이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

다음 실험의 전반적인 목표는 손상된 세포의 복구에 대한 원하는 치료의 효과를 관찰하고 손상된 세포를 복구하는 데 도움이 되는 세포 내 과정을 연구하는 것입니다. 이는 온전한 세포막을 통과할 수 없는 형광 염료가 있는 상태에서 세포를 손상시켜 손상된 세포의 동역학과 이러한 염료의 침입을 방지하는 능력을 평가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 손상된 세포막에서 세포 내 단백질의 출현을 모니터링하여 손상된 세포막에 융합하여 복구에 참여할 수 있는 관심 세포 구획의 능력을 식별합니다.

다음으로, 손상의 동역학을 모니터링하기 위해 관심 세포 구획과 손상된 세포막의 융합을 모니터링합니다. 이 구획의 트리거된 융합 결과는 손상된 세포 표면에서 리소좀 관련 막 단백질의 증가된 출현 및 손상된 세포에 의한 리소좀 함량 분비의 실시간 이미징을 기반으로 세포막 손상의 복구가 리소좀 외세포작용과 관련이 있음을 보여주는 결과를 얻었습니다. 이러한 방법은 세포 손상 및 복구에 대한 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 이들은 세포막의 국소 손상에 어떤 단백질과 세포 구획이 반응하는지 결정한 다음 반응의 역학을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원 중 Aurelia D 4명과 hamma stra 2명이었습니다. 치유되는 손상된 세포와 치유되지 않는 세포를 별도로 표시합니다.

세 가지 실험 조건에 대해 멸균 커버 슬립에 세포를 파종합니다. 세포가 50% 합류점 이상에 도달할 때까지 배양한 다음 섭씨 37도에서 CIM으로 C 1과 C 2를 두 번 세척합니다. 섭씨 37도에서 PBS로 C3를 세척하십시오.

그런 다음 실리콘 O-rings.Rings의 커버 슬립을 옮깁니다. 적절한 완충액에 100마이크로리터의 예열 fitzy dextran 용액을 추가합니다. 실온에서 커버 슬립 위에 40mg의 유리 구슬을 추가하고 커버를 수동으로 기울여 C 1 및 C3의 원형질막을 손상시킵니다.

경미한 부상의 경우 30도 각도로 6-8회 앞뒤로 미끄러집니다. 유리 구슬이 균일하게 퍼져 있는지 확인하여 반복 부상을 최소화하여 샘플 간 손상의 재현성을 향상시킵니다. 비교할 다른 샘플의 유리 비드 손상을 동시에 수행하여 비드가 더 이상 롤링되지 않도록 합니다.

모든 커버 슬립을 주변 CO2에서 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 비드가 굴러가지 않도록 5분 동안 수리를 진행할 수 있습니다. 유리 구슬과 fitzy dextran을 완충액 또는 PBS로 세척하여 제거합니다. 이제 커버 슬립을 O-링에 다시 놓고 100마이크로리터의 예열 라이신을 추가합니다.

고정성 트리시 덱스트란 용액: 섭씨 37도에서 주변 CO2에서 5분 동안 배양합니다. 예열 CIM으로 커버 슬립을 두 번 세탁하고 PBS 2회 세척 후 실온에서 10분 동안 4% PFA로 고정합니다. hersch dye에서 2분 동안 배양하고 PBS 세척 2회 후 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 샘플을 장착합니다.

다음으로, C 2 샘플에서 epi 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다. 배경의 빨간색과 녹색 염색 강도를 결정합니다. 그런 다음 이 값을 사용하여 모든 샘플에 대한 빨간색 및 녹색 채널을 임계값으로 설정합니다.

녹색인 총 셀 수에 점수를 매깁니다. 또한 C 1 및 C3 샘플에서 빨간색 또는 빨간색과 녹색인 셀의 점수를 매깁니다. 이제 각 상태에 대해 100개 이상의 녹색 손상 세포를 세고 복구에 실패한 세포의 비율을 손상된 모든 세포의 백분율로 표시합니다.

50% 이상으로 성장한 세포를 사전 경고된 CIM으로 Confluence로 세척하고 FM 염료로 CIM에 커버 슬립을 장착합니다. 무대 상단 인큐베이터의 홀더에서 섭씨 37도로 유지되었습니다. 일관되지만 치명적이지 않은 부상을 허용하는 최적의 힘을 사용하여 세포막 영역을 선택합니다.

이를 달성하기 위해 10밀리초 미만으로 샘플에 펄스 레이저를 조사합니다. 소프트웨어를 통해서 레이저 힘을 최고 출력의 40에서 50%에 상해 전에 시작하고 상해 후에 3 5 분 동안 계속하는 epi, 형광 및 brightfield에 있는 매 2 10 초마다 심상을 감시하고, 고치고, 취득하기 위하여 묽게하십시오. 복구 동역학을 정량화하려면 세포 FM 염료 형광을 측정하십시오.

이미징 과정에서 강도의 변화를 계산합니다. 각 조건에서 10개 이상의 셀에 대한 데이터의 평균을 구하고 평균 또는 개별 셀 값으로 플롯합니다. C 1 및 C 2의 커버 슬립을 세척하십시오.

섭씨 37도에서 CIM으로 배양 준비하고 섭씨 37도에서 PBS로 C3를 세척합니다. 그런 다음 샘플을 실리콘 O-링에 옮깁니다. 100마이크로리터의 예열 라이신 고정성 트리시 덱스트란을 추가합니다.

앞서 보여진 것처럼 C 1과 C3의 원형질막을 손상시킵니다. 그런 다음 구슬을 더 이상 굴리지 마십시오. 모든 커버 슬립을 주변 CO2에서 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 5분 동안 수리를 진행하도록 합니다.

이제 유리 구슬과 Trixie dextran을 제거하려면 덮개를 저온 성장 배지에서 세척하여 유리 구슬이 세포에서 굴러가지 않도록 합니다. 덮개 미끄러짐을 냉간 성장 매체로 두 번 헹구고 O-링으로 C-1 및 C3로 옮깁니다. 저온 완전 성장 배지에 100 마이크로 리터의 쥐 항미 램프 1 항체를 추가하고 차가운 완전 성장 배지를 C 2에 추가하여 항체 결합을 허용합니다. 차가운 CIM으로 3회 세척한 후 섭씨 4도에서 30분 동안 커버 슬립을 배양합니다.

실온에서 10분 동안 4% PFA로 모든 커버 슬립을 고정합니다. 그런 다음 CIM으로 세 번 헹굽니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 모든 커버 슬립을 15 분 동안 차단 용액으로 배양 한 다음 100 마이크로 리터 ofor, 4 88 항 쥐 항체를 15 분 동안 배양합니다.

PBS로 두 번 씻고 PBS를 두 번 씻은 후 실온에서 2 분 동안 그녀의 얼룩에서 배양합니다. 샘플을 슬라이드에 장착한 다음 C 두 세포의 이미지를 사용하여 epi 형광 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 빨간색과 녹색 채널에서 불특이적 배경 염색을 확인합니다.

이러한 배경 염색 값을 사용하여 모든 샘플에 대한 빨간색 및 녹색 채널의 임계값을 설정합니다. C 1 및 C3의 100개 이상의 적색 표지 세포를 사용하여 손상된 세포에서 램프 1 염색의 강도를 측정합니다. 성공적인 실험에서, C3의 램프 1 염색 세포는 형광 염료로 리소좀을 표지하기 위해 C 1의 세포보다 현저히 낮을 것입니다. fitzy dextran을 함유 한 성장 배지에서 50 % confluence로 성장한 세포를 배양합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 덱스트란을 2시간 동안 엔도사이토스로 만듭니다. Prewarm growth media로 세포를 세척하고 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하여 이미징 전에 모든 endocytose dextran이 lysosome에 축적되도록 합니다. Prewarm CIM에서 커버 슬립을 헹구고 섭씨 37도의 스테이지 상단 인큐베이터의 커버 슬립 홀더에 CIM에 장착합니다.

이미징을 위해 crowded fitzy dextran labeled lysosome이 없는 세포에 대해 선택합니다. 개별 리소좀의 움직임과 엑소사이토시스(movement and exocytosis). 세포 전체의 리소좀 이동을 위한 광시야 이미지를 획득합니다.

또는 세포 표면에서의 움직임을 위한 잔디 이미지를 획득하고 세포 외이입(exocytosis)을 모니터링합니다. 관심 세포의 exocytosis의 역학에 따라 최소 2분 이상 동안 초당 4-6프레임으로 세포 손상 이미지 세포에 대한 리소좀의 반응을 모니터링하기 위해 앞서 표시된 것과 같이 방사선 조사로 세포막을 손상시킵니다. 이 벌크 분석에서는 손상된 모든 세포가 표시되고 복구에 실패한 세포는 식별되는 반면 손상되지 않은 세포는 표지되지 않은 상태로 유지됩니다.

fitzy dextran이 있는 상태에서 유리 구슬에 의해 손상된 세포는 칼슘이 있는 곳에서 세포가 복구될 때 녹색으로 표시됩니다. 대부분의 손상된 세포는 복구될 수 있으며 세포가 복구될 때 트리시 덱스트란으로 표시되지 않습니다. 칼슘이 없는 경우, 대부분의 손상된 세포는 트리시 덱스트란(trissy dextran)에 의해 빨간색으로 표시됩니다.

이 실험은 FM 염료가 세포에 유입되는 것을 모니터링하여 세포막 복구의 동역학을 평가합니다. FM 다이에서 배양할 때 온전한 세포는 세포 내 염색이 거의 또는 전혀 나타나지 않습니다. 세포막의 국소적인 레이저 손상 후 FM D가 세포로 들어가 엔도막을 결합하기 시작하며, 이는 레이저 손상 후 세포막의 복구 능력이 칼슘에 의존하기 때문에 FM 염료 형광의 급격한 증가를 유발합니다.

칼슘이 있는 상태에서 손상된 세포는 복구할 수 있으며, 이로 인해 손상 후 1분 이내에 FM 염료 진입이 중단됩니다. 반대로, 칼슘이 없을 때 복구가 허용된 세포는 복구되지 않아 염료가 지속적으로 유입되어 손상 후 4분도 FM d 형광이 지속적으로 증가합니다. 따라서 세포막 복구는 FM 염료 염색의 정체로 이어집니다.

세포막 복구가 부족하면 염료가 지속적으로 유입되어 안정되지 않습니다. 벌크 유리 비드 손상 접근법은 손상에 대한 반응으로 소포 및 단백질의 세포 표면 전좌를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 세포는 trissy dextran의 존재 하에서 손상됩니다.

따라서 손상되지 않은 세포는 빨간색으로 표시되지 않지만 손상된 모든 세포는 빨간색으로 표시됩니다. 1차 항체로 처리되지 않은 손상되지 않은 세포는 세포 표면 램프 1에 대한 배경 수준의 표지를 보여줍니다. 그러나 세포가 손상되어 칼슘이 있는 상태에서 치유될 수 있게 되면 리소좀은 외세포작용(exocytosis)을 겪게 되므로 손상된 세포 표면에 램프 1 염색 수준이 증가합니다.

세포 표면 램프 1 라벨링의 이러한 증가는 칼슘이 없을 때 치유될 수 있는 세포에서 훨씬 더 낮습니다. 따라서 높은 cell surface lamp one staining이 있는 세포의 수를 정량화하는 것뿐만 아니라 cell surface lamp의 수준을 측정합니다. 1. 개별 손상된 세포에 대한 염색은 손상으로 유발된 리소좀 외세포작용(lysosomal exocytosis)을 겪을 수 있는 세포의 능력을 측정합니다.

이 실험은 개별 리소좀 융합의 역학, 특성 및 위치를 직접 모니터링합니다. 세포막 손상에 대한 반응으로 세포는 펄스 레이저에 의해 손상되고 세포 표면 리소좀은 잔디 이미징에 의해 이미지화되어 개별 세포에서 리소좀의 손상 유발 엑소사이토시스를 모니터링할 수 있습니다. 이 그림은 왼쪽 패널의 위상차 이미징과 중간 패널의 잔디 현미경으로 시각화된 세포를 보여줍니다.

오른쪽 패널은 부상 후 105초 후 동일한 셀의 잔디 이미지를 보여줍니다. 여기서, 손상은 세포막에 대한 리소좀의 동원을 유발한 후 엑소사이토시스(exocytosis)를 보여줍니다. 이 리소좀은 부상 전에는 잔디 이미지에서 볼 수 없지만 손상 후에는 리소좀이 세포막에 도달하여 검출 가능하게 됩니다.

소포가 세포막에 더 가깝게 이동함에 따라 잔디 조명에 의해 더 잘 여기되어 lysosomal fitsy dex strand 형광이 최대 값에 도달합니다. 퓨전 주입이 열리면 리소좀 pH가 중화되어 fitzy DExT 가닥 형광이 담금질됩니다. 그 후, DExT 가닥이 소포에서 세포 외부로 배출되어 ZI 형광이 측면으로 퍼지고 소포 형광이 점차적으로 감소하여 리소좀의 다양한 손상 유발 반응을 측정할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 큰 국소 손상으로부터 복구하는 세포의 능력을 모니터링하는 방법과 복구 과정에 반응하고 도움을 주는 세포 내 구획 및 단백질을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 손상에 대한 반응 및 IND 세포의 복구에 대한 관여를 모니터링하기 위해 다른 태그 바이탈 라벨링, 구획 또는 단백질을 사용하는 추가 실험을 수행할 수 있습니다.