식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

이 절차의 전반적인 목표는 식물 단백질 복합체에 관여하는 단백질의 번역 후 변형을 식별하고, 먼저 플라나에서 일시적 또는 안정적으로 발현되는 관심 태그 단백질을 식별하는 것입니다. 그런 다음 식물 조직에서 총 단백질을 추출하고 면역이 관심 단백질을 침전시킵니다. 다음으로, 아크릴아마이드 겔에서 면역 침전 단백질을 분리하고 관심 겔 밴드에서 단백질을 추출하고 소화합니다.

이제 질량 분석을 위해 단백질 샘플을 제출하십시오. 궁극적으로 질량 분석법의 결과는 인산화와 같은 번역 후 변형에서 동적 변화를 감지할 수 있습니다. 기질과 함께 키나아제의 체외 배양과 같은 대체 방법과 달리 이 방법은 파종기에서 단백질을 발현합니다.

따라서 어떤 키나아제가 인산화를 담당하는지 알 필요가 없습니다. 이 방법은 스트레스, 환경 변화 또는 병원체 인식에 대한 반응으로 신호가 어떻게 전달되는지와 같은 식물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화(phosphorylation)의 식별, 활성화된 저항성 단백질 복합체(activated resistance protein complexes)의 식별 외에도, 이 방법은 모든 식물 단백질 복합체의 모든 번역 후 변형(post-translational modification)에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 많은 양의 추출물로 작업하고 하루에 프로토콜의 더 많은 단계를 수행하는 데 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 일시적 발현을 위해 agrobacterium tohin 균주를 고정상으로 성장시킵니다. 3000Gs에서 5분 동안 원심분리하여 어그로 박테리아를 수확합니다.

펠릿과 침투 완충액을 다시 현탁시킵니다. 완충기. 지금 침투합니다. 4주 된 NCOA 하마나는 침투 후 2-5일 동안 1밀리리터 바늘 없는 주사기를 사용하여 수동으로 또는 0.02% 계면활성제로 진공 상태에서 농업 박테리아를 심습니다.

침투 한 잎, 잎을 수확하고 액체 질소에 얼려 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로 모르타르와 절구를 사용하여 20g의 식물 조직과 액체 질소를 80ml의 차가운 완충액 C에서 20g으로 분쇄합니다. 잘 섞어 얼음에서 해동합니다.

이제 최고 속도로 각각 10초씩 3회 버스트하여 균질화합니다. 30, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 GS에 균질산염 그리고 분리기를 거르십시오. 한편, 500 마이크로 리터의 저온 차단 버퍼 D에서 섭씨 4 도에서 5 분 동안 적절한 친화력 매트릭스 100 마이크로 리터에 1 밀리리터의 콜드 버퍼 D.Next, 잎 추출물의 상층을 제거하고 0.45 마이크로 미터 주사기에 통과시킵니다.

얼음 위의 새 튜브에 여과합니다. 조잡한 추출물을 분취하십시오. 면역 오점의 경우.

5개의 XSDS 페이지 로딩 버퍼 와류를 추가하고 샘플을 끓여 변성시킵니다. 버퍼 D에 현탁된 친화도 매트릭스 50마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2시간 동안 부드럽게 회전하며 배양하고 친화력 매트릭스를 펠릿으로 만들기 위해 원심분리기를 사용합니다.

그런 다음 면역 블롯을 위해 결합되지 않은 추출물의 부분 표본을 취합니다. 나머지 제정신은 버리고 튜브 바닥에 약 500 마이크로 리터를 남겨 둡니다. 넓은 구멍 끝으로 슬러리 용액을 다시 현탁시킵니다.

두 튜브의 혼합 슬러리 용액을 단일 1.5 밀리리터 튜브에 모읍니다. 친화력 매트릭스를 침전시키고 1밀리리터의 저온 완충액 D로 3-5회 세척한 후 상층을 제거하기 위해 탁상용 원심분리기를 사용하여 5초 동안 3회 펄스를 3회 펄스합니다. 주사기 바늘로 여분의 완충액 D를 제거하고 지속적인 흔들림에서 200마이크로리터의 적절한 용리 완충액으로 용리합니다. 하나의 튜브에서 세 개의 EIT를 당깁니다.

그런 다음 30 마이크로 리터의 흡수 수지 와류를 사용하여 단백질을 농축하십시오. 5 분 동안 서서 수지를 침전시키고 상층을 버리십시오. 침전된 친화성 매트릭스 또는 흡수 수지 와류에 50마이크로리터의 XSDS 페이지 로딩 버퍼를 추가하고 열 블록 원심 분리기에서 섭씨 80-100도에서 10분 동안 끓입니다.

비등한 친화력 모체는 10, 000에 2 분 동안 수지이다. GS는 면역 블록에 대한 슈퍼넷 5마이크로리터를 분취하고 다른 분획과 함께 10cm 길이의 SDS 페이지에 실행합니다. 질량 분석법에 의한 인산화된 단백질의 분리 및 식별을 위한 겔.

나머지 45마이크로리터를 SDS 페이지 젤 염색에 로드합니다. 콜로이드 kamasi 광채 블루를 가진 SDS 페이지 젤. 그런 다음 젤을 충분한 세척과 물로 가급적이면 밤새 보관하십시오.

이제 깨끗한 메스로 젤에서 관심 밴드를 절제하고 젤 조각을 2-4mm 입방체로 깍둑썰기하고 샘플을 튜브로 옮깁니다. 젤 조각을 50% 아세토 니트릴과 50 밀리몰 중탄산 암모늄으로 얼룩이 질 때까지 세척합니다. 그런 다음 용액을 피펫으로 제거합니다.

젤 조각을 제거하지 않도록 주의하십시오. 100% 아세토 니트릴로 샘플을 5분 동안 탈수하고 유리 액체를 제거합니다. 그런 다음 10 millimolar DTT에서 단백질 이황화물 결합을 줄이고 섭씨 56도에서 30-45분 동안 진탕하면서 배양하려면 유리 액체를 제거하여 시스테인 잔기를 알킬화합니다.

55 밀리몰 클로로 아세트아미드를 어두운 곳에서 실온에서 20-30분 동안 첨가합니다. 유리 액체를 제거한 다음 젤 조각을 50% 아세토 니트릴로 10분 동안 두 번 세척합니다. 자유 액체를 제거하십시오.

이제 100% 아세토 니트릴로 젤 조각을 5분 동안 탈수하고 Triptych Digest를 위해 유리 액체를 제거합니다. 40마이크로리터의 트립신 작업 용액에서 젤 조각을 덮을 수 있을 만큼 충분한 소화 완충액에서 젤 조각이 10분 동안 재수화되도록 합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하여 소화를 멈추고 5% 포름산에서 5-10분 동안 초음파 처리하여 겔 조각에서 펩타이드를 추출합니다.

그런 다음 supernat를 새 튜브로 옮기고 동결 건조 또는 진공 농축기로 펩타이드를 건조시키고 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 본 실험은 nacoa hamana로부터 P-R-F-P-T-O 키나아제 복합체를 정제하고, 35 SPTO를 발현하는 형질전환 NACOA hamana를 35 SPRF flag로 일시적으로 형질전환시키고, 상기 복합체를 Anti-Flag M 2 aros로 면역 침전시켰다. 면역 블롯은 항체 검출 및 질량 분석 분석에 의해 표시된 바와 같이 PTO 및 PRF로 정제된 상호 작용 효과기 단백질 모두의 표적 PRF 단백질의 효율적인 면역침전을 보여줍니다.

여기서 전략은 Anti-Flag로 PTO 단백질을 표적으로 삼는 것이었습니다. 전략이 바뀌었다. PTO 인산화 부위를 확인하기 위해.

PRF 복합체와 자유형을 모두 포함하는 PTO 단백질의 총량은 Anti-Flag M 2 aros로 면역 침전시키고 SDS 페이지 분획, 잉겔 삼부작 분해 및 질량 분광 분석을 실시하여 서열의 약 80%에 걸쳐 PTO 펩타이드를 생성했습니다. 흥미롭게도, PTO 펩타이드에 대한 단일 인산화 부위 세트가 확인되었습니다. 이중 인산화 부위는 effector 단백질이 있는 경우에만 확인되었습니다.

단백질 복합체의 구성 요소를 식별하고 관심 단백질의 번역 후 변형을 검출하기 위해 충분한 양의 식물 단백질을 얻는 것이 중요합니다. 인산화와 같은 매핑 수정에는 질량 분석법에서 합리적인 양의 단백질이 필요하므로 이 절차를 따라 겔에 최소한 희미한 띠가 분명해야 합니다. I와 같은 다른 방법, 복잡한 구성 요소를 식별하여 면역 복합체 활성화가 어떻게 기능적 면역으로 이어지는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

유기 완충제, 박테리아 및 면도기 BBL로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 장갑과 무릎 코트를 착용하는 등의 예방 조치를 취하십시오.