Name: 의 자동 분리 C. 엘레 가변 세균성 병원체에 의해 식민지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 병원체 식민화에 따른 선천성 면역 반응을 웜소터로 분석하는 방법을. 이 기술은 감염 변이성을 해결하여 면역 기전 연구에 활용됩니다.

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저자는 그들의 지원을 위해 엘리슨 의료 재단 감사합니다. 우리는 wormsorter을 사용하여에 대한 지원은 애비 Dernburg 실험실의 구성원을 감사하는 것이 좋겠다.

1. 젊은 성인 동물의 동기화 문화를 얻기 <ol><li> OP50-1 E. 시드 여러 NGM 플레이트에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 (10 배는 포화 문화 집중) 많은 벌레가 임신하는 단계에 도달 할 때까지. </li><li> 동기화 문화 (계란)을 획득 달걀 준비 솔루션으로 임신하는 동물을 처리합니다. </li><li> 여러 60 mm NGM 플레이트에 플레이트 계란은 대략 150 ~ 200 계란 / 판의 밀도로 10 배 농축 OP50-1 시드. </li><li> (- 젊은 성인 단계 웜 L4에 도달 할 때까지) 2 일 동안 25 ° C에서 접시를 품어. </li></ol> 2. 녹농균 플레이트를 준비 및 웜 감염 <ol><li> 달걀 준비 (단계 1.1)의 날에 100 μg / ML의 최종 농도에서 왕의 B 미디어 포함 리팜피신 2 ㎖로 PA14 :: GFP 문화를 접종. 교반 O / N과 37 ° C에서 문화를 품다 </li><li> PA14 :: GFP 막 플레이트분석에 필요한만큼 천천히 죽이는 판 (SKP)에 진짜야. 각 150mm SKP 페트리 접시 피펫에 75 ~ 100 포화 문화의 μL 및 멸균 유리 스프레더를 사용하여 균일하게 확산. 20 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 실온 (~ 20 분)으로 냉각 할 수 있습니다. M9 버퍼를 사용하여, PA14에 단계 1.4에서 벌레를 씻어 :: GFP 판을 액체의 최소한의 볼륨. 150mm 플레이트를 사용하는 경우, 수백 웜 단판에 배치 될 수있다. </li><li> 18 ~ 21 시간 동안 25 ° C에서 접시를 품어. P.에 대한 녹농균에 노출 된 젊은 성인 웜,이 noncolonized 동물 대 식민지의 최적 분배를 표시하는 시간 창입니다. </li></ol> 3. Wormsorter 설정 샘플의 종류를 수행하기 전에 컴퓨터가 올바르게 작동하는지 확인합니다. 자세한 사항은 http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43에서 얻어지고, 일 할 수 있습니다전자 필수적인 단계는 아래에 설명되어 있습니다. <ol><li> 약 5 PSI (4.5 ~ 5.5 범위)에 칼집 밸브 압력을 설정합니다. </li><li> 그 칼집 유체 유량이 적절 확인 디스펜서 아래에 15 ML 원뿔 튜브를 배치, 칼집 밸브를 켜고 분류기 밸브를 해제하십시오. 60 초 동안 디스펜서 아래에 튜브를 잡습니다. 튜브의 볼륨은 9 ~ 10 ㎖를해야한다. 가이 범위를 벗어나면, 그에 따라 칼집 밸브의 압력을 조정한다. </li><li> (단계 3.2로 설정) 그 칼집 유체 유량이 40 μm의 조정 입자를 사용하여 정렬 속도를 테스트 정확한 정렬을 보장하기 위해 허용 할 것이다 : </li><li> 칼집 밸브를 끄십시오. 저수지 제어 입자 용액의 25 ML을 추가합니다. </li><li> 칼집 밸브, 샘플 밸브를 켭니다. </li><li> 컴퓨터 소프트웨어에서 &quot;제어 입자 모드&quot;로 이동하여 취득을 클릭합니다. </li><li> 입자 유량의 폭을 근사 TOF (비행 시간)과 함께, ~ 5-8 입자 ​​/ 초 있는지 확인입자의 40 μm의. 이러한 TOF는 하나의 40 μm의 개체가 한 번에 통과되어 있음을 나타냅니다. 값이이 범위를 벗어난 경우에, 그에 따라 (위에서 아래 방향)의 설정을 조정한다. </li></ol> 4. Noncolonized 웜 대 식민지 소트 <ol><li> M9를 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 벌레를 씻어. 어른 벌레가 중력에 의해 튜브의 바닥에 가라 상층 액을 제거 할 수 있습니다. 신선한 M9와 튜브를 입력합니다. 이 과정을 3 - 4 배를 반복합니다. 이 애벌레의 큰 비율뿐만 아니라 여분의 박테리아를 제거하고 약 10 분 소요됩니다. </li><li> 부드럽게 혼합 작은 파문 바 wormsorter 저수지에 벌레를 추가합니다. </li><li> 200에 600에 녹색 PMT를 설정하고 빨간색과 노란색 PMT에 의해 초기 신호 이득을 조정합니다. </li><li> 설정을 조정하기 위해 데이터를 수집 시작한다. </li><li> 초당 25 ~ 30 이벤트 (벌레)의 일종 속도에 대한 목표로하고 있습니다. 개수 비율이 너무 높으면, 따라서 M9와 저장소 내에 웜 희석. 속도가에있는 경우O 저, M9의 작은 부피에 더 많은 벌레를 추가합니다. </li><li> 실험 noncolonized 웜 대 식민지의 매우 엄격한 분리를 요구하는 경우, &quot;우연의 일치 확인&quot;을 &quot;순수&quot;로 설정합니다. 이 경우에 두 물체가 서로 너무 가깝게 발생하거나 동일한 드롭에서, 기계는 오히려수록보다 강하를 거부 것을 보장한다. </li><li> 관심의 인구를 정렬 크기 (어른 벌레를 구하는) 및 (noncolonized 낮은 정착을 위해, 즉 높은) 형광 강도를 나타내는 축 주위에 문을 그립니다. 형광 게이팅의 값은 경험적으로 결정해야합니다. </li><li> 벌레를 정렬 시작 정렬 밸브를 엽니 다 벌레를 수집하는 멀티 웰 플레이트 또는 디스펜서 아래 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 정렬 된 인구가 관심의 인구입니다 현미경으로 확인하기 위해 동물의 작은 인구를 수집합니다. 그렇지 않은 경우, 그에 따라 게이트의 매개 변수를 조정 및 시료 채취를 계속합니다. </li></ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리가 설명하는 방법은 웜과 그 환경 사이의 상호 작용을 수행하기 위해, 웜 외부 기관의 형광 라벨을 활용합니다. 우리는 선물의 경우, 분리는 병원체의 라벨을 기준으로 한없이 (또는 빛) 부하를 가진 사람에서 무거운 병원체 부하 별도의 웜을 사용 하였다. 이후 유전자 발현 분석은이 병원균 부하 독립적 이었다는 것을 건의하는 두 그룹 사이의 면역 반응에 차이를 찾을 수 없습니다. 반응을 개시 신호가 물리적으로이 신호가 PAMP 될 수 있다는 것을 제안 아니라 분비되지 않고, 세균과 연관된 것으로 밖에 도시 하였다. 함께,이 결과는 PAMP 인식 C.에서 면역 반응을 개시하는 역할을 가설을지지 엘레 19. 상기 선별 프로토콜의 하나의 장점은 모두 정착 및 noncolonized 웜은 단일 모집단으로부터 격리되어있다. 일이다 noncolonized 대 식민지가되는 동물의 최적 분포와 인구를 가진에 따라 달라집니다. 우리는 발견 그...

자동 웜 정렬은,이 ​​튜브에 곧게 통과 (일반적으로 기자 단백질의 유전자 발현에 의해 제공) 웜에 형광 신호를 측정하여 운영 리디렉션으로 Collection 튜브 /도 또는 폐기물 용기에 따라 수 많은 FACS처럼 연구원 1로 설정 매개 변수를 게이팅. wormsorter은 여러 가지 방법으로 연구를 촉진 할 수있다; 분석 도구로서 채용하는 예는 거의 1000 유전자 2 ​​프로모터 활성의 시공간적 패턴을 따라 연구이다. 그러나 wormsorter의 주요 용도는 표적 유전자의 발현 수준 또는 웜 3-5의 축을 따라 형광 단백질의 지역화 다음, 유전 화면이다. 여기에서, 우리는 찬란 태그 병원체에 의해 웜의 식​​민지 다음의, wormsorter에 대한 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이와 함께 도구로 우리는 pathog 사이의 관계에 초점을 맞춘식민지 / 부하와 면역 반응 도중에 웜에 면역 반응의 개시를 담당하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재까지 연구의 거의 모든 생물에서, 미생물 병원체에 타고난 면역 반응의 시작은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 인식에 따라, 및 / 또는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠) 6,7. 미생물의 세포벽의 편모, 또는 지질 이중층 (6)의 구성 요소를 포함 할 첫 번째 보존되어 미생물의 구조, 두 번째는 모두 해제 분자 (예를 들면 ATP 8) 변경, 단백질이나 변형 된 세포 과정 9,10의 다른 마커를 포함한다. 신호의 두 가지 유형은 특정 패턴에 따라 분자의 결합이 보호 반응으로 이어지는 일련의 사건을 활성화 패턴 인식 수용체 (PRRS)로 지정 단백질에 의해 인식됩니다. C.에게 엘레 tracta으로 매우 유용했습니다BLE 모델 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 측면을 해부하지만, 잘 이해되지 않는 한 가지 면역 반응이 웜에 시작하는 방법입니다하십시오. 다른 생물의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 orthologous하는 추정 수용체​​ 중에 PAMPS을 바인딩 표시되지되었고, 다른 생물의 면역 반응에 대한 중요한 있습니다 PRRS의 orthologs 많은 웜 병원체 반응에 놀라 울 정도로 제한된 기여를 보여 저항. 예를 들어, 그람 양성 병원균에 저항하기위한 필수적인 초파리 유료 수용체는, C로 표시된다 나타내는 데이터와 함께 있지만 다른 테스트 그람 음성 또는 양성 병원균 (11, 12)에서, 그람 병원체 살모넬라 균 Typhimurium (11) 보호에 기여한다. 이러한 관측 단독 상동, TOL-1에 의해 엘레 그 면역 반응 세포 단백질 번역의 시간을 방해에 의해 유도 될 수있다지도 일부가 제안하는 그 C. 엘레는 주로 감쇠 9,13,14를 감지합니다. 그럼에도 불구하고, 면역 반응을 유도하는 죽은 병원균의 능력을 설명하는 보고서는 PAMP 바인딩 C.에있는 병원체의 인식에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 엘레 (15, 16). 나이 동기화 유 전적으로 동일한 C의 면역 반응에 초점을 맞추고 이전 작업 elegans의 인구는 세균 그람 음성 병원균 녹농균에 의해 장내 정착에 큰 개인의 다양성을 보여 주었다. 그러나, 전사 프로파일 링 연구는 하나의 엔티티 (17, 18) 이러한 가변 - 식민지 인구를 처리. 이 변동성을 활용, 우리는 GFP - 표현 P.에 노출 예쁜 꼬마 선충의 차별적 식민지 인구를 분리하는 자동화 된 wormsorter을 집중 프로토콜을 개발 녹농균. 다르게 - 식민지 인구에서 유전자 발현을 faci 검사병원체로드 (및 관련 손상) 및 면역 반응과 C.의 병원체 인식에 대한 새로운 통찰력을 제공 사이의 관계 litated 평가 엘레 19. 우리는 어떤 찬란 병원체에 감염된 웜을 정렬에 적용 할 수있는 프로토콜을 설명 아래. 잠재적 인 사용자에게 그것을 정리 될 필요 벌레의 수는 사용상의 후속 분석 및 프로토콜의 특성에 의존한다는 것을 주목해야한다. 예를 들어, 마이크로 어레이 유전자 발현 분석의 경우,&gt; 1000 웜은 표준 프로토콜을 사용하는 경우, 충분한 RNA를 구하는 것이 요구되지만, 증폭을 채택한 경우 ~ 100 웜 충분할, 소재의 신속한 수집을 허용하고, 따라서 스트레스를 최소화 벌레.

<table><tbody><tr>집에서 <td></td><td>준비한</td> <td>M9 버퍼</td><td>wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr>집에서 <td></td><td>준비한</td><td>계란 준비 용액</td><td>물 50ml; 표백제 40ml; 집에서</td></tr><tr><td></td><td>준비</td>한 10N 수산화나트륨<td>NGM 플레이트</td> 10ml 집에서 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>준비한 wormbook.org SKP 플레이트에서 레시피NGM과 동일한 레시피: 0.25% 대신 0.35% 펩톤,</td></tr> <tr><td>제어 테스트 입자</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

의 자동 분리<em&gt; c. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

wormsorter이 예쁜 꼬마 선충의 연구에 사용되는 FACS 기계와 유사한 악기, 일반적으로 형광 기자의 식을 기반으로 웜을 정렬합니다. 여기에서, 우리는 GFP - 표현 병원체에 의한 식민지 자신의 정도에 따라 벌레를 정렬,이 악기의 다른 사용을 강조 표시합니다. 이 새로운 사용은 우리가 웜 소장과 면역 반응의 유도의 식민지 사이의 관계를 해결 할 수있었습니다. 동안 C. 다른 병원균에 elegans의 면역 반응은이를 시작 무엇 여전히 알 수없는, 문서화되었습니다. (상호 배타적이지) 두 가지 가능성이 병원체 - 관련 분자 패턴을 인식, 감염에 의한 손상을 감지합니다. 두 가지 가능성을 구분하기 위해 병원체에 노출이 원인이되는 손상으로부터 해리해야합니다. 그램-N 광범위 - 식민지가 된 웜의 wormsorter 활성화 분리식민지 유사하게 노출 된 웜 가능성이 병원균 부하로 인한 손상,, 그러나, 또는 가장자리와를 egative 병원체 녹농균,. 이러한 구별 인구 병원체로드 전사 및 면역 반응의 유도와의 관계를 평가하기 위해 사용되었다. 결과는 두 가지가 병원체 인식의 가능성을 지원 해리되도록 제안한다.

나이와 일치하는 경우, 유 전적으로 동일한 C. 엘레은 P.에 노출되어 녹농균은 넓은 분포는 식민지 (그림 1A)의 수준에서 관찰된다. 식민지 웜 noncolonized의 효율적인 분리 (그림 1B) 달성 할 수있다 여기에 설명 된 프로토콜의 도움으로. noncolonized 웜과는 달리, 식민지 웜은 부진 감소 배변 19과 같은 손상의 징후를 보여줍니다. 후자는 벌레가 P. 식민지 이유가 될 수있다 aeruginosa에 어려움이 감염을 삭제있다. 이 noncolonized로 분류 벌레가 이전에 정착되지 않은 것을 제안 설명 된 프로토콜에 대한 직접적인 영향을 미칠 수있다. 바로이 주장이 올바른지 여부를 테스트하기 위해, 손으로 수확 식민지 웜은 정렬 실험에서와 유사한 세척 단계를 실시하고 그 후 형광 현미경으로 관찰 하였다; 만 56분의 4는 병원체를 삭제. 따라서 가능성 번째입니다...

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

다음 실험의 전반적인 목표는 *C. elegans*에서 군락 형성 및 그와 관련된 손상이 선천성 면역 반응의 개시에 기여하는 바를 평가하는 것입니다. 이는 동기화된 젊은 성체 *C. elegans* 집단을 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 *Pseudomonas aeruginosa*에 노출시켜, 병원균에 의해 다양하게 군락이 형성된 벌레 집단을 생성함으로써 달성됩니다. 세척 후, 서로 다르게 군락이 형성된 벌레 집단은 완전 군락 형성 벌레와 비군락 형성 벌레라는 두 가지 극단적인 사례에 집중하여 순수 집단으로 분리됩니다.다음으로, 이 개체군에서 RNA를 추출하고 비병원성 e coli에서 성장한 벌레와 비교하여 면역 유전자 발현을 평가합니다. 면역 반응과 군락 형성 사이의 관계를 조사하기 위해, C. elegans의 p arosa에 대한 선천성 면역 반응이 병원균의 군락 형성으로부터 분리될 수 있음을 보여주는 결과가 얻어집니다. C. elegans의 면역 반응 개시를 연구하는 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 벌레 개체군의 감염 가변성을 해결하여, 감염 과정의 서로 다른 측면들을 세밀하게 분석할 수 있게 한다는 점입니다.이 방법은 선충의 선천성 면역에 관한 핵심적인 질문들, 예를 들어 선천성 면역 반응 개시의 근거가 무엇인지 등을 고처리량 방식으로 규명하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 다양한 유전적 또는 환경적 조작이 병원체 군집 형성 저항 능력에 어떤 영향을 미칠까요? 먼저, 많은 수의 선충이 성체 단계에 도달할 때까지 여러 개의 선충 배양 배지 또는 E. coli 박테리아가 도말된 NGM 플레이트에서 선충을 배양하십시오.그 다음, 동기화된 배양액을 얻기 위해 성체 동물을 알 준비 용액(egg prep solution)으로 처리합니다. 이어서, 박테리아가 도말된 여러 개의 60mm NGM 플레이트에 플레이트당 약 150~200개의 알이 되도록 분주합니다.수천 마리의 벌레를 얻으려면 최소 15~20개의 플레이트가 필요합니다. 선별 실험을 위해 더 많은 수의 벌레가 필요한 경우, 사용자는 플레이트당 더 많은 알이 포함된 더 큰 직경의 플레이트를 사용하여 규모를 확대해야 합니다. 플레이트를 20 °C에서 이틀 동안 배양하여 벌레가 L4 또는 청년 성체 단계에 도달할 때까지 기다립니다.알 준비 다음 날, 항생제가 포함된 2mL의 Kings B 배지에 GFP 발현 POSA 배양액인 PA 14 GFP를 접종합니다. 배양액을 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양합니다. 다음 날, PA 14 GFP 배양액을 각 150mm 페트리 접시에 분석에 필요한 만큼의 slow killing 플레이트에 도말합니다.포화 배양액 75~100 µL를 피펫으로 취해 고르게 도말합니다. 멸균된 유리 도말기를 사용하여 플레이트를 37 °C에서 20~24시간 동안 배양합니다. PA 14 GFP가 포함된 플레이트를 배양기에서 꺼내 실온까지 식힙니다.한편, NGM 플레이트에서 배양된 벌레를 수집하려면 플레이트를 덮을 정도의 소량의 M nine 완충액을 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 회전시킨 후 액체를 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 벌레가 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 과량의 액체를 제거하고 벌레를 최소량의 액체와 함께 PA 14 GFP 플레이트로 옮깁니다. 150 millimeter 플레이트를 사용할 때, 한 플레이트당 수백 마리의 벌레를 배치할 수 있습니다.p arosa에 노출된 성체 초기 단계의 충들을 위해 플레이트를 25 °C에서 18~21시간 동안 배양하십시오. 이 시간 범위는 샘플 분류를 수행하기 전, 군락 형성 동물과 비형성 동물이 최적으로 분포되는 시기입니다. 샘플 분류 전 기기가 제대로 작동하는지 확인하십시오. 필수 단계는 여기에 요약되어 있으며, 자세한 내용은 온라인에서 확인하실 수 있습니다.시스 유체 유속이 적절한지 확인하기 위해 시스 밸브 압력을 약 5 PSI로 설정하십시오. 디스펜서 아래에 15 mL 원추형 튜브를 놓으십시오. 시스 밸브를 켜고 소터 밸브를 끄십시오.디스펜서 아래에 튜브를 60초 동안 유지합니다. 튜브 내의 부피는 9~10 mL가 되어야 합니다. 이 범위를 벗어난 경우.정확한 소팅이 가능하도록 시스 밸브 압력을 적절히 조절하여 시스액의 유량(flow rate)을 맞춥니다. 먼저 시스 밸브를 끄고 소팅 속도를 테스트합니다. 그런 다음 리저버에 약 25 milliliters의 컨트롤 파티클 용액을 추가합니다.컴퓨터 소프트웨어에서 쉬스 밸브(sheath valve)와 샘플 밸브를 켭니다. 입자 제어 모드(control particle mode)로 이동하여 acquire를 클릭합니다. 입자 유속이 초당 약 5~8개 입자이며, 비행 시간(time of flight)이 40 µm 입자의 너비와 유사한지 확인합니다.이를 통해 한 번에 하나의 40 micron 물체만 통과하도록 보장할 수 있습니다. 수치가 이 범위를 벗어나는 경우, 그에 맞게 설정을 조정하십시오. M nine 완충액을 사용하여 벌레를 15 milliliter 원뿔형 튜브로 세척하고, 성체 벌레가 중력에 의해 튜브 바닥으로 가라앉도록 둔 후 상층액을 제거하십시오.튜브에 신선한 M nine 버퍼를 채웁니다. 이 과정을 3~4회 반복합니다. 이 과정은 과잉 박테리아뿐만 아니라 많은 수의 유충을 제거하며, 약 10분이 소요됩니다.작은 교반 바가 천천히 회전하고 있는 웜 소터(worm sorter) 저장조에 벌레를 넣습니다. 녹색 광전자 증배관은 600으로, 적색 및 황색 광전자 증배관은 200으로 설정하여 초기 신호 이득을 조정합니다. 설정을 조정하기 위해 데이터 수집을 시작합니다.초당 25-30건의 이벤트 또는 벌레가 분류되도록 조절하십시오. 분류 속도가 너무 빠를 경우, 리저버 내의 벌레를 M nine으로 희석하십시오. 그에 따라 버퍼를 조정하십시오.분리 속도가 너무 낮으면 M9 소량에 담긴 벌레를 더 추가하십시오. 만약 실험에서 군집 형성 벌레와 비군집 형성 벌레의 매우 엄격한 분리가 필요하다면, 일치 확인(coincidence check) 설정을 'pure'로 설정하십시오. 이렇게 하면 두 객체가 서로 너무 가깝게 위치하거나 동일한 드롭렛(drop) 안에 있을 때 기기가 해당 드롭렛을 거부하게 됩니다.관심 있는 개체군을 분류하기 위해 수집하는 대신, 크기와 형광 강도를 나타내는 축 주변에 게이트를 설정하십시오. 형광 게이팅 값은 실험적으로 결정해야 합니다. 다음으로, 웜을 수집할 수 있도록 디스펜서 아래에 멀티웰 플레이트나 페트리 접시를 배치하십시오.그런 다음 정렬 밸브를 열어 벌레 정렬을 시작합니다. 소량의 개체군을 수집하여 현미경으로 정렬된 개체군이 목적한 개체군인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 게이팅 파라미터를 적절히 조정하고 샘플 수집을 계속합니다.GFP를 발현하는 P. arosa에 노출된 유전적으로 동일한 연령대의 sea elegance는 군락 형성 수준이 넓게 분포하는 것으로 나타났으며, 웜 분류기(worm sorter)를 사용하여 군락이 형성되지 않은 웜과 형성된 웜을 효율적으로 분리하였습니다. 군락이 형성되지 않은 웜과 달리, 군락이 형성된 웜은 활동성 저하 및 배변 감소와 같은 뚜렷한 징후를 보입니다. 후자의 특성은 P. arosa에 의해 군락이 형성된 웜이 감염을 제거하는 데 어려움을 겪는 원인이 될 수 있습니다.웜의 군락 형성 상태와 관계없이 네 개의 유전자가 P arosa 노출과 유사하게 유도되었으며, 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 이들 유전자의 발현을 측정하였습니다. 이 네 개의 유전자는 C. elegans의 면역 반응의 일부로 알려져 있습니다. Lys two는 라이소자임을 인코딩하며, 특성을 알 수 없는 두 개의 유전자는 특히 감염에 반응하는데, 그중 하나는 감염 저항성에도 기여하며, PGP five는 중금속 스트레스뿐만 아니라 감염에도 반응합니다.이 결과는 군락 형성 및 그와 관련된 손상이 면역 반응에 필수적이지 않다는 기존의 발표 결과들을 뒷받침합니다. 그 대신, 병원체 관련 분자 패턴이 신호로 작용한다는 점을 시사하며, 광범위한 손상을 겪지 않을 것으로 예상되는 비군락 형성 동물에서 PGP five가 유도된다는 데이터는 C. elegans의 면역 반응과 일반적인 스트레스 반응을 조절하는 조절 프로그램이 서로 중첩되어 있음을 시사합니다.이 방법은 sea elegance의 면역 반응 개시에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있으며, 감염 과정 외에도 환경 조건이나 유전자 조작이 군락 형성 또는 서로 다른 병원체 간의 경쟁에 미치는 영향과 같은 다른 질문에도 적용될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 대사물질이나 화학물질의 섭취 또는 격리와 같이 선충과 환경 사이의 다른 상호작용을 추적하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 통해 분리된 관심 집단은 유전자 발현 외에도 다양한 목적으로 활용될 수 있습니다.여기에는 후속 감염 또는 생존 분석이나 행동 실험을 위해 살아있는 동물을 수집하는 과정이 포함됩니다. 이 기술은 병원체 노출 및 군락 형성이 선천성 면역과 해양 생태에 미치는 영향을 연구하는 유용한 수단을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

출처: Petersen, C. 외, 모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물군 분리 및 특성화. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 Caenorhabditis elegans와 관련된 박테리아 종의 분리와 배양 과정을 보여줍니다. 구슬 기반 C. elegans 용해와 선택적 배양을 통해 다양한 미생물 균주를 분리하여 추가 분석을 할 수 있습니다.

카에노르합디티스 엘레간스 관련 박테리아의 분리 및 배양

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 C. elegans 를 이용한 생존 분석으로 에어 로모나스 병태를 모델링하며, 경구 섭취가 장내 감염과 사망률을 유발하여 살아있는 숙주 시스템에서 박테리아의 병원성을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다.

생존 분석법을 이용한 C. elegans의 에어로모나스 병태 모델링

출처: Le, T. A. N . 외, 박테리아 및 화학물질이 카 에노르하브디티스 엘레간스의 장 투과성에 미치는 영향 측정. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 Pseudomonas aeruginosa에 노출된 C. elegans의 장 투과성을 정량화하기 위한 형광 기반 분석 방식을 보여줍니다. 대장균을 먹인 대조군과 비교하면, 병원체 처리된 벌레는 체강으로의 형광체 누출이 증가하여 상피 장벽 손상을 나타냅니다.

세균 노출 후 C. elegans 의 장 투과성 평가

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 병원체 식민화에 따른 선천성 면역 반응을 웜소터로 분석하는 방법을. 이 기술은 감염 변이성을 해결하여 면역 기전 연구에 활용됩니다.

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