식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

이 실험 절차의 전반적인 목적은 식물 단백질 복합체에 관여하는 단백질의 번역 후 수정을 확인하는 것입니다. 먼저 관심 단백질에 태그를 붙여 식물에 일시적으로 또는 안정적으로 발현시킵니다. 그다음 식물 조직에서 총 단백질을 추출하고, 관심 단백질을 면역침전시킵니다. 이어서 면역침전된 단백질을 아크릴아마이드 겔 상에서 분리한 후, 관심 있는 겔 밴드에서 단백질을 추출하고 소화시킵니다.

이제 단백질 샘플을 질량 분석법으로 제출하십시오. 궁극적으로 질량 분석 결과는 인산화와 같은 번역 후 변형의 동적인 변화를 검출할 수 있습니다. 키나아제와 기질을 in vitro에서 함께 배양하는 다른 방법들과 달리, 이 방법은 planter에서 단백질을 발현시킵니다.

따라서 어떤 키나아제가 인산화에 관여하는지 알 필요가 없습니다. 이 방법은 스트레스, 환경 변화 또는 병원균 인식에 반응하여 신호가 어떻게 전달되는지와 같은 식물 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 활성화된 저항성 단백질 복합체의 인산화 부위 식별 외에도, 이 방법은 모든 식물 단백질 복합체의 모든 번역 후 변형에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 다량의 추출물을 다루고 하루에 더 많은 프로토콜 단계를 수행하는 것에 익숙하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다. 일시적 발현(transient expression)을 위해 agrobacterium tohin 균주를 정지기(stationary phase)까지 배양하십시오. 3000 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 agro bacteria를 회수하십시오.

펠렛을 침투 버퍼(infiltration buffer)로 재현탁합니다. 이제 4주 된 NCOA hamana 식물에 1mL 무바늘 주사기를 사용하여 수동으로 또는 0.02% 계면활성제(surfactant)를 이용한 진공 방식으로 아그로박테리아(agro bacteria)를 침투시킵니다. 침투 후 2~5일이 지나면 됩니다.

침투시킨 잎을 수확하여 액체 질소로 급속 냉동한 후 -80°C에서 보관하십시오. 그다음 막자와 막자사발을 사용하여 식물 조직 20g을 액체 질소와 함께 갈아내고, 20g의 조직에 차가운 buffer C 80mL를 추가합니다. 잘 섞은 후 얼음 위에서 해동하십시오.

이제 최대 속도로 10초씩 3회 분쇄하여 균질화합니다. 균질액을 여과한 후 4°C에서 30,000 Gs로 30분간 원심분리합니다. 그동안 적절한 어피니티 매트릭스 100 µL에 차가운 블로킹 버퍼 D 500 µL를 가해 4°C에서 5분간 처리하고, 차가운 버퍼 D 1 mL로 3회 세척합니다. 다음으로, 잎 추출물의 상층액을 제거하고 0.45 µm 시린지 필터를 통과시킵니다.

얼음 위에서 새 튜브에 여과합니다. 조추출물을 소분합니다. 면역 블롯용으로 사용합니다.

5X SDS 페이지 로딩 버퍼를 추가하고 볼텍싱한 후, 샘플을 가열하여 변성시킵니다. 버퍼 D에 현탁된 어피니티 매트릭스 50 µL를 각 튜브에 추가합니다. 4 °C에서 완만하게 회전시키며 2시간 동안 인큐베이트한 다음, 원심분리하여 어피니티 매트릭스를 펠렛화합니다.

그다음, 면역 블롯 분석을 위해 결합되지 않은 추출물의 일부를 분취합니다. 튜브 바닥에 약 500 µL 정도만 남기고 나머지 동일한 용액은 폐기합니다. 와이드 보어 팁을 사용하여 슬러리 용액을 재현탁합니다.

두 튜브의 혼합 슬러리 용액을 하나의 1.5 milliliter 튜브에 합칩니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 5초간 세 번 펄스 작동시켜 어피니티 매트릭스를 침전시키고, 1 milliliter의 차가운 buffer D로 3~5회 세척한 후 상층액을 제거합니다. 주사기 바늘로 과잉의 buffer D를 제거하고, 지속적으로 흔들어주면서 200 microliters의 적절한 용리 버퍼로 용리합니다. 세 개의 EIT를 하나의 튜브에 모읍니다.

그런 다음 30 µL의 흡착 수지를 사용하여 단백질을 농축하고 볼텍싱합니다. 5분간 방치하여 수지를 침전시킨 후, 상층액을 제거합니다. 침전된 친화성 매트릭스 또는 흡착 수지 볼텍스에 1X SDS page 로딩 버퍼 50 µL를 첨가하고, 히팅 블록 원심분리기를 사용하여 80~100 °C에서 10분간 가열합니다.

끓인 친화성 매트릭스를 10,000 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 면역 차단을 위해 상층액 5 µL를 분취하고, 다른 분획들과 함께 10 cm 길이의 SDS-PAGE 젤에서 전기영동하여 질량 분석법으로 인산화된 단백질을 분리하고 확인합니다.

남은 45 µL를 SDS-PAGE 젤에 로딩하여 염색합니다. colloidal Coomassie Brilliant Blue를 사용하여 SDS-PAGE 젤을 염색합니다. 그 후, 다량의 물로 충분히 세척하여 젤의 색을 뺍니다. 가급적이면 하룻밤 동안 진행하십시오.

이제 깨끗한 메스로 겔에서 관심 밴드를 절제하고, 겔 조각을 2~4 mm 크기의 정육면체로 자른 뒤 샘플을 튜브로 옮깁니다. 겔 조각들을 탈색될 때까지 50% acetonitrile과 50 mM ammonium bicarbonate로 세척합니다. 그 후 피펫으로 용액을 제거합니다.

겔 조각이 제거되지 않도록 주의하십시오. 100% acetonitrile로 5분 동안 샘플을 탈수시킨 후, 유리 액체를 제거합니다. 그 다음, 10 millimolar DTT를 사용하여 단백질 이황화 결합을 환원시키고, 56 °C에서 흔들어주며 30~45분 동안 배양한 뒤, 시스테인 잔기를 알킬화하기 위해 다시 유리 액체를 제거합니다.

상온의 암소에서 55 millimolar chloro Acetamide를 첨가하여 20~30분 동안 반응시킵니다. 여분의 액체를 제거한 후, 50%Aceto nitrile로 겔 조각을 10분 동안 두 번 세척합니다. 여분의 액체를 제거합니다.

이제 100% acetonitrile로 5분 동안 겔 조각을 탈수시킨 후, Triptych Digest를 위해 유리 액체를 제거합니다. trypsin 작동 용액 40 µL를 사용하며, 겔 조각이 충분히 잠길 정도의 소화 버퍼에서 10분 동안 겔 조각을 재수화시킵니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 소화를 진행하고, 5% formic acid로 5~10분 동안 초음파 처리하여 겔 조각에서 펩타이드를 추출합니다.

그런 다음 상청액을 새 튜브로 옮기고, 동결 건조 또는 진공 농축기로 펩타이드를 건조시킨 후, 샘플을 -20 °C에서 보관합니다. 이 실험은 nacoa hamana로부터 P-R-F-P-T-O 키나아제 복합체를 정제합니다. 35 SPTO를 발현하는 형질전환 NACOA hamana에 35 SPRF flag를 일시적으로 형질전환시켰으며, Anti-Flag M two aros를 사용하여 복합체를 면역침전시켰습니다. 면역 블롯은 표적 PRF 단백질의 효율적인 면역침전과, 항체 검출 및 질량 분석 분석 결과에서 나타난 바와 같이 PTO 및 상호작용하는 이펙터 단백질이 PRF와 함께 공동 정제되었음을 보여줍니다.

여기서는 Anti-Flag를 사용하여 PTO 단백질을 표적으로 삼는 전략을 세웠습니다. PTO 인산화 부위를 식별하기 위해 전략을 변경하였습니다.

PRF 복합체와 유리 형태를 모두 포함하는 전체 PTO 단백질 양을 Anti-Flag M2 항체로 면역 침전시킨 후 SDS page 분획, 겔 내 트립신 소화 및 질량 분석법으로 분석한 결과, 전체 서열의 약 80%에 해당하는 PTO 펩타이드가 확인되었습니다. 흥미롭게도, PTO 펩타이드에서 일련의 단일 인산화 부위가 식별되었습니다. 이중 인산화 부위는 이펙터 단백질이 존재할 때만 식별되었다는 점에 유의하십시오.

단백질 복합체의 구성 성분을 확인하고 표적 단백질의 번역 후 변형을 검출하기 위해서는 충분한 양의 식물 단백질을 확보하는 것이 중요합니다. 질량 분석법으로 인산화와 같은 변형을 매핑하려면 상당한 양의 단백질이 필요하므로, 본 절차를 수행한 후 겔 상에서 최소한 희미한 밴드라도 확인되어야 함을 유념하십시오. 면역 복합체 활성화가 어떻게 기능적 면역으로 이어지는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 복합체 성분 확인과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

유기 완충액, 박테리아 및 면도날 BBL을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 장갑과 실험복을 착용하는 등의 예방 조치를 취하시기 바랍니다.