장시킵니다.

그런 다음 무덤 동물을 난자 준비 용액으로 처리하여 동기화된 배양을 얻습니다. 다음 플레이트. 여러 개의 60mm NGM 플레이트에 있는 알에는 플레이트당 약 150-200개의 알의 밀도로 박테리아가 뿌려져 있습니다.

수천 마리의 벌레를 얻으려면 최소 15-20개의 플레이트가 필요합니다. 분류 실험의 경우, 사용자는 더 많은 수의 지렁이가 필요한 경우 플레이트당 더 많은 알이 있는 더 큰 직경의 플레이트를 사용하여 스케일업해야 합니다. 벌레가 L 4 또는 젊은 성인 단계에 도달 할 때까지 섭씨 20도에서 이틀 동안 플레이트를 배양합니다.

계란 준비의 다음날에 POSA 배양, PA 14 GFP를 표현하는 A GFP를 항생제를 포함하는 왕 B.Medium의 2 밀리리터로 접종하십시오. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 교반하여 배양물을 배양합니다. 다음 날, PA 14 GFP 배양액을 각 150mm 페트리 접시에 대한 분석에 필요한 만큼의 느린 사멸 플레이트에 플레이트화합니다.

피펫은 75-100 마이크로 리터의 포화 배양물을 피펫으로 만들고 고르게 퍼집니다. 멸균 유리 스프레더를 사용하여 섭씨 37도에서 20-24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이터에서 PA 14 GFP가 있는 플레이트를 제거하고 실온으로 냉각시킵니다.

한편, NGM 플레이트에서 자란 벌레를 수집하려면 플레이트를 덮을 수 있을 만큼 소량의 M nine 버퍼를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 소용돌이치고 액체를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 웜을 PA 14 GFP 플레이트로 옮기기 전에 웜이 바닥에 가라앉도록 하고 과도한 액체를 제거하십시오.최소한의 액체로 150mm 플레이트를 사용할 때 단일 플레이트에 수백 개의 웜을 배치할 수 있습니다.

섭씨 25도에서 18-21시간 동안 플레이트를 배양하여 p arosa에 노출된 어린 성인 벌레를 배양합니다. 이것은 표본 분류를 수행하기 전에 집락화된 동물과 집락화되지 않은 동물의 최적 분포를 표시하는 시간 창으로, 기계가 제대로 작동하는지 확인합니다. 필수 단계는 여기에 설명되어 있으며 자세한 내용은 온라인에서 확인할 수 있습니다.

시스 밸브 압력을 약 5PSI로 설정하여 시스 유체 유량이 적절한지 확인합니다. 디스펜서 아래에 15ml 원뿔형 튜브를 놓습니다. 시스 밸브를 켜고 분류기 밸브를 끕니다.

디스펜서 아래의 튜브를 60초 동안 잡습니다. 튜브의 부피는 9-10밀리리터여야 합니다. 이 범위를 벗어난 경우.

피복 유체 유량이 정확한 분류를 허용하도록 피복 밸브 압력을 적절하게 조정하십시오. 먼저 시스 밸브를 꺼서 정렬 속도를 테스트합니다. 그런 다음 약 25ml의 제어 입자 용액을 저장소에 추가합니다.

컴퓨터 소프트웨어에서 시스 밸브와 샘플 밸브를 켭니다. 제어 파티클 모드로 이동하여 acquire를 클릭합니다. 입자 유속이 초당 약 5-8개의 입자이고 비행 시간이 40마이크로미터 입자의 너비와 비슷한지 확인하십시오.

이렇게 하면 한 번에 하나의 40미크론 물체만 통과할 수 있습니다. 값이 이 범위를 벗어나면 그에 따라 설정을 조정하십시오. M nine 버퍼 워시 웜을 15mm 원뿔형 튜브에 사용하여 성인 웜이 중력에 의해 튜브 바닥으로 가라앉고 상층액을 제거하도록 합니다.

튜브에 새 M nine 버퍼를 채웁니다. 이 과정을 3-4회 반복합니다. 이렇게 하면 많은 양의 유충과 과도한 박테리아가 제거되며 약 10분이 걸립니다.

부드럽게 섞이는 작은 교반 막대가 들어 있는 지렁이 분류기 저장소에 지렁이를 추가합니다. 녹색 광전자 증배관을 600으로, 빨간색과 노란색 광전자 증배관을 200으로 설정하여 초기 신호 게인을 조정합니다. 설정을 조정하기 위해 데이터 수집을 시작합니다.

초당 25-30개의 이벤트 또는 웜의 정렬 속도를 목표로 합니다. 숫자 비율이 너무 높으면 저장소의 웜을 M nine으로 희석하십시오. 그에 따라 버퍼링합니다.

속도가 너무 낮으면 M nine의 작은 부피에 더 많은 웜을 추가하십시오. 실험에서 집락화된 벌레와 집락화되지 않은 벌레를 매우 엄격하게 분리해야 하는 경우 우연 검사를 순수하게 설정합니다. 이렇게 하면 두 개체가 서로 너무 가깝거나 동일한 드롭에 있는 경우 기계가 드롭을 거부합니다.

관심 모집단을 분류하기 위해 수집하는 대신 축 주위에 크기와 형광 강도를 나타내는 게이트를 그립니다. 형광 게이팅의 값은 경험적으로 결정되어야 합니다. 그런 다음 디스펜서 아래에 다중 웰 플레이트나 페트리 접시를 놓아 벌레를 수집합니다.

그런 다음 분류 밸브를 열어 지렁이 분류를 시작합니다. 작은 동물 개체군을 수집하여 분류된 개체군이 관심 개체군인지 현미경으로 확인합니다. 그렇지 않은 경우 게이트 매개변수를 적절하게 조정하고 샘플 수집을 계속합니다.

나이가 일치할 때, GFP에 노출된 posa를 표현하는 posa는 식민지 수준에서 광범위한 분포를 초래하고, 식민지화된 벌레로부터 비식민지화의 효율적인 분리를 이루며, 웜 분류기를 사용하여 달성되었습니다. 군집화되지 않은 벌레와 달리 군집화된 벌레는 나른함과 같은 명백한 징후를 보이고 배변을 줄입니다. 후자는 P arosa에 의해 서식하는 기생충이 감염을 제거하는 데 어려움을 겪는 이유일 수 있습니다.

4개의 유전자는 기생충의 군집 상태에 관계없이 P arosa 노출과 유사하게 유도되었으며 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 유전자의 발현을 측정했습니다. 이 4개의 유전자는 CL egan의 면역 반응의 일부인 것으로 알려져 있습니다. Lys two는 감염에 특이적으로 반응하는 2개의 특성화되지 않은 유전자인 lysozyme을 암호화하며, 그 중 1개는 감염 저항성에 기여하고, PGP 5는 중금속 스트레스뿐만 아니라 감염에도 반응합니다.

이 결과는 집락화 및 관련 손상이 면역 반응에 필요하지 않다는 것을 나타내는 이전에 발표된 결과를 확증합니다. 대신, 병원체 관련 분자 패턴을 신호 데이터로 지적하여 PGP 5가 비집락화 동물에서 유도되었음을 보여주며, 이는 경험되지 않을 것으로 예상됩니다. 광범위한 손상은 바다의 우아함에서 면역 반응과 일반적인 스트레스 반응을 제어하는 조절 프로그램의 중복을 시사합니다.

이 방법은 바다의 우아함에서 면역 반응의 시작에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있지만, 환경 조건이나 유전자 조작이 식민지화에 미치는 영향 또는 감염 과정 외에 다른 병원체 간의 경쟁과 같은 다른 질문에도 적용될 수 있습니다. 이 방법은 대사 산물 또는 화학 물질의 섭취 또는 격리와 같은 환경과 벌레의 다른 상호 작용을 따르기 위해 적용될 수도 있습니다. 이 절차에 따라, 분류된 관심 집단은 유전자 발현 이외의 다양한 목적으로 사용될 수 있습니다.

여기에는 후속 감염 또는 생존 분석 또는 행동 실험을 위해 살아있는 동물을 수집하는 것이 포함됩니다. 이 기술은 병원체 노출과 집락화가 타고난 면역과 바다의 우아함에 미치는 영향을 연구하는 데 유용한 수단을 제공합니다.