Name: 드로소필라의 온도 선호도 행동과 Circadian 리듬의 설계 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 Drosophila 온도 선호도 행동 분석 방법으로 circadian 리듬 메커니즘을 연구하세요. 이 실험은 신경회로와 분자 메커니즘 규명에 활용됩니다.

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행동 장치의 초기 버전을 개발하는 데 도움을 준 아라빈던 사무엘 박사와 마크 게르쇼 박사와 행동 장치를 수정한 매튜 베이티에게 감사드립니다. 이 연구는 신시내티 아동 병원에서 이사회 그랜트에 의해 지원되었다, JST / PRESTO, Dimes의 행진과 NIH R01 GM107582 F.N.H.

1. 파리 준비
<ol><li>라이트 다크(LD) 실험
	<ol>
<li>12시간/암흑 12시간(LD) 사이클 하에서 인큐베이터(25°C/40-60%의 상대 습도(RH)에서 파리를 올립니다. 인큐베이터의 광강도는 ~500-1,000 럭스입니다.</li>
		<li>24시간 동안 행동 에세이를 완료하려면 두 개의 인큐베이터가 필요합니다. 두 인큐베이터는 ON OFF 기능을 갖춘 프로그래밍 가능한 조명을 가져야 합니다. 그들은 또한 빛에 투과할 수 없는 단단한 문이 있어야합니다(즉, 유리 또는 플렉시 유리 없음). 참고: 한 인큐베이터는 "하루" 인큐베이터로 지정하고 12시간 빛과 12시간 어둡게 LD 주기로 설정해야 합니다. 두 번째 인큐베이터는 "밤"인큐베이터로 지정하고 12 시간 어둡고 12 시간 빛으로 첫 번째의 역으로 설정해야합니다. 야간 인큐베이터는 어둠 속에서 접근 할 수있는 방에 배치되어야하며, 야간 질환을 경험하는 파리는 실험을 위해 쉽게 액세스 할 수 있습니다.</li>
		<li>날밤에 플라이 바이알을 인큐베이터에 놓습니다. 새로 부화된 파리를 분석당 20-30으로 모으고 2-3일 동안 동일한 인큐베이터에 보관하십시오.</li>
		<li>2-3 일 후, 온도 환경 설정 행동 분석에 파리를 사용합니다.<ol>
<li>하루 (Zeitgeber 시간 (ZT) 0-12) 실험의 경우, 하루 인큐베이터에서 파리를 수집합니다.</li>
			<li>행동 실험 직전에 수집된 플라이 바이알을 하루 만에 꺼내십시오.</li>
			<li>야간 (ZT 13-24) 실험의 경우 야간 인큐베이터에서 파리를 수집하십시오.</li>
			<li>행동 실험 직전에 수집된 플라이 바이알을 야간 인큐베이터에서 꺼내 알루미늄 호일로 감싸고 빨간 램프 아래 어두운 방에 상자에 넣습니다. 참고: 야간 실험을 위해 어둠 속에서 온도 기본 설정 행동 분석이 수행되므로 행동 실험이 끝날 때까지 파리에 대한 가벼운 노출을 방지해야 합니다. 참고: 파리는 실험이 일어나는 날에 이산화탄소에 노출되어서는 안됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>일정한 어둠 (DD) 실험
	<ol>
<li>
DD 데이
		<ol>
<li>DD 일 실험에 추가 인큐베이터가 필요하며, 나머지 원고의 "전환" 인큐베이터라고 합니다. 전환 인큐베이터는 어둠 속에서 접근 할 수있는 방에 배치되어야하며, 이러한 방식으로 DD 조건을 경험하는 파리는 실험에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 전환 인큐베이터의 예시 라이트 스케줄은 오후 1시부터 오후 7시까지 켜지고 오후 7시~1시에 조명이 꺼집니다(그림1).</li>
			<li>당일 인큐베이터에서 자란 파리를 수집합니다. 빛이 켜지면 오후 1시에서 7시 사이에 플라이 바이알을 전환 인큐베이터에 놓습니다. 이런 식으로 파리는 오후 7시까지 빛에 제대로 노출되어 빛이 꺼집니다.</li>
			<li>다음날 오후 1시 이전에, 어두운 조건 하에서, 전환 인큐베이터에서 플라이 바이알을 꺼내 알루미늄 호일로 싸서 상자에 넣습니다. 상자를 인큐베이터에 1일 더 보관하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
DD 나이트
		<ol>
<li>빨간 램프 아래 어둠 속에서 밤에 제기 된 파리를 수집합니다. 또는 야간 인큐베이터의 빛이 켜져있을 때 파리를 수집합니다.</li>
			<li>빛이 꺼져도 어둠 속에서 알루미늄 호일로 수집 된 바이알을 감싸고 바이알을 상자에 넣습니다. 상자를 인큐베이터에 2일 더 보관하십시오(그림1B). 참고: 야간 실험을 위해 어둠 속에서 온도 기본 설정 행동 분석이 수행되므로 행동 실험이 끝날 때까지 파리에 대한 가벼운 노출을 방지해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>일정한 빛(LL) 실험
	<ol>
<li>
LL 데이
		<ol>
<li>LL 데이 실험에는 추가 인큐베이터가 필요합니다. 이 인큐베이터는 LL 조건(25°C, 800 럭스)을 유지하며, LIGHT ON은 지속적으로 유지한다.</li>
			<li>당일 인큐베이터에서 자란 파리를 수집합니다. "하루"동안 언제든지 LL 인큐베이터에 플라이 바이알을 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
LL 나이트
		<ol>
<li>야간 인큐베이터에서 자란 파리를 수집합니다. 야간 인큐베이터에서 LL 인큐베이터로 비행 바이알을 전송하여 야간 인큐베이터의 빛이 켜져 있는 동안. 참고: 예를 들어, 밤 인큐베이터에서 오전 7시에 빛이 꺼집니다. 야간 인큐베이터에서 오전 7시 이전에 LL 인큐베이터로 플라이 바이알을 옮기고 4일 동안 LL 인큐베이터에 바이알을 보관하십시오. 참고: LL 조건에서 4일째에, TPR은 아직도 3을지속되는 동안, 운동 활동의 진동은15,16폐지됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 온도 선호도 행동 분석 장치
<ol><li>플렉시 글라스 커버 (29cm x 19.2 cm)(그림 4)를알루미늄 판에 놓습니다.</li>
	<li>플레이트와 덮개 사이의 공기 온도를 모니터링합니다. 6개의 온도 프로브는 차선 중하나(그림 2)내의 커버 내부의 다양한 위치에 부착된다. 참고: 프로브가 알루미늄 플레이트 또는 플렉시글라스 커버를 만지지 않도록 하십시오. 공기 온도는 18-32 °C에서 그라데이션으로 설정해야합니다.</li>
	<li>25°C/65-75% RH로 유지되는 환경실에 장치를 놓습니다. 이 객실은 외부 조명에서 밀봉해야 합니다. 환경실에는 보통 일정한 온도와 습도를 유지하기 위해 팬이 장착되어 있습니다. 참고: 팬의 공기는 기기의 안정적인 온도 그라데이션을 방해할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 우리는 장치를 둘러싼 영역을 덮는 투명 시트를 사용합니다.</li>
	<li>온도계와 습도계를 준비하여 환경실의 온도와 습도를 확인합니다. 참고: 빛은 드로소필라3의온도 선호도에 영향을 미칩니다. 동일한 빛의 강도는 장치에 균일하게 공급되어야 합니다. 우리의 환경 실 조명의 강도는 ~ 800 럭스입니다. 참고: 행동 실험이 완료되면 CO2 탱크에서 연결된 튜브를 놓거나 장치의 상단 구멍 근처에 튜브를 놓아 마취하고 파리를 제거하십시오.</li>
</ol>3. 사용 장치 준비
<ol><li>플레이트 의 표면에 제대로 온도 그라데이션을 설정하기 위해 적어도 30 분 동안 장치를 켭니다(도 3).</li>
	<li>파리가 덮개의 벽이나 천장을 오르는 것을 방지하기 위해 발수제로 행동 장치의 덮개를 코팅합니다. 여분의 발수물을 닦아 25-30 분 동안 덮개를 둡니다.</li>
	<li>알루미늄 플레이트의 응축을 제거합니다. 플렉시글라스 커버를 알루미늄 플레이트에 놓고 6개의 C-클램프(그림2)로고정합니다. 참고 : 필요한 경우 이중 스틱 테이프를 사용할 수 있으므로 커버가 잘 밀봉되는 것이 매우 중요합니다.</li>
	<li>커버를 15분 이상 그대로 둡니다. 알루미늄 플레이트와 커버 사이의 공기 온도 그라데이션은 18-32 °C에서 생성됩니다.</li>
</ol>4. 온도 기본 설정 동작 분석
<ol><li>커버의 각 차선의 중앙에 작은 구멍을 통해 장치의 알루미늄 판과 플렉시 유리 커버 사이의 공간에 파리를적재(그림 2 및 4). 덮개 슬립으로 구멍을 덮어 파리가 탈출하지 못하도록 합니다.</li>
	<li>어두운 조건에서는 환경 실의 모든 조명을 끕니다. 빨간 램프는 파리가 장치에 배치 될 때 사용할 수 있습니다. 행동 실험이 완료될 때까지 빨간색 램프를 제외한 모든 표시등에 파리가 노출되지 않았는지 확인합니다.</li>
	<li>각 평가판에 대해 후속 시험에서 재사용할 수 없는 20-25개의 성인 파리를 사용하십시오. 행동 분석은 30분 동안 수행됩니다. 플래시가 있거나 깜박이지 않고 몇 장의 사진을 찍습니다. 실험 중에 많은 소음이나 갑작스런 움직임을 하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>장치에 있는 6개의 프로브의 온도를 기록합니다. 습도뿐만 아니라 실온에 유의하십시오.</li>
	<li>이산화탄소 가스로 장치의 파리를 마취하고 클램프를 풀고 플렉시 유리 덮개를 제거하고 플레이트에서 파리를 제거합니다. 각 실험 후, 파리는 버려지다. 접시에서 응축이나 습기를 닦아냅니다. 플레이트의 덮개를 교체하고 다음 실험을 준비하기 위해 클램프로 조입니다.</li>
	<li>하루 종일 온도 선호도를 나타내기 위해 24시간 기간은 8개의 시간대, 낮 4개, 밤에는 4개로 나뉩니다. 예를 들어, 이러한 ZT 또는 CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 및 22-24를 사용합니다. 참고: 마스킹 효과로 인한 표현형 변형은 빛이 켜진 직후(ZT0) 또는 OFF(ZT12)가 예상되므로, 이 시간 동안온도 기본 설정 동작(ZT 또는 CT 0-1, 11.5-13 및 23.5-24)을 검사하지 않습니다. 결과가 통계적으로 건전하기 위해서는 각 시간대에서 최소 5번의 시험을 수행해야 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>다음과 같이 온도 그라데이션 을 계산합니다: 가장자리를 따라 플렉시글래스 커버의 위쪽과 하단에 배치되는 두 눈금자에 따라 온도 프로브가 배치되는 위치를 결정합니다(그림2A).</li>
	<li>온도 프로브 사이의 온도 그라데이션은 선형으로 추정됩니다. 온도 프로브의 위치와 해당 기록 된 온도에 따라 그림의 적절한 위치에서 각 정도의 온도를 나타내는 선을 그립니다. 각 도 간격에 있는 파리 수를 계산합니다. 벽이나 덮개 천장에 있는 파리는 제외합니다.</li>
	<li>각 차선의 각 온도 범위에서 파리의 백분율을 계산합니다. 평균 우선 온도는 아래와 같이 각 구간의 파리 및 온도 비율의 제품을 합산하여 계산됩니다. 파리의 % x 18.5 °C + 파리의 % x 19.5 ° C + 파리의 % x 20.5 ° C ....+ 파리의 % x 31.5 ° C + 파리의 % x 32.5 °C.</li>
	<li>각 시간대의 평균 선호 온도를 계산합니다: 온도 기본 설정 동작은 각 시간대(ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 및 22-24) 동안 >5회 수행됩니다. 각 시간대의 평균 선호 온도를 계산하기 위해 각 평가판의 평균 선호 온도가 함께 평균됩니다. s.e.m. 오류 막대는 평가판 사이의 오류와 같습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li>
<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li>
<li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li>
<li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila.%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li>
<li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Thermal+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Therm.+Biol%22%5BJournal%5D)">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li>
<li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li>
<li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+rhythm+of+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li>
<li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li>
<li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li>
<li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li>
<li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li>
</ol>

공개할 것은 없습니다.

여기서, 우리는 온도 선호도 행동 장치의 세부 사항 및 TPR 행동의 분석을 설명합니다. Drosophila는 시계 제어 TPR의 현저하고 견고하며 재현 가능한 특징을 전시합니다. 그러나, 우리의 데이터는 적어도 두 가지 요인, 주변 빛과 나이, 크게 TPR 행동 표현형을 방해한다는 것을 건의합니다.
우리는 빛이 Drosophila의온도 선호도에 크게 영향을 미친다는 것을 관찰합니다. 선호하는 온도의 리듬 변화는 여전히 LD 및 DD3에따라 유지되지만 LD에 보관된 1118 개의 파리가 낮 동안 더 높은 온도를 선호한다는 사실과 일치합니다. 따라서 빛은 circadian 시계와 는 별개로 플라이의 온도 선호도에 영향을 미칩니다. 얼마나 많은 광 강도가 요구되고 어떤 메커니즘이 이 광 의존 온도 선호도를 조절하는지 명확하지 않기 때문에 실험 중에 동일한 광 강도(~500-1,000 lux)를 ...

온도는 유비쿼터스 환경 큐입니다. 동물은 유해한 온도를 피하고 편안한 온도를 추구하기 위해 다양한 행동을 나타낸다. 드로소필라는 견고한 온도 선호도 동작6,7을나타낸다. 파리가 18-32°C에서 온도 그라데이션으로 방출되면 파리는 따뜻하고 추운 온도를 모두 피하고3일아침에 25°C의 바람직한 온도를 선택한다. 따뜻한 온도 센서는 열감각 뉴런의 집합, AC 뉴런, 드로소필라 과도 수용체 전위 (TPR) 채널, TRPA16,9을발현. 저온 센서는 제3 안테나 세그먼트를 타래면 저온 회피6의부족을 야기하기 때문에 제 3 안테나 세그먼트에 위치합니다. 최근에는 TRPP 단백질 브리비도(Brv)가10을확인하였다. Brv는 제 3 안테나 세그먼트에서 발현되고 감기 검출을 중재하기 때문에 Brv는 온도 선호도 행동에 중요한 가능한 감기 감지 분자입니다. 요약하면, 파리는 따뜻하고 차가운 온도를 피하고 선호하는 온도를 찾기 위해이 두 온도 센서를 사용합니다.
포유류는 체온을 조절하기 위해 열을 발생하지만, ectotherms는 일반적으로 주변 온도11에체온을 적응시다. 일부 ectotherms는 그들의 BTR12를통제하는 ectotherms를 위한 전략으로 여겨지는 매일 TPR 행동을 전시하기 위하여 알려진다. 파리가 TPR을 전시했는지 여부를 확인하기 위해 24 시간 동안 다양한 지점에서 온도 선호도 행동 분석을 반복했습니다. 우리는 Drosophila가 매일 TPR을 전시한다는 것을 것을을 발견했습니다, 이는 아침에 낮고 저녁에 높은 및 인간에 있는 BTR의 것과 유사한 패턴을 따릅니다13.
Drosophila에서뇌에는 ~ 150 시계 뉴런이 있습니다. 운동 활동을 조절하는 시계 뉴런은 M과 E 발진기라고합니다. 그러나 흥미롭게도 M과 E 발진기는 TPR을 조절하지 않고 대신 뇌의 DN2 클럭 뉴런이 TPR을 조절하지만 운동 활동은 조절하지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 TPR이 운동 활동과 독립적으로 규제된다는 것을 나타냅니다. 특히, 포유류 BTR은 또한 운동 활동에서 독립적으로 통제됩니다. 쥐에 있는 절제 연구는 BTR이 운동 활동을 통제하는 그보다는 subparaventricular zone 뉴런의 다른 부세트를 표적으로 하는 특정 SCN 뉴런을 통해 통제된다는 것을 보여줍니다14. 따라서, 우리의 데이터는 포유동물 BTR및 플라이 TPR이 진화적으로 보존될 가능성을 고려합니다3,모두 비행 TPR및 포유류 BTR은 궤변 활동에서 독립적으로 규제되는 circadian 시계 의존온도 리듬을 전시하기 때문에.
여기에서 Drosophila의TPR 행동 분석을 분석하는 방법에 대한 세부 사항을 설명합니다. 이 방법은 TPR의 분자 메커니즘 및 신경 회로뿐만 아니라 뇌가 다른 환경 단서와 내부 생물학적 시계를 통합하는 방법을 조사 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>암실용 레드라이트</td></tr><tr><td>Rain X</td><td>SOPUS 제품</td><td></td><td>발수성: 플렉시글라스 커버</td></tr><tr><td>적용 C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도/습도계</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Peltier devices</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>Fluke</td><td>52II</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 컨트롤러</td><td>오븐 산업</td><td>5R6-570-15R 및 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>온도 센서 프로브</td><td>오븐 산업</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>일반 480W ATX 전원 공급 장치</td><td></td><td></td><td>컴퓨터 냉각 시스템</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES 이중 120mm 라디에이터(저장소 포함)&nbsp;</td><td>Swiftech</td><td></td><td>컴퓨터 냉각 시스템</td></tr><tr><td>MCP350 인라인 12V DC 펌프</td><td>Swiftech</td><td></td><td>컴퓨터 냉각 시스템</td></tr><tr><td>MCW50 그래픽 카드 액체 냉각기</td><td>Swiftech</td><td></td><td>컴퓨터 냉각 시스템</td></tr><tr><td>낫 Kaze-Jyuni SY1225SL12SH 팬</td><td>미친 PC</td><td></td><td>컴퓨터 냉각 시스템</td></tr></tbody></table>

드로소필라의 온도 선호도 행동과 circadian 리듬의 설계 및 분석

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

circadian 시계는 수 면, 운동 활동 및 체온 (BTR) 리듬1,2를포함하여 삶의 많은 측면을 조절합니다. 우리는 최근에 온도 선호도 리듬 (TPR)이라고 불리는 새로운 Drosophila circadian 출력을 확인했는데, 이 때 파리의 바람직한 온도는 낮동안 상승하고 3일 밤 동안 떨어집니다. 놀랍게도, TPR 및 운동 활동은 뚜렷한 circadian 뉴런을 통해 제어됩니다3. Drosophila 운동 활동은 잘 알려진 circadian 행동 출력이고 많은 보존된 포유류 circadian 시계 유전자 및 기계장치4의발견에 강한 기여를 제공하고 있습니다. 따라서 TPR을 이해하면 알 수 없는 분자 및 세포 circadian 메커니즘의 식별으로 이어질 것입니다. 여기에서는 TPR 분석기를 수행하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 TPR의 분자 및 신경 메커니즘을 해부 할뿐만 아니라 다른 환경 신호를 통합하고 동물의 행동을 조절하는 뇌 기능의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, 최근 발표된 자료에 따르면 플라이 TPR은 포유류 BTR3과특징을 공유합니다. 드로소필라는 체온이 일반적으로 행동조절되는 동체입니다. 따라서, TPR은 이들 플라이5-8에서리듬체온을 생성하는 데 사용되는 전략이다. 우리는 Drosophila TPR의 추가 탐구는 동물에 있는 체온 통제의 근본적인 기계장치의 특성화를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.

온도 선호도 리듬의 예는 도 5에도시된다. 행동 절차가 성공적으로 완료되면, 파리는 아침에 낮은 온도와 저녁에 더 높은 온도를 선호하는 TPR을 전시해야합니다. ~1-1.5°C의 기온 선호도는 유전적 배경에 관계없이 낮동안 관찰되어야 하며, w 1118, yw 및 캔톤 S파리가 낮3시에유사한 온도 선호도를 나타낸다는 것을 보여주었기 때문에 관찰되어야 한다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51097/51097fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51097/51097fig1.jpg"> 그림 1. DD 데이의 비행 준비의 회로도. <stron...

우리는 최근에 새로운 Drosophila circadian 출력, 온도 선호 리듬 (TPR)을 확인, 있는 파리에서 선호 하는 온도 낮에는 상승 하 고 밤에 폭포. TPR은 다른 circadian 출력, 운동 활동과 독립적으로 규제됩니다. 여기에서 우리는 Drosophila에서TPR의 디자인 그리고 분석을 기술합니다.

드로소필라의 온도 선호도 행동과 Circadian 리듬의 설계 및 분석

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 초파리의 온도 선호도를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 파리와 장치를 준비하는데, 장치는 온도가 제어되는 알루미늄 베이스를 중심으로 조립됩니다. 장치 내에 온도가 설정되면 파리 집단을 투입하고, 30분 후에 이들의 온도 선호도를 측정합니다.결과적으로, 이 분석법은 매우 다양한 실험 조건에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 온도 선호도의 일주기 리듬 분석 등이 가능합니다. 이 방법은 표적 리듬 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 온도 선호도의 표적 리듬은 운동 활성과는 다른 메커니즘에 의해 조절되므로, 본 행동 분석법은 기존의 운동 활성 접근법으로는 확인되지 않았던 새로운 분자 및 세포 메커니즘의 규명으로 이어질 것입니다. 또한, 이 방법은 온도 및 통증 감각과 같은 감각 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 온도 행동 분석법은 매우 견고하기 때문에, 온도 감지부터 처리까지의 신경 회로를 매핑할 수 있게 하며, 이를 통해 감각 통합에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다.습도가 조절되는 인큐베이터에서 12:12 광주기(light dark cycle)로 초파리를 사육하십시오. 이 프로토콜을 위해서는 서로 반대되는 일정으로 설정된 두 대의 인큐베이터가 필요합니다. 야간 인큐베이터는 일반적인 근무 시간 동안 어두운 상태여야 합니다.야간 주기 동안 배양기에 접근할 때는 적색등을 사용하여 배양기를 비추십시오. 성별이나 비율에 관계없이 갓 부화한 초파리를 20~30마리씩 코호트로 수집하고, 분석을 수행하기 전 배양기에서 2~3일 동안 유지하십시오. 각 테스트 조건당 최소 5개의 코호트가 필요합니다.온도 선호도 테스트 챔버를 제작하려면, 하단의 알루미늄 플레이트에 맞게 설계된 플렉시글라스 커버가 필요합니다. 펠티어 소자 4개를 배치하십시오. 각 펠티어 소자는 냉각 또는 가열 온도를 생성할 수 있는 온도 조절기에 연결하여 펠티어 소자의 과열을 방지해야 합니다.컴퓨터 냉각 시스템을 워터 튜브, 공냉식 팬 및 전원 공급 장치에 연결하여 알루미늄 플레이트의 온도를 모니터링합니다. 온도 프로브를 알루미늄 플레이트의 가장자리에 매립하고 온도 컨트롤러에 연결합니다. 커버에서 플레이트의 저온측과 고온측을 각각 12°C 및 36°C로 설정하십시오.레인의 여러 위치에 6개의 온도 프로브를 부착합니다. 장치를 25 °C의 온도와 65~75% 상대 습도가 유지되는 환경 제어실에 배치하십시오. 이러한 조건들이 잘 유지되는지 반드시 모니터링하시기 바랍니다.실내는 빛 조절이 가능해야 하며, 순환하는 공기가 온도를 불안정하게 만드는 것을 방지하기 위해 통풍이 잘 되어야 합니다. 샤워 커튼으로 테스트 구역을 가려 구배를 보호하십시오. 광도는 온도 선호도에 영향을 미칠 수 있으므로 장치에 균일한 빛을 사용해야 합니다.장치를 최소 30분 동안 켜 둡니다. 이는 플레이트 표면에 안정적인 온도 구배를 형성하기 위함입니다. 초파리가 덮개의 벽면이나 천장을 타고 올라가는 것을 방지하기 위해 행동 장치의 덮개에 발수제를 도포합니다.과잉 도포된 발수제를 닦아내고 커버를 25~30분 동안 건조시킵니다. 필요한 경우 30분 후에 양면테이프를 사용할 수 있습니다. 알루미늄 플레이트에서 응결된 수분을 닦아냅니다. 그다음 플렉시글라스 커버를 알루미늄 플레이트 위에 올리고 6개의 C 클램프로 고정합니다.커버가 밀폐되는 것이 매우 중요합니다. 플레이트와 커버 사이의 공기 온도를 모니터링하십시오. 프로브가 알루미늄 플레이트나 플렉시글라스 커버에 닿지 않도록 주의하십시오.커버를 플레이트 위에서 최소 15분 동안 평형 상태가 되도록 둡니다. 결과적으로 알루미늄 플레이트와 커버 사이의 공기 온도 구배는 18에서 32°C 범위가 됩니다. 주간 행동 실험의 경우, 주간 인큐베이터에서 초파리 바이알을 꺼내어 즉시 빛 아래에서 행동 분석 테스트를 수행합니다. 야간 행동 실험 전에는 초파리 바이알을 야간 인큐베이터에서 꺼냅니다.이들을 호일로 감싼 뒤 암실 내 적색등 아래의 상자에 넣으십시오. 암기 동안 진행되는 실험의 경우, 행동 실험이 완료될 때까지 실내 조명은 항상 꺼진 상태를 유지해야 합니다. 다만, 흡입(aspiration) 시 조명을 위해 적색등은 사용할 수 있습니다.알루미늄 플레이트 사이의 공간에 초파리 20~25마리를 넣습니다. 그런 다음 초파리가 탈출하지 못하도록 커버슬립으로 구멍을 덮습니다. 초파리가 30분 동안 자유롭게 움직이도록 둡니다.실험이 완료되면, 명실험(light experiments)을 위해 최소 두 장의 사진을 촬영하십시오. 암실험(dark experiments)의 경우에는 플래시를 사용해야 합니다. 장치의 온도를 확인하십시오.실온과 습도를 기록한 후, 장치 상단의 구멍 근처에 연결된 이산화탄소 튜브를 사용하여 초파리를 마취시키고, 초파리를 제거합니다. 제거된 초파리는 다시 테스트해서는 안 됩니다. 다음으로, 플레이트의 응결수나 습기를 닦아냅니다.플레이트의 커버를 다시 덮고 클램프로 조여 고정합니다. 다음 실험을 준비하며, 온도 구배를 다음과 같이 계산하십시오. 먼저, 프로브의 위치와 기록된 온도를 바탕으로 자를 사용하여 온도 프로브가 배치된 지점을 결정합니다. 초파리의 최종 위치가 찍힌 사진 위에 각 온도 단위를 나타내는 직선을 적절한 위치에 그리십시오.다음으로 각 1°C 간격 사이의 파리 수를 측정하십시오. 덮개의 벽면이나 천장에 붙어 있는 파리는 제외합니다. 각 레인의 온도 범위별 파리 백분율을 계산한 후, 각 조건에 대한 평균 선호 온도를 산출하십시오.최소 5회 이상의 실험에서 데이터를 수집하십시오. 그 다음, 각 실험의 평균값을 사용하여 오차를 포함한 평균 선호 온도를 결정하십시오. 25 °C에서 사육된 일반 초파리는 저녁보다 아침에 더 낮은 온도를 선호합니다.낮 시간 동안에는 온도 선호도가 1에서 1.5도 증가했으며, 낮에서 밤으로 전환되는 시점에는 1.5에서 2°C 감소하는 것이 관찰되었습니다. 이 분석법은 돌연변이 초파리를 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다.예를 들어, 하나의 이온 채널인 trip에 결함 돌연변이가 있는 초파리의 온도 선호도는 대조군보다 높다는 것이 밝혀졌습니다. 이 영상을 시청하고 나면 온도 선호도 행동 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 분자 메커니즘과 신경 회로, 그리고 ofa 및 clocks를 조사하고, 뇌가 생체 시계 내에서 서로 다른 환경적 단서들을 어떻게 통합하는지 연구하는 것을 가능하게 합니다.

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연구

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생물학

우리는 매일 운전하는 활동 리듬을 녹음 절차를...

Circadian 리듬을 연구 및 매개 변수 잠을 전위의 활동 시금 Drosophila</em

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