세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

이 실험 절차의 전체적인 목적은 세포 기반 유세포 분석법(flow cytometry assay)을 사용하여 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 펩타이드 존재 하에 작동 CD8 T 세포를 6일 동안 증식시킵니다. 두 번째 단계로, 표적 CD4 T 세포에 관심 펩타이드를 처리(pulse)한 후, 처리하지 않은 CD4 T 세포와 혼합합니다. 다음으로, 작동 CD8 T 세포와 표적 CD4 T 세포를 서로 다른 작동 세포 대 표적 세포 비율로 6시간 동안 공동 배양합니다.

마지막 단계로, 펩타이드가 로딩된 표적 CD4 T 세포의 사멸 정도와 작동 CD8 T 세포의 수를 유세포 분석법으로 정량화합니다. 최종적으로, 용해 단위(lytic units)로 표현되는 항원 특이적 CD8 T 세포의 고유 살상 능력을 계산할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Lysis release assay와 같은 방식과 달리, 불멸화된 세포주가 아닌 실제 표적 세포인 자가 일차 표적 세포를 사용한다는 점입니다.

또한 이펙터 세포 수는 단일 세포 수준에서 정량화가 가능합니다. 이제 제 실험실의 연구원이 CD8 양성 이펙터 세포를 분리하는 절차를 시연하겠습니다. 먼저 37°C 항온수조에서 자가 동결 보존된 PBMC를 해동한 다음, 최대 50 mL의 완전 배지로 세포를 세척하십시오.

세포 수를 측정한 후, 완전 배지를 사용하여 pbmc를 1mL당 500만 개의 세포 농도로 희석하고, 배양액에 IL-2와 목적 펩타이드를 첨가합니다. 다음으로, 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1mL를 분주합니다. 3일간 배양한 후, 상층액의 절반을 신선한 완전 배지로 교체합니다. 6일간 배양한 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 세포를 멸균 리저버로 옮긴 다음, 세포 수를 측정하고 세척합니다.

분리 버퍼를 사용하여 펠릿을 mL당 5,000만 개의 세포 농도로 재현탁하고, 14 mL 라운드 바텀 튜브에 담긴 PBMC를 mL당 50 µL의 human CD8 positive T-cell enrichment cocktail과 함께 실온에서 배양합니다. 10분 후, anti-CD8 IgG 결합 자성 입자를 mL당 150 µL 농도로 첨가하여 5분 동안 더 배양한 다음, 분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액의 최종 부피를 7 mL로 맞춥니다. 튜브를 분리 마그넷에 넣습니다. 5분 후, 튜브를 마그넷에 둔 상태에서 세포를 15 mL 코니컬 튜브에 붓습니다. 다음으로, 2% FBS가 첨가된 PBS 내에서 CD3 및 CD8 항체를 사용하여 세포의 소량 분취액을 4 °C에서 30분 동안 염색합니다.

유세포 분석법으로 세포의 순도가 CD8 양성 95% 이상인지 확인합니다. 이제 5개의 스크류 캡 튜브에 완전 배지 225 µL를 각각 넣고, 세포를 1:2에서 1:32까지 단계적으로 희석합니다. CD4 양성 표적 세포를 분리하기 위해, 먼저 37 °C 항온수조에서 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.

해동된 세포를 10 mL의 배지가 들어 있는 50 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 방금 시연한 것과 같이 자성 입자 분리법을 통해 CD4 발현 T 세포를 농축하며, 유세포 분석법으로 CD4 양성 T 세포의 순도가 95% 이상인지 확인합니다. 세포 수를 센 후, 두 개의 15 mL 원심 분리 튜브에 나누어 담고 따뜻한 PBS로 세척한 뒤, 펠릿을 PBS에서 20 million cells/mL 농도로 재현탁합니다.

세포가 빛에 노출되지 않도록 보호한 후, CD4 양성 T 세포의 절반은 갓 조제한 CFSE high 작업 용액을 사용하여 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 염색하고, 나머지 절반은 갓 조제한 CFSE low 작업 용액을 사용하여 최종 농도가 0.04 mM이 되도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 15분 동안 염색합니다. 염색 기간이 끝나면 세포를 원심 분리하고, 펠릿을 1 mL의 따뜻한 완전 배지에 재현탁하여 라벨링 반응을 정지시킵니다. CFSE low CD4 양성 T 세포에 목적 펩타이드를 포함한 완전 배지를 최종 농도 5 µg/mL로 첨가하여 세포 배양 인큐베이터에서 45분 동안 펄스 처리합니다.

배양 후 CFSE high 및 low T세포 군집을 모두 세척합니다. 불완전 배지로 두 번 세척한 후, 두 세포 현탁액을 각각 200,000 cells/mL 농도로 불완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음, CFSE high 군집과 CFSE low 군집을 1:1 비율로 혼합합니다.

이제 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 각 웰에 혼합된 target CD4 양성 T 세포 100 µL를 첨가한 후, 각 CD8 양성 T-세포 현탁액 1 µL를 듀플리케이트로 시딩하여 웰당 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 기저 세포사멸 수치를 측정하기 위해 target 세포만 들어있는 웰 3개를 시딩하고, 이후 공동 배양물을 세포 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 세포를 V-bottom 96-웰 플레이트로 옮기고, PE 접합 펩타이드 MHC Tetramer로 각 웰을 15분 동안 염색합니다.

세포 배양 인큐베이터 내에서 2% FBS가 첨가된 PBS로 세포를 세척한 후, 세척이 끝나면 빛을 차단한 상태에서 4°C로 30분 동안 세포를 염색합니다. 다시 펠렛을 PBS에 희석된 2% formaldehyde 100 µL에 재부유시키고 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 공동 배양 후, 세포를 분석하고 이 점 도표(dot plot)에 나타난 대로 게이팅(gating)합니다.

비처리 또는 펩타이드 처리된 CFSE high 대비 CFSE low 생존 표적 세포의 비율은 작은 forward by side scatter 게이트에서 분석합니다. 생존 세포는 live dead 음성 및 CD4 양성 T 세포로 게이팅하며, CFSE low 대비 CFSE high 세포의 비율을 분석하기 위해 CFSE 상에 도식화합니다. 다음으로, 사멸하거나 생존한 작동 세포 및 표적 세포의 총 수를 계산하기 위해 더 큰 forward by side scatter 게이트를 생성합니다. 6시간 배양 후, CD8 양성 및 테트라머 양성 T 세포와 CFSE low CD4 양성 T 세포를 도식화하여 작동 세포 대비 표적 세포의 비율을 분석합니다.

그 다음 CD8 양성 테트라머 양성 세포를 게이팅하여 작동 CD8 양성 T 세포의 총 수를 결정합니다. 표적 세포의 총 수는 CD4 양성 T 세포, CFSE low 및 live dead 양성 및 음성 세포를 게이팅하여 결정합니다. CFSE low 세포 대 CFSE high 세포의 표적 비율은 1:1입니다.

CD4 양성 표적 세포를 작동 세포 없이 배양하면 이 비율이 급격히 감소합니다. CFSE low 양성 펄스 세포를 항원 특이적 CD8 양성 작동 T 세포를 포함하는 전체 CD8 양성 T 세포 집단과 함께 배양했을 때입니다.

비율이 감소함에 따라 CFSE low CD4 양성 펄스 표적 세포들이 live-dead 양성으로 변하기 시작합니다. 이로 인해 작동 세포를 희석하면 CFSE 비율이 회복되며, 궁극적으로 생존 가능한 펩타이드 펄스 CFSE low CD4 양성 표적 T 세포의 수가 회복됩니다. 이후 특이적 용해 백분율을 작동 세포 대 표적 세포 비율의 함수로 로그 스케일 상에 도식화할 수 있습니다. 그래프에 나타난 바와 같이, 도표로부터 선형 회귀 분석을 수행하고 추세선 방정식을 사용하여 용해 단위(lytic units)를 계산합니다.

이는 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 내재적 세포 용해 능력을 결정하고 공여자 간의 결과를 비교하기 위해, 100만 개의 표적 CD4 양성 T 세포 중 30%를 사멸시키는 데 필요한 CD8 양성 작동 T 세포의 수입니다. 이 영상을 시청한 후에는 사이토메트리를 사용하여 항원 특이적 CD T 세포의 독성 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 귀하의 고유한 T 세포 유형에도 쉽게 적용될 수 있습니다.