Name: 이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: 배우세요 세포막 상해 수리 메커니즘을 형광 염료와 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 라이소좀 외배출 과정을 통해 손상된 세포의 복구 역학을 분석하고 세포 생물학 연구에 활용하세요.

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이 작품은 프랑스어 근육질 영양 장애 협회 (AFM)에 의해 AD에 건강 보조금 AR055686과 AR060836 및 박사 학위 취득 후 친교의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 연구에서 사용 된 세포 이미징 시설은 건강 보조금 HD040677의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

1. 이미징 세포막 수리 대량 사용 (유리 구​​슬) 부상 이 프로토콜은 별도로 부상 세포 치료에 실패하는 사람들을 표시 할 수 있습니다. 세포의이 인구의 양을 세 가지 조건의 사용이 필요합니다 : 1. 테스트 (C1) - 세포는 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 있습니다. 제어 1 (아무 부상 C2) - 세포는 칼슘 이온의 존재 하에서 배양,하지만 부상하지, 3됩니다. 제어 2 (노 수리 C3)는 - 세포는 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 있습니다. <ol><li> 세 멸균 커버 슬립에&gt; 50 %의 합류로 세포 성장과 실리콘 O-링에 37 ° C 및 전송의 coverslips에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 씻어. </li><li> C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 FITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 수동 틸팅 커버 슬립에 의해 상온에서 커버 슬립에 40 밀리그램의 유리 구슬을 회전에 의해 C1과 C3에 세포막을 손상30 °의 각도로 앞으로 6 ~ 8 시간. 참고 : 가벼운 부상, 따라서 반복 부상을 최소화, 유리 구슬이 균일하게 확산되도록. 샘플 사이 부상의 재현성을 향상시키기 위해, 동시에 비교 될 다른 샘플의 유리 구슬 부상을 수행한다. </li><li> 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다. </li><li> 구슬이 굴러시키지 않고, 37 ℃에서 CIM (C1 및 C2) 또는 PBS (C3)로 세척하여 유리 구슬과 FITC 덱스 트란을 제거 </li><li> 장소는 O 링에 다시 커버 슬립과 C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 주위 CO 2에서 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 데워진 CIM로 두 번 커버 슬립을 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다. </li><li> PBS로 두 번 세척하고 헥스 염료의 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> 세척 SAMPLES PBS로 2 회, 표면 형광 현미경을 사용하여 장착 매체 및 화상 세포를 사용하여 슬라이드 마운트. </li><li> 배경 빨간색과 녹색의 염색 강도를 결정하고, 모든 샘플 (C1-C3)에 대한 임계 빨간색과 녹색 채널에이 값을 사용하는 C2의 세포를 사용합니다. </li><li> ) 녹색 (부상 및 수리) 및 b) 적색 또는 적색과 녹색 (부상을 모두 포함하지만, C1과 C3 샘플에서) 복구하는 데 실패하는 세포의 수를 점수. </li><li> 백작&gt; (100) 그린의 각 조건에 대한 부상의 모든 세포 (녹색, 적색)의 백분율로 복구하는 데 실패 세포의 일부를 발현하는 세포. </li></ol> 2. 레이저 손상 후 세포의 막 수리의 속도론의 라이브 영상 <ol><li> 데워진 CIM으로 세포를 세척 한 다음 FM 염료와 CIM에 커버 슬립을 넣어. </li><li> 37 ℃에서 무대 위에 배양기에서 홀더에 커버 슬립을 배치 </li><li> 세포막의 1-2 MM 2 지역을 선택하고 대한 조사 &lt;, 펄스 레이저와 10 밀리. 피크 파워 40-50 %로 소프트웨어를 통해 레이저 파워를 감쇄. 최적의 전력이 일치하지만, 치명적 부상을 허용하고이 사용되는 각각의 악기와 세포 라인에 대한 시행 착오에 의해 결정되어야한다. </li><li> 이전에 부상을 시작, 표면 형광 및 시야에 수리, 이미지마다 10 초를 모니터링하고 손상 후 3 ~ 5 분 동안 계속합니다. 참조 : 수리 컨트롤의 반복 PBS의 부상 세포가 FM 염료를 함유하는 2.1-2.4 단계를 반복합니다. </li><li> 수리의 반응 속도를 정량화하기 위해 휴대 FM 염료의 형광을 측정 및 이미징의 과정 동안 강도 (ΔF/F0)의 변화를 플롯. 이 데이터는 각 조건에서 10 셀에 대한 평균과 필요에 따라, 평균 또는 개별 셀의 값으로 그릴 수 있어야합니다. </li></ol> 3. 영상 벌크 (유리 구​​슬) 상해 유도 리소좀 세포 외 유출 샘플은&gt; 50 %로 성장 다음 세포를 포함합류 : 1. 테스트 (C1) - 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 세포. 제어 1 (C2, 아니 부상) - 세포 손상되거나 차 항체와 함께 배양, 3 어느 쪽도. 제어 2 (C3, 아니 수리) - 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 세포. <ol><li> 세탁은 37 ° C에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 커버 슬립 실리콘 O-링에 전송할 수 있습니다. </li><li> C3에 C1과 C2에 CIM과 PBS에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 1.3에서와 같이 C1과 C3에 세포막을 손상. </li><li> 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다. </li><li> 다시 세포에 유리 구슬의 더 롤링을 보장하지, 차가운 성장 매체에 커버 슬립을 세척하여 유리 구슬과 TRITC 덱스 트란을 제거합니다. </li><li> 차가운 성장 매체로 두 번 커버 슬립을 씻어 O-링에 전송할 수 있습니다. </li><li> C1과 C3에차가운 완벽한 성장 미디어 쥐 반대로 마우스 램프 1 항체의 100 μl를 추가하고 C2에 감기, 완전 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 항체를 4 ℃에서 30 분 동안 품어 커버 슬립을 결합 수 있도록하려면 </li><li> 차가운 CIM과 커버 슬립을 세 번 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA 모두의 coverslips를 해결하고 CIM으로 배를 씻어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 차단 솔루션의 100 μL의 모든 커버 슬립을 품어 </li><li> 4 ℃에서 알렉사 플 루어 100 μL에 15 분 동안 488 안티 쥐의 항체를 모두 커버 슬립을 품어 </li><li> PBS로 두 번 세척하고 훽스트에서 실온에서 2 분 동안 품어. </li><li> PBS로 두 번 세포를 세척, 표면 형광 현미경을 사용하여 설치 미디어 및 이미지를 사용하여 슬라이드에 탑재합니다. </li><li> C2 셀의 이미지를 사용하여 비특이적 배경 빨간색으로 염색 (TRITC 덱스 트란)과 녹색 (알렉사 플 루어 488 항체) 채널을 결정하고 모든 샘플 (C1-C3)의 빨간색과 녹색 채널 임계 값이 배경 염색 값을 사용합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 손상된 세포의 램프 1 염색 (녹색)의 강도를 측정하기 위해 C1과 C3에서&gt; (100) 레드 라벨 ​​세포를 사용합니다. 성공적인 실험을 위해 C3의 세포에있는 램프 1 염색은 C1의 세포에 비해 크게 낮은 것입니다. </li></ol> 4. 셀 멤브레인 손상의 라이브 영상은 세포 내 인신 매매를 트리거 <ol><li> 형광 라벨 (리소좀 8에 대한 예를 들어, CD63-GFP) 또는 형광 염료 (9)를 사용하여 해당 기자를 형질 전환하여 관심의 구획. </li><li> 형광 염료와 라벨 리소좀를 들어, FITC-덱스 트란을 포함하는 성장 매체에 50 %의 합류로 성장 세포를 배양 </li><li> CO 2 인큐베이터 (관심 세포주로 덱스 트란과 충분한 엔도 좀의 표시에 필요한 이상) 덱스 트란 2 시간 동안 endocytosed 할 수 있습니다. </li><li> 수 있도록 데워진 성장 매체와 세포를 세척하고 CO 2 배양기에서 2 시간 동안 그 안에 품어 모든리소좀 축적하는 덱스 트란을 endocytosed. </li><li> 촬영하기 전에 예비 가온 CIM에서 커버 슬립을 씻어 37 ℃에서 무대 위에 인큐베이터에 커버 슬립 홀더에 장착 </li><li> (셀에 걸쳐 이동) 위드 또는 TIRF (세포 표면 및 세포 외 유출에 운동) 이미징을 수행 - FITC 덱스 트란 혼잡이없는 세포가 표시 리소좀 개별 리소좀의 이동과 세포 외 유출 이미징에 이상적입니다. </li><li> 영상 현미경에 대한 TIRF 레이저 정렬 : 사용 60X 또는&gt; 1.45 NA와 100X의 목표를. 제조업체의 접근 방식을 사용하여 사건 TIRF 레이저 빔의 각도를 설정합니다. </li><li> 40~50% 감쇠의 펄스 레이저로, &lt;100 밀리 위해 작은 (1-2 MM 2) 영역을 조사함으로써 세포막을 손상. </li><li> 관심의 세포에서 세포 외 유출의 역학에 따라 최소 2 분 이상 4-6 프레임 / 초에 부상, 이미지 셀 셀에 리소좀의 반응을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
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<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

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생체 내에서 세포막 손상으로 인해 생리적 스트레스 요인의 다양성과 여러 가지 실험 방법이 모방하기 위해 개발되었습니다 발생합니다. 이러한 요리를 긁어 또는 좁은 구멍 주사기 9,10 통해 계대에 의해 부착 세포의 세포막을 손상 있습니다. 등의 부상에 따라 세포 현탁액 치유하고 그들이 일반적으로 조직에서와 마찬가지로 세포 외 기질을 준수하지. 이러한 기공 형성 독소의 사용과 같은 또 다른 화학적으로 콜레스테롤 등의 지질 추출에 의해 세포막을 변경, 따라서 생체 기계 부상 5 흉내 없습니다. 따라서, 세포 손상에 사용되는 방법은 수리 대응에 대해 배울 수있는 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 세포 손상의 선택에주의하지 만 운동뿐만 아니라, 생체 내에서 더 나은 기계적 손상을 모방 방법을 선택할 필요로한다. 이러한 접근 방법은 세포의 단층이 부상 스크래치 부상 (포함메스 또는 바늘)과 유리 구슬 상해 (부상이 부착 된 세포를 통해...

세포막은 세포와 세포 외 환경 사이의 장벽을 제공함으로써 세포의 무결성을 유지한다. 정상적인 생리 임계 값뿐만 아니라 병원균 침입의 존재를 초과, 화학, 전기, 기계적인 자극이 세포막에 상해에있는 각 결과와이 상처를 복구 이후의 세포 반응을 트리거 할 수 있습니다. 세포막에 이러한 부상을 살아 남기 위해서, 세포 복구를위한 효율적인 메커니즘을 가지고있다. 이 메커니즘은 칼슘 의존하고 다른 사람의 사이에 같은 annexins과 MG53 같은 단백질의 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 손상된 세포막 1-7 엔도 좀, 리소좀, 골지체 파생 소포와 미토콘드리아 같은 세포 내 구획을 포함한다. 그러나 손상된 세포막을 복구에 관련된 분자 및 세포 내 일련의 이벤트의 세부 사항이 제대로 이해 남아 있습니다. 세포의 수리 응답은 귀으로 분리 할 수​​ 있습니다LY 늦게 반응. 분 시간 단위로 초 이내에 발생하는 초기 반응은 성공적으로 세포 수리 또는 세포 사망에 이르는 늦게 응답의 성격을 결정하는 데 대단히 중요하다. 대량 생화학 및 세포 분석을 기반으로 엔드 포인트 분석은 수리 분자 및 세포 프로세스의 참여를 설정 도움이있다. 그러나, 셀룰러 인해 복구 응답 이질성 및 신속성으로, 종점 분석법 복구를 초래하는 이벤트의 시퀀스의 운동 및 공간 세부 정보를 제공하지 못한다. 세포막의 부상 제어를 가능하게하고 세포막 수리 및 높은 공간 및 시간적 해상도에 관련된 세포 내 반응을 모니터링 할 수 있도록 접근은 이상적으로 그러한 연구를 위해 적합하다. 여기, 이러한 접근 방법이 제시되었다. 프로토콜의 두 레이저 INJ 따라 세포막 수리의 실시간 동역학 및 생균의 복구 과정과 연관된 세포 내 반응을 모니터링하는 방법을 설명URY. 이러한 라이브 세포 이미징 기반의 분석에 대한 보완으로, 엔드 포인트 분석은 개별 세포와 관련된 세포 내 반응의 모니터링 수리를 위해 인구를 기반으로 측정을 제공하는 기술되었다. 이러한 접근은 세포막 손상에 응답 매매 및 리소좀의 세포 외 유출을 모니터링하는 데 사용 된 그들의 실용성을 입증.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)를 준비하는 데 사용됨</td></tr> <tr><td>Hepes</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC 덱스트란(라이신 고정성)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM 또는 PBS</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td></td> CIM 또는 PBS PFA의 <td>INVITROGEN</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml 또는 PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 PBS</td></tr><tr><td>FM 염료</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&마이크로; CIM 또는 PBS에서</td></tr><tr><td>L FITC 덱스트란</td><td>시그마</td><td>FD40S</td><td>성장 매체에서 2 mg/ml</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in 성장 매체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in blocking</td></tr><tr><td>solution 마운팅 미디어</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 페트리쉬</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 O 링</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 홀더</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>성장 매체에 사용: 10% FBS, DMEM에서 1% P/S</td></tr><tr><td>페니실린/스렙토마이신</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>성장 배지에 사용: DMEM에서 10% FBS, 1% P/S</td></tr><tr><td>CIM의 치킨 세럼</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% 치킨 세럼은</td></tr><tr><td>PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 무료)</td> 면역 염색 중 차단 용액에 사용됩니다. <td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>에피 형광 현미경</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 조명기&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence illuminator</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>포토메트릭스, 투손, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이미지 획득 및 분석 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Stage top incubator</td><td>Tokaihit, Japan</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

치유 손상균의 능력은 기본적인 세포 과정이지만 치유 손상균 개인 세포 및 분자 메커니즘은 불완전하게 이해되어있다. 여기에 분석은 현지화 된 손상 후 배양 된 세포의 치유의 능력과 반응 속도를 모니터링 할 수 있도록 서술되어있다. 첫 번째 프로토콜은 동시에 수백 개의 셀의 세포막 수리 능력을 평가하기 위해 엔드 포인트 기반의 접근 방식에 대해 설명합니다. 제 2 프로토콜은 펄스 레이저와 지역화 부상 다음 개별 세포의 세포막 수리의 동력학을 모니터하는 실시간 이미징 방법을 설명한다. 치유 부상 세포가 상해의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 수반으로, 세 번째 프로토콜은 동시에 부상 수백 개의 셀에 하나의 인신 매매 사건 (리소좀 세포 외 유출)을 평가하기 위해 위의 엔드 포인트 기반의 접근 방식을 사용하고 마지막 프로토콜을 설명합니다 TIRF의 마이크로 함께 펄스 레이저 부상의 사용에 대해 설명높은 공간과 시간적 해상도로 부상 세포에서 각각의 세포 내 구획의 역학을 모니터에 복사합니다. 여기 프로토콜 세포막 수리 배양 근육 세포의 리소좀 세포 외 유출 간의 링크를 연구하는 이러한 접근법의 사용을 설명하지만, 이들은 임의의 다른 부착 배양 세포 및 선택의 세포 내 구획을 위해 등을 적용 할 수있다.

단일 세포 이미징 여기에 설명 된 프로토콜은 능력과 반응 속도 세포막 수리 (프로토콜 1, 2) 및 복구하는 동안 세포 내 인신 매매와 리소좀의 융합 모니터링 할 수 있습니다 (프로토콜 3, 4). 프로토콜 1은 모든 부상 세포를 표시하고 복구하는 데 실패하는 부상 세포를 식별 할 수있는 대량 분석을 보여줍니다. 손상되지 않은 세포 (그림 1A)가 레이블을 유지하면서, FITC 덱스 트란의 존재에 유리 구슬로 부상 세포 (그림 1B 및 1C) 녹색 표시되는 그림 1 쇼의 결과. 세포가 칼슘의 존재에 복구 할 수 있습니다 때 2 + 부상 (녹색) 세포의 대부분은 수리, 관리 및 TRITC 덱스 트란 (그림 1B)에 의해 (적색)으로 표시되지 않습니다. 세포는 칼슘 2 +의 부재 하에서 복구...

치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 처리 방법이 손상된 세포의 회복에 미치는 영향을 관찰하고, 손상된 세포의 회복을 돕는 세포 내 하위 프로세스를 연구하는 것입니다. 이는 온전한 세포막을 통과할 수 없는 형광 염료가 있는 상태에서 세포에 손상을 입혀, 염료의 유입을 차단하는 손상된 세포의 능력과 그 역학을 평가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 손상된 세포막에 세포 내 단백질이 나타나는 것을 모니터링하며, 이를 통해 관심 있는 세포 소기관이 손상된 세포막과 융합하여 회복에 참여하는 능력을 확인합니다.다음으로, 손상 기전을 모니터링하기 위해 관심 있는 세포 소기관과 손상된 세포막의 융합을 관찰합니다. 이러한 소기관의 유도 융합 결과, 손상된 세포 표면에서 lysosome associated membrane protein 1의 발현 증가와 손상된 세포에 의한 리소좀 내용물 분비의 실시간 이미징을 통해 세포막 손상 복구가 리소좀 엑소사이토시스와 관련이 있음이 확인되었습니다. 이러한 방법들은 세포 손상 및 복구에 관한 중요한 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 이를 통해 세포막의 국소 손상에 반응하는 단백질과 세포 소기관이 무엇인지 결정하고, 이후 해당 반응의 역학을 평가할 수 있습니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Aurelia D four와 hamma stra two가 담당하여, 회복되는 손상 세포와 회복되지 않는 손상 세포를 각각 표지하는 과정을 보여줄 것입니다.세 가지 실험 조건에 따라 멸균된 커버슬립에 세포를 파종합니다. 세포가 50% 이상의 밀도(confluence)에 도달할 때까지 배양한 후, C1과 C2를 37 °C의 CIM으로 두 번 세척합니다. C3는 37 °C의 PBS로 세척합니다.그런 다음 커버슬립을 실리콘 O-링으로 옮깁니다. 적절한 완충액에 들어있는 예열된 fitzy dextran 용액 100 µL를 첨가합니다. 실온에서 커버슬립 위에 유리 비즈 40 mg을 추가하고 커버를 수동으로 기울여 C1과 C3의 세포막에 손상을 줍니다.경미한 손상을 유발하기 위해 30도 각도로 6~8회 앞뒤로 미끄러뜨립니다. 유리 비드가 균일하게 퍼져 있도록 하여, 반복적인 손상을 최소화함으로써 샘플 간 손상의 재현성을 높이십시오. 비교 대상인 서로 다른 샘플들의 유리 비드 손상 과정을 동시에 수행하여 비드가 추가로 굴러가는 것을 방지하십시오.모든 커버슬립을 주변 CO2 농도의 37 °C 인큐베이터로 옮기고, 비즈가 굴러가지 않게 주의하며 5분 동안 복구 과정이 진행되도록 합니다. 버퍼 또는 PBS로 세척하여 유리 비즈와 fitzy dextran을 제거합니다. 이제 커버슬립을 다시 O-링 위에 놓고 미리 데워둔 lysine 100 µL를 추가합니다.고정 가능한 trissy dextran 용액을 상온 CO2 조건에서 37°C로 5분 동안 배양합니다. 예열된 CIM으로 커버슬립을 두 번 세척하고, PBS로 두 번 세척한 후 4% PFA로 상온에서 10분 동안 고정합니다. hersch 염색액에서 2분 동안 배양하고, PBS로 두 번 세척한 후 마운팅 용액을 사용하여 샘플을 슬라이드에 마운팅합니다.다음으로, C2 샘플의 세포를 에피 형광 현미경으로 촬영합니다. 배경의 적색 및 녹색 염색 강도를 측정합니다. 그런 다음 이 값을 사용하여 모든 샘플의 적색 및 녹색 채널에 대한 임계값을 설정합니다.초록색으로 염색된 총 세포 수를 측정하십시오. 또한 C1 및 C3 샘플에서 빨간색으로 염색되었거나 빨간색과 초록색 모두로 염색된 세포 수를 측정하십시오. 이제 각 조건당 100개 이상의 초록색 손상 세포를 계수한 후, 회복에 실패한 세포의 분율을 전체 손상 세포 대비 백분율(%)로 나타내십시오.50% 이상의 밀도로 성장한 세포를 미리 데워둔 CIM으로 세척하고, FM 염료가 포함된 CIM 내에 커버슬립을 고정합니다. 37 °C로 유지되는 스테이지 상단 인큐베이터의 홀더에 배치합니다. 일관되면서도 치명적이지 않은 손상을 줄 수 있는 최적의 출력을 사용하여 세포막의 영역을 선택합니다.이를 달성하기 위해 펄스 레이저로 시료를 10 milliseconds 미만으로 조사합니다. 손상 전부터 시작하여 손상 후 3~5분 동안 epi, 형광 및 명시야 모드에서 2~10초마다 이미지를 모니터링, 복구 및 획득하기 위해 소프트웨어를 통해 레이저 출력을 피크 출력의 40~50%로 감쇠시킵니다. 복구 역학을 정량화하려면 세포의 FM dye 형광을 측정하십시오.이미징 과정 동안의 강도 변화를 계산하십시오. 각 조건당 10개 이상의 세포에 대한 데이터를 평균 내어 평균값 또는 개별 세포 값으로 그래프를 그리십시오. C one과 C two의 커버슬립을 세척하십시오.37°C의 CIM으로 배양액을 준비하고, 37°C의 PBS로 C3를 세척합니다. 그런 다음 샘플을 실리콘 O-링으로 옮깁니다. 예열된 lysine fixable trissy dextran 100 µL를 첨가합니다.앞서 설명한 것과 같이 C1과 C3의 세포막에 손상을 줍니다. 그런 다음 비드가 더 이상 굴러가지 않도록 주의합니다. 모든 커버슬립을 주변 CO2 농도가 유지되는 37 °C 인큐베이터로 옮겨 5분 동안 복구가 진행되도록 합니다.이제 유리 비드와 Trixie dextran을 제거하기 위해 커버슬립을 차가운 성장 배지로 세척하며, 이때 유리 비드가 세포 위에서 굴러가지 않도록 주의합니다. 커버슬립을 차가운 성장 배지로 두 번 헹군 다음 C1 및 C3 O-링으로 옮깁니다. 차가운 완전 성장 배지에 rat anti-US lamp one 항체 100 µL를 첨가하고, 항체 결합이 가능하도록 C2에 차가운 완전 성장 배지를 추가합니다. 차가운 CIM으로 세 번 세척한 후, 커버슬립을 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.모든 커버슬립을 4% PFA로 실온에서 10분 동안 고정합니다. 그 다음 CIM으로 3회 헹굽니다. 이어서 모든 커버슬립을 100 µL의 블로킹 용액에서 15분 동안 배양한 후, 100 µL의 4 88 anti rat antibody로 15분 동안 배양합니다.PBS로 두 번 세척하고, PBS 세척을 두 번 더 거친 후 실온에서 2분 동안 her stain으로 배양합니다. 샘플을 슬라이드에 마운팅한 다음, C two 세포 이미지를 사용하여 에피 형광 현미경으로 샘플을 촬영합니다. 적색 및 녹색 채널의 비특이적 배경 염색 정도를 결정합니다.이 배경 염색 값을 사용하여 모든 샘플의 적색 및 녹색 채널에 대한 임계값을 설정하십시오. C1과 C3의 100개 이상의 적색 표지 세포를 사용하여 손상된 세포 내 Lamp1 염색 강도를 측정하십시오. 실험이 성공적이라면, C3의 Lamp1 염색 세포는 C1의 세포보다 유의하게 낮을 것입니다. 형광 염료로 리소좀을 표지하려면, FITC-dextran이 포함된 성장 배지에서 50% 밀도로 성장시킨 세포를 배양하십시오.세포 배양 인큐베이터에서 덱스트란이 2시간 동안 내포 작용(endocytosis)되도록 둡니다. 미리 데워둔 성장 배지로 세포를 세척하고, CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하여 이미징 전에 모든 내포된 덱스트란이 리소좀에 축적되도록 합니다. 미리 데워둔 CIM으로 커버슬립을 헹구고, 37°C의 스테이지 탑 인큐베이터에 있는 커버슬립 홀더의 CIM에 마운팅합니다.이미징을 위해 fitzy dextran으로 라벨링된 리소좀이 밀집되지 않은 세포를 선택하십시오. 개별 리소좀의 이동과 엑소사이토시스(exocytosis)를 관찰합니다. 세포 전체의 리소좀 이동을 확인하기 위해 광시야(wide field) 이미지를 획득하십시오.세포 표면에서의 이동을 관찰하고 엑소사이토시스(exocytosis)를 모니터링하기 위해 터프(turf) 이미지를 교대로 획득합니다. 앞서 설명한 대로 조사를 통해 세포막에 손상을 주어 세포 손상에 대한 리소좀의 반응을 모니터링하며, 관심 세포의 엑소사이토시스 역동성에 따라 최소 2분 또는 그 이상 동안 초당 4~6프레임으로 세포를 촬영합니다. 이 벌크 분석(bulk assay)에서는 손상된 모든 세포가 표시되고 복구에 실패한 세포가 식별되는 반면, 손상되지 않은 세포는 표시되지 않은 상태로 남습니다.fitzy dextran이 있는 상태에서 유리 구슬(glass beads)에 의해 손상된 세포들은 칼슘이 존재하는 환경에서 회복되면 녹색으로 표지됩니다. 세포가 회복될 수 있도록 하면, 손상된 세포 대부분이 회복되어 trissy dextran으로 표지되지 않습니다. 칼슘이 없는 경우에는 손상된 세포 대부분이 trissy dextran에 의해 빨간색으로 표지됩니다.본 실험은 세포 내 FM 염료의 유입을 모니터링하여 세포막 복구의 역학을 평가합니다. FM 염료 내에서 배양될 때, 손상되지 않은 세포는 세포 내 염색이 거의 또는 전혀 나타나지 않습니다. 세포막의 국소적인 레이저 손상 후, FM 염료가 세포 내로 유입되어 내부 막에 결합하기 시작하며, 이는 FM 염료 형광의 갑작스러운 증가를 유발합니다. 레이저 손상 후 세포막의 복구 능력은 칼슘에 의존적이기 때문입니다.칼슘이 존재하는 상태에서 손상된 세포는 복구가 가능하며, 이로 인해 손상 후 1분 이내에 FM 염료의 유입이 중단됩니다. 반대로, 칼슘이 없는 상태에서 복구가 진행된 세포는 복구에 실패하며, 그 결과 염료가 계속 유입되어 손상 후 4분이 지난 후에도 FM 형광이 지속적으로 증가합니다. 따라서 세포막 복구는 FM 염료 염색의 정체기(plateauing)로 이어집니다.세포막 복구가 이루어지지 않으면 염료가 계속 유입되어 정체기에 도달하지 못합니다. 벌크 유리 비드 손상법은 손상에 반응하여 소포 및 단백질이 세포 표면으로 전위되는 과정을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 트라이시 덱스트란이 존재하는 상태에서 세포에 손상을 줍니다.따라서 손상되지 않은 세포는 빨간색으로 표지되지 않는 반면, 손상된 모든 세포는 빨간색으로 표지됩니다. 1차 항체로 처리하지 않은 손상되지 않은 세포는 세포 표면 lamp one에 대해 배경 수준의 표지를 나타낸다는 점에 유의하십시오. 하지만 세포가 손상되고 칼슘이 존재하는 상태에서 회복되면 리소좀의 엑소사이토시스가 일어나며, 이에 따라 손상된 세포 표면의 lamp one 염색 수준이 증가합니다.이러한 세포 표면 lamp one 표지의 증가는 칼슘이 없는 상태에서 회복하도록 둔 세포에서 훨씬 낮게 나타납니다. 따라서 세포 표면 lamp one 염색 강도가 높은 세포의 수를 정량화하는 것과 개별 손상 세포의 세포 표면 lamp one 염색 수준을 측정하는 것은 모두, 손상에 의해 유발되는 리소좀 엑소사이토시스(lysosomal exocytosis)를 수행하는 세포의 능력을 측정하는 지표가 됩니다.이 실험은 개별 리소좀 융합의 역학, 성격 및 위치를 직접 모니터링합니다. 세포막 손상에 반응하여 펄스 레이저로 세포에 손상을 입히고, turf 이미징을 통해 세포 표면의 리소좀을 시각화함으로써 개별 세포에서 손상으로 인해 유발된 리소좀의 엑소사이토시스를 모니터링할 수 있습니다. 이 그림은 왼쪽 패널에서는 위상차 이미징으로, 가운데 패널에서는 turf 현미경으로 시각화한 세포를 보여줍니다.오른쪽 패널은 손상 후 105초가 지난 동일한 세포의 turf 이미지를 보여줍니다. 여기서는 손상으로 인해 리소좀이 세포막으로 모집되고, 이어서 엑소사이토시스가 일어나는 과정이 나타나 있습니다. 이 리소좀은 손상 전의 turf 이미지에서는 보이지 않지만, 손상 이후 세포막에 도달하면서 검출 가능해집니다.소낭이 세포막에 가까워지면 TIRF 조명에 의해 더 강하게 흥분되어 리소좀 내 DExT 가닥의 형광이 최대치에 도달하게 됩니다. 융합 공극이 열리면 리소좀의 pH가 중화되어 DExT 가닥 형광의 소광 현상이 해제됩니다. 이후 DExT 가닥이 소낭에서 세포 외부로 방출되면서 ZI 형광이 측면으로 확산되고 소낭 형광은 점차 감소하며, 이를 통해 리소좀의 다양한 손상 유발 반응을 측정할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 세포가 커다란 국소 손상으로부터 회복하는 능력을 모니터링하는 방법과, 손상에 반응하여 회복 과정을 돕는 세포 내 구획 및 단백질을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. IND 세포의 손상 반응과 회복 과정에서의 관여도를 모니터링하기 위해, 서로 다른 태그 활성 라벨링, 구획 또는 단백질을 이용한 추가 실험을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을...

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

전체 동물 MG53 - 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

열플라즈몬 천공법은 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금 나노 입자를 통합하여 세포 및 거대 단층 소포에서 원형질막 복구 중 단백질 반응을 연구합니다. 이 기술은 빠르고 국소적인 막 천자를 가능하게 하여 복잡한 원형질막 수리 기계에서 주요 단백질과 그 기능적 역할을 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

배우세요 세포막 상해 수리 메커니즘을 형광 염료와 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 라이소좀 외배출 과정을 통해 손상된 세포의 복구 역학을 분석하고 세포 생물학 연구에 활용하세요.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

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