Name: 세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 항원특이적 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 유세포 분석으로 측정하는 방법을. CD4+ 표적 세포와 공배양 후 용해 단위를 계산하여 면역 기능을 평가합니다.

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이 작업은 플로리다 관광, 무역 및 경제 개발국의 지원을 받았습니다.

1. Effector CD8+ T 세포의 제조
<ol>
	<li>극저온 보존된 PBMC(50 x 106개 셀의 2-3개 바이알)를 액체 질소에서 37°C 수조로 옮겨 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.</li>
	<li>튜브에 완전한 RPMI(4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신, 10% FBS 보충)를 50ml까지 채워 세포를 세척합니다. PBMC를 계수하고 완전한 RPMI에서 5 x 106/ml의 농도로 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>PBMC에 특정 펩타이드(5μg/ml) 및 IL-2(10ng/ml)를 첨가합니다.</li>
	<li>96 깊은 웰 플레이트에서 배양을 설정합니다. 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 파종합니다.</li>
	<li>배양 3일 후 세포 배양 배지의 절반을 새로운 완전한 RPMI로 교체합니다.</li>
	<li>배양 6일 후, 멀티채널 피펫으로 모든 PBMC를 수집하고 멸균 저장소에서 세포를 옮깁니다.</li>
	<li>14ml 둥근 바닥 튜브의 권장 분리 버퍼에서 5 x 107/ml로 PBMC를 계산, 세척 및 재현탁합니다. 50 μl/ml 세포에서 human CD8+ T cell enrichment cocktail을 추가합니다. 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 150 μl/ml의 자성 입자를 첨가하고 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액을 최대 7ml까지 가져옵니다. 튜브를 자석에 삽입하여 손길이 닿지 않은 CD8+ T 세포의 면역자기 분리를 진행합니다. 5분 후 튜브를 자석에 넣은 상태에서 관심 세포를 새 15ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 작은 부분 표본을 취하여 4°C에서 30분 동안 1X PBS-2% FBS의 CD3 및 CD8에 대한 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 CD8+ T cell의 순도는 95% 이상의 예상 순도로 유세포 분석을 통해 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>CD8+ T 세포를 완전한 RPMI로 450μl에 재현탁합니다.</li>
	<li>225 μl의 완전한 RPMI를 5개의 스크류 캡 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>225 μl의 CD8+를 다음 튜브로 옮겨 연속 희석(1:2에서 1:32까지)을 준비합니다(그림 1 상단 패널 참조).</li>
</ol>
2. 타겟 CD4+ T 세포의 준비
<ol>
	<li>저온 보존된 PBMC(50 x 106셀 바이알 1개)를 액체 질소에서 37°C 수조로 옮겨 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 10ml의 RPMI가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>14ml 둥근 바닥 튜브에 분리 버퍼를 사용하여 5 x 107/ml에서 세포를 세척하고 PBMC를 재현탁합니다. 50 μl/ml 세포에서 human CD4+ T cell enrichment cocktail을 추가합니다. 섞어서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 100 μl/ml에서 자성 입자를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액을 최대 7ml까지 가져옵니다. 튜브를 자석에 삽입하여 CD4+ T 세포의 분리를 진행합니다. 5분 후 튜브를 자석 안에 넣은 상태에서 원하는 셀을 새 15ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 작은 부분 표본을 취하여 4°C에서 30분 동안 1x PBS-2% FBS의 CD3 및 CD4에 대한 항체로 세포를 염색합니다. 그런 다음 CD4+ T cell의 순도를 95% 이상의 예상 순도로 유세포 분석을 통해 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>CD4+ T 세포를 세어 2개의 15ml 원뿔형 튜브로 나누고 따뜻한 1x PBS로 세척합니다.</li>
	<li>따뜻한 PBS에서 0.4μM CFSE 높이의 작업 용액을 준비합니다.</li>
	<li>따뜻한 PBS에서 10x CFSE 고작용 용액의 일부를 희석하여 0.04μM CFSE-low working 용액을 준비합니다.</li>
	<li>20 x 106/ml의 PBS에서 세포를 재현탁하고(CD4+ T 세포의 수가 10 x 10미만인 경우 6/ml, 0.5ml의 PBS에서 세포를 재현탁) 동일한 부피의 0.4μM CFSE-높은 작업 용액(최종 농도 0.2μM)을 1개의 동일한 부피로 첨가하여 CD4+ T 세포의 절반을 염색합니다. 예를 들어, 세포 1ml의 경우 CFSE 작업 용액 1ml를 추가합니다. 0.04μM CFSE-저작업 용액(최종 농도 0.02μM)을 동일한 부피로 1개 첨가하여 CD4+의 나머지 절반을 염색합니다. 5% CO2 대기에서 37°C에서 15분 동안 셀을 염색합니다.</li>
	<li>배양 후 펠렛 세포를 1,500rpm에서 5분 동안 가열하고 1ml의 따뜻한 완전 RPMI에 재현탁하여 라벨링 반응을 소멸시킵니다.</li>
	<li>전체 RPMI에 5 μg/ml의 최종 농도에서 관심 펩타이드를 첨가하여 CFSE-low CD4+ T 세포를 펄스하고 37°C의 5% CO2 분위기에서 45분 동안 배양합니다.</li>
	<li>CFSE-high 및 CFSE-low CD4+ T cell을 완전한 RPMI로 세척합니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다. 완전한 RPMI에서 각각 2 x 105 cells/ml의 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>두 대상 모집단을 1:1(CFSE-High:CFSE-Low)의 비율로 혼합합니다(그림 1 하단 패널 참조).</li>
</ol>
3. 공동 문화
<ol>
	<li>CD8+ T 세포를 희석할 때마다 100μl를 둥근 바닥 96웰 플레이트에 복제하여 시드합니다.</li>
	<li>혼합된 타겟 CD4+ T 세포(100μl)를 effector cell의 각 희석액에 추가하여 최종 부피 200μl를 얻습니다.</li>
	<li>basal apoptosis를 측정하려면 타겟 세포만 있는 3개의 웰을 시드합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 5 % CO2 대기에서 6 시간 동안 공동 배양을 배양합니다.</li>
</ol>
4. 유세포 분석 염색 및 획득
<ol>
	<li>세포를 V-bottom 96-well plate로 옮기고 37°C에서 5% CO2 분위기에서 15분 동안 PE 복합 pMHC 사량체로 염색합니다.</li>
	<li>1x PBS-2% FBS로 세척하고 Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650으로 4°C에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 세포를 염색합니다.</li>
	<li>1x PBS-2% FBS로 세포를 한 번 세척하고 1x PBS에서 2% 포름알데히드로 100μl에 재현탁합니다.</li>
	<li>유세포분석기에서 세포를 획득합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
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<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
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<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
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<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명된 분석은 CD8+ T 세포의 주요 기능인 세포 용해 활성의 정량화를 허용합니다. 이전 연구에서는 이 기능과 항원 특이적 CD8+ T 세포의 사이토카인 분비 사이의 불일치가 보고되었기 때문에 CD8+ T 세포의 이펙터 기능을 특성화할 때 이 기능의 정확한 측정이 가장 중요합니다10,11. 짧은 공동 배양 배양 시간(6시간)과 자가 표적 세포의 사용으로 인해 표적 세포의 비특이적 사멸률이 낮습니다. 따라서 이 분석은 매우 구체적이고 신뢰할 수 있습니다. 이 분석은 또한 다른 세포 하위 집합을 분석하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 이펙터 CD8+ T 세포는 생 체 내 사멸 분석법12에서 최근에 기술된 바와 같이 CD4+ T 세포와 같은 다른 세포 유형으로 대체될 수 있다. 표적 CD4+ T 세포는 이전에 자가 B 세포를 표적 세포로 사용하는 것을 설명한 바와 같이 다른 세포 유형으로도 대체될 수 있습니다8. 이 시스템에서는 항원의 기원도 대체될...

세포 용해 활성은 CD8+ T 세포의 주요 기능이지만 이러한 목적으로 사용되는 분석이 번거롭고 표준화가 어렵기 때문에 여전히 거의 측정되지 않습니다. CD8+ T 세포의 effector 기능을 특성화할 때 이 기능의 정확한 측정이 가장 중요한데, 효과적인 세포 매개 세포독성에 대한 신뢰할 수 있는 예측 인자는 아직 설명되지 않았기 때문입니다1,2. 여기에서는 표적 CD4+ T 세포에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 측정하기 위한 새로운 기능 분석을 제안합니다. 황금 표준인 크롬 방출 분석에 대한 대안을 제공하기 위해 여러 가지 접근 방식이 개발되었습니다. 우리는 살아있는 표적 세포의 사멸을 측정하면서 전체 사멸 과정을 보여주는 세포 기반 분석을 제시합니다. 이 방법은 유세포 분석 기반 세포 독성 분석 프로토콜에서 파생되었습니다in vivo in mouse 4,5 및 in vitro in human6. 이 프로토콜에서는 전체 CD8+ T 세포 집단에 포함된 항원 특이적 CD8+ T 세포를 효과기 세포로 사용하고 자가 CD4+ T 세포를 표적 세포로 사용합니다. 관심 있는 이펙터 CD8+ T 세포는 MHCI/펩타이드 사량체7을 사용하여 열거합니다. 타겟 세포의 사멸은 펩타이드 로드/비로드 CD4+ T 세포 간의 비율로 계산됩니다. 우리는 이전에 이 방법이 재현 가능하고 민감하며 특이적이며 전체 CD8+ T 세포 집단8 내의 효과기 세포 수에 의존하지 않는다는 것을 보여주었습니다. coculture 분석에서 effector 및 target cell의 수를 모두 열거함으로써 target cell을 죽이는 CD8+ T cell의 고유 용량을 계산하고 lytic units9로 표현할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>EasySep Human CD4+ T 세포 농축 키트</td><td>줄기세포</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD8+ T 세포 농축 키트</td><td>줄기세포</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 세포 증식 키트 - 유세포 분석</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD8 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Gold, Heat Inactivated</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트; 처리; U-바닥; 뚜껑 포함</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25ml 멸균 폴리스티렌, 개별 포장 저장용기</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96웰 U-바닥, 멸균 2ml 딥 웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), 연구 등급</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, 분리 완충액</td><td>줄기세포</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 폴리 프로필렌 원뿔 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 둥근 바닥 튜브, 폴리 프로필렌</td><td>BD 팔콘</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>큰 쉬운 EasySep 자석</td><td>줄기 세포</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-well; 뚜껑이 있는 V-바닥 플레이트</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액, ACS 시약, H2O에서 37wt%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 나사 캡 마이크로튜브, 원뿔형</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

CD8+ T 세포의 세포 용해 활성은 거의 평가되지 않습니다. 여기에서는 항원 특이적 CD8+ T 세포가 동족 펩타이드가 로드된 CD4+ T 세포를 죽이는 능력을 측정하기 위한 새로운 세포 기반 분석법을 설명합니다. 표적 CD4+ T 세포는 두 가지 농도의 CFSE로 표지된 두 개의 집단으로 나뉩니다. 한 집단은 관심 펩타이드(CFSE-low)로 펄스되고 다른 집단은 펄스되지 않은(CFSE-high) 상태로 유지됩니다. pulsed 및 un-pulsed CD4+ T cell을 동일한 비율로 혼합하고 점점 더 많은 수의 정제된 CD8+ T cell과 함께 배양합니다. 자가 표적 CD4+ T 세포의 특이적 사멸은 펩타이드/MHCI 사량체 염색에 의해 검출된 항원 특이적 효과기 CD8+ T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포와 공동 배양 후 유세포 분석으로 분석됩니다. 타겟 CD4+ T cell의 specific lysis는 effector 대 target ratio에서 측정되어 lytic units LU30/106 cells를 계산할 수 있습니다. 이 간단하고 간단한 분석을 통해 표적 CD4+ T 세포를 사멸시키는 CD8+ T 세포의 고유 용량을 정확하게 측정할 수 있습니다.

그림 1의 모식도는 분석 과정을 요약하여 보여줍니다. 정제된 CD8+ T 세포(작용 세포)를 450 µl의 완전 RPMI에 재현탁하고, CD8+ T 세포 225 µl를 225 µl의 배지가 들어 있는 다음 튜브에 추가하여 연속 희석을 수행하였습니다(상단 패널). 정제된 CD4+ T 세포(표적 세포)의 수를 측정하여 두 개의 튜브로 나누고, 프로토콜에 설명된 대로 두 가지 다른 농도의 CFSE(고농도 및 저농도)로 염색하였습니다. CFSE-low CD4+ T 세포에는 관심 펩타이드를 처리하였고, CFSE-high CD4+ T 세포는 대조군으로서 처리하지 않은 상태로 두었습니다. CFSE-high 및 CFSE-low CD4+ T 세포를 2 x 105/ml 농도로 재현탁한 후 1:1 비율로 혼합하였습니다(하단 패널). 혼합된 CD4+ T 세포를 각 웰에 100 µl씩 분주하였습니다. 혼합된 CD4+ T 세포만 포함된 세 개의 웰은 CD4+ T 세포 단독 대조군의 삼반복 실험으로 사용되...

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 세포 기반 유세포 분석법(flow cytometry assay)을 사용하여 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 펩타이드 존재 하에 작동 CD8 T 세포를 6일 동안 증식시킵니다. 두 번째 단계로, 표적 CD4 T 세포에 관심 펩타이드를 처리(pulse)한 후, 처리하지 않은 CD4 T 세포와 혼합합니다. 다음으로, 작동 CD8 T 세포와 표적 CD4 T 세포를 서로 다른 작동 세포 대 표적 세포 비율로 6시간 동안 공동 배양합니다.마지막 단계로, 펩타이드가 로딩된 표적 CD4 T 세포의 사멸 정도와 작동 CD8 T 세포의 수를 유세포 분석법으로 정량화합니다. 최종적으로, 용해 단위(lytic units)로 표현되는 항원 특이적 CD8 T 세포의 고유 살상 능력을 계산할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Lysis release assay와 같은 방식과 달리, 불멸화된 세포주가 아닌 실제 표적 세포인 자가 일차 표적 세포를 사용한다는 점입니다.또한 이펙터 세포 수는 단일 세포 수준에서 정량화가 가능합니다. 이제 제 실험실의 연구원이 CD8 양성 이펙터 세포를 분리하는 절차를 시연하겠습니다. 먼저 37°C 항온수조에서 자가 동결 보존된 PBMC를 해동한 다음, 최대 50 mL의 완전 배지로 세포를 세척하십시오.세포 수를 측정한 후, 완전 배지를 사용하여 pbmc를 1mL당 500만 개의 세포 농도로 희석하고, 배양액에 IL-2와 목적 펩타이드를 첨가합니다. 다음으로, 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1mL를 분주합니다. 3일간 배양한 후, 상층액의 절반을 신선한 완전 배지로 교체합니다. 6일간 배양한 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 세포를 멸균 리저버로 옮긴 다음, 세포 수를 측정하고 세척합니다.분리 버퍼를 사용하여 펠릿을 mL당 5,000만 개의 세포 농도로 재현탁하고, 14 mL 라운드 바텀 튜브에 담긴 PBMC를 mL당 50 µL의 human CD8 positive T-cell enrichment cocktail과 함께 실온에서 배양합니다. 10분 후, anti-CD8 IgG 결합 자성 입자를 mL당 150 µL 농도로 첨가하여 5분 동안 더 배양한 다음, 분리 버퍼를 추가하여 세포 현탁액의 최종 부피를 7 mL로 맞춥니다. 튜브를 분리 마그넷에 넣습니다. 5분 후, 튜브를 마그넷에 둔 상태에서 세포를 15 mL 코니컬 튜브에 붓습니다. 다음으로, 2% FBS가 첨가된 PBS 내에서 CD3 및 CD8 항체를 사용하여 세포의 소량 분취액을 4 °C에서 30분 동안 염색합니다.유세포 분석법으로 세포의 순도가 CD8 양성 95% 이상인지 확인합니다. 이제 5개의 스크류 캡 튜브에 완전 배지 225 µL를 각각 넣고, 세포를 1:2에서 1:32까지 단계적으로 희석합니다. CD4 양성 표적 세포를 분리하기 위해, 먼저 37 °C 항온수조에서 자가 동결 보존된 PBMC를 해동합니다.해동된 세포를 10 mL의 배지가 들어 있는 50 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 방금 시연한 것과 같이 자성 입자 분리법을 통해 CD4 발현 T 세포를 농축하며, 유세포 분석법으로 CD4 양성 T 세포의 순도가 95% 이상인지 확인합니다. 세포 수를 센 후, 두 개의 15 mL 원심 분리 튜브에 나누어 담고 따뜻한 PBS로 세척한 뒤, 펠릿을 PBS에서 20 million cells/mL 농도로 재현탁합니다.세포가 빛에 노출되지 않도록 보호한 후, CD4 양성 T 세포의 절반은 갓 조제한 CFSE high 작업 용액을 사용하여 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 염색하고, 나머지 절반은 갓 조제한 CFSE low 작업 용액을 사용하여 최종 농도가 0.04 mM이 되도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 15분 동안 염색합니다. 염색 기간이 끝나면 세포를 원심 분리하고, 펠릿을 1 mL의 따뜻한 완전 배지에 재현탁하여 라벨링 반응을 정지시킵니다. CFSE low CD4 양성 T 세포에 목적 펩타이드를 포함한 완전 배지를 최종 농도 5 µg/mL로 첨가하여 세포 배양 인큐베이터에서 45분 동안 펄스 처리합니다.배양 후 CFSE high 및 low T세포 군집을 모두 세척합니다. 불완전 배지로 두 번 세척한 후, 두 세포 현탁액을 각각 200,000 cells/mL 농도로 불완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음, CFSE high 군집과 CFSE low 군집을 1:1 비율로 혼합합니다.이제 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 각 웰에 혼합된 target CD4 양성 T 세포 100 µL를 첨가한 후, 각 CD8 양성 T-세포 현탁액 1 µL를 듀플리케이트로 시딩하여 웰당 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 기저 세포사멸 수치를 측정하기 위해 target 세포만 들어있는 웰 3개를 시딩하고, 이후 공동 배양물을 세포 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 세포를 V-bottom 96-웰 플레이트로 옮기고, PE 접합 펩타이드 MHC Tetramer로 각 웰을 15분 동안 염색합니다.세포 배양 인큐베이터 내에서 2% FBS가 첨가된 PBS로 세포를 세척한 후, 세척이 끝나면 빛을 차단한 상태에서 4°C로 30분 동안 세포를 염색합니다. 다시 펠렛을 PBS에 희석된 2% formaldehyde 100 µL에 재부유시키고 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 공동 배양 후, 세포를 분석하고 이 점 도표(dot plot)에 나타난 대로 게이팅(gating)합니다.비처리 또는 펩타이드 처리된 CFSE high 대비 CFSE low 생존 표적 세포의 비율은 작은 forward by side scatter 게이트에서 분석합니다. 생존 세포는 live dead 음성 및 CD4 양성 T 세포로 게이팅하며, CFSE low 대비 CFSE high 세포의 비율을 분석하기 위해 CFSE 상에 도식화합니다. 다음으로, 사멸하거나 생존한 작동 세포 및 표적 세포의 총 수를 계산하기 위해 더 큰 forward by side scatter 게이트를 생성합니다. 6시간 배양 후, CD8 양성 및 테트라머 양성 T 세포와 CFSE low CD4 양성 T 세포를 도식화하여 작동 세포 대비 표적 세포의 비율을 분석합니다.그 다음 CD8 양성 테트라머 양성 세포를 게이팅하여 작동 CD8 양성 T 세포의 총 수를 결정합니다. 표적 세포의 총 수는 CD4 양성 T 세포, CFSE low 및 live dead 양성 및 음성 세포를 게이팅하여 결정합니다. CFSE low 세포 대 CFSE high 세포의 표적 비율은 1:1입니다.CD4 양성 표적 세포를 작동 세포 없이 배양하면 이 비율이 급격히 감소합니다. CFSE low 양성 펄스 세포를 항원 특이적 CD8 양성 작동 T 세포를 포함하는 전체 CD8 양성 T 세포 집단과 함께 배양했을 때입니다.비율이 감소함에 따라 CFSE low CD4 양성 펄스 표적 세포들이 live-dead 양성으로 변하기 시작합니다. 이로 인해 작동 세포를 희석하면 CFSE 비율이 회복되며, 궁극적으로 생존 가능한 펩타이드 펄스 CFSE low CD4 양성 표적 T 세포의 수가 회복됩니다. 이후 특이적 용해 백분율을 작동 세포 대 표적 세포 비율의 함수로 로그 스케일 상에 도식화할 수 있습니다. 그래프에 나타난 바와 같이, 도표로부터 선형 회귀 분석을 수행하고 추세선 방정식을 사용하여 용해 단위(lytic units)를 계산합니다.이는 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 내재적 세포 용해 능력을 결정하고 공여자 간의 결과를 비교하기 위해, 100만 개의 표적 CD4 양성 T 세포 중 30%를 사멸시키는 데 필요한 CD8 양성 작동 T 세포의 수입니다. 이 영상을 시청한 후에는 사이토메트리를 사용하여 항원 특이적 CD T 세포의 독성 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 귀하의 고유한 T 세포 유형에도 쉽게 적용될 수 있습니다.

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

세포 기반 유세포 분석을 통한 세포독성 활성 측정

이 비디오는 암세포에 대한 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포의 세포독성 능력을 측정하는 체외 기술을 보여줍니다. 표적 암세포와 CIK 세포를 공동 배양하면 형광 생존도 염료를 사용하여 죽은 암세포를 식별하고 유세포 분석을 사용하여 정량화하여 CIK 세포의 세포독성 효과를 추정합니다.

사이토카인 유도 살해 세포의 세포독성 능력을 연구하기 위한 체외 분석

이 비디오는 형광으로 염색된 표적 세포에 대한 자연 살해 세포의 용해 활성을 보여줍니다. 이 방법은 죽은 세포를 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 표적 세포를 정량화함으로써 NK 세포 유도 세포 독성을 측정할 수 있습니다.

유세포 분석을 위한 Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay 시료 전처리

이 비디오는 사전 활성화된 이펙터 T 세포에 의해 유도된 암세포의 세포사멸 분석을 보여줍니다. 이러한 세포를 형광 핵으로 표시된 암세포와 함께 배양함으로써 카스파제로 절단할 수 있는 형광 기질을 추가합니다. 세포사멸 암세포는 핵에서 다른 색을 표시하여 이중 형광을 유발합니다. 이 이중 형광은 암세포가 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

암세포에 대한 사전 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

이 작업은 인간 혈액 샘플에서 NK(Natural Killer) 세포 수와 NK 세포 독성을 정확하고 빠르게 측정하기 위한 고급 워크플로우를 설명합니다.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 항원특이적 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 유세포 분석으로 측정하는 방법을. CD4+ 표적 세포와 공배양 후 용해 단위를 계산하여 면역 기능을 평가합니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

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