Name: 생쥐의 망막 혈류에 대한 Intravital Video Microscopy 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 생쥐 망막 혈류 측정을 위한 intravital video microscopy 기법을 활용하여 혈관 직경과 혈류 속도를 정량화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 안과학 및 혈관 생물학 연구에 활용됩니다.

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NIH EY017599(NRH)에서 자금 지원.

동물 사용과 관련된 절차는 LSUHSC-S의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토 및 승인했으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 제시한 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 관류 용액 준비
<ol>
	<li>직경 1.9μm 마이크로스피어의 1%(중량 기준) 원액을 초음파 처리합니다.</li>
	<li>~25-30 x 106개의 녹색 형광 마이크로스피어(즉, 원액의 ~10μl)를 300μl 주사기로 회수합니다. 추가로 240μl의 식염수를 주사기로 추출하여 미세구를 희석합니다.</li>
	<li>멸균 식염수에 용해된 2 x 106 분자량 형광 덱스트란의 50 μl 용액을 3-10 mg/kg 범위의 주입 용량으로 준비합니다. 주입 시간이 될 때까지 덱스트란을 알루미늄 호일로 덮은 상태로 유지하십시오.</li>
</ol>
2. 동물 마취 및 혈관 캐뉼레이션
<ol>
	<li>혈관 캐뉼라의 외과적 삽입과 현미경 대물렌즈 아래의 고정 위치 지정을 위해 동물을 마취합니다. 다양한 장점과 단점, 전신 매개변수에 대한 잠재적 영향과 함께 다양한 마취 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 다양한 선택 사항 중에는 케타민(100-150mg/kg), 자일라진(10mg/kg) 및 아세프로마진(2mg/kg)의 조합 또는 케타민(50mg/kg)과 펜토바르비탈(50mg/kg)의 조합이 있습니다.설명된 절차는 급성이며 펜토바르비탈(150mg/kg)의 과다 투여에 의한 안락사와 개흉술로 끝납니다. 말단 시술에는 진통제를 포함할 필요가 없습니다.</li>
	<li>실험의 나머지 기간 동안 동물 아래에 가열 패드를 유지하십시오.</li>
	<li>혈관 캐뉼라의 후속 외과적 삽입 동안 인산염 완충 식염수로 눈을 촉촉하게 유지하십시오.</li>
	<li>형광 추적자의 후속 주입을 위해 혈관 캐뉼라를 준비합니다. 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브(예: 내경 0.28mm, 외경 0.61mm)를 주사기 바늘 끝에 놓고 바늘의 날카로운 끝은 지혈기로 앞뒤로 구부려 미리 부러뜨립니다.</li>
	<li>주사기와 튜브에 헤파린화된(25 U/ml) 식염수를 채웁니다.</li>
	<li>하복부의 한쪽을 면도하고 절개하여 대퇴 정맥을 노출시킵니다.</li>
	<li>대퇴 정맥을 캐뉼레이션하려면 5.0 봉합사로 혈관을 묶고 혈관을 부분적으로 절개한 다음(혈관 직경의 약 1/2) 튜브를 혈관에 삽입하고 캐뉼러 섹션 주위에 봉합사를 묶은 튜브를 고정합니다.</li>
</ol>
3. Intravital Microscopy를 위한 준비
<ol>
	<li>1% 트로피카미드 점안액 한 방울 떨어뜨린 다음 2.5% 하이프로멜로스 점안액 한 방울로 눈동자를 확장시킵니다.</li>
	<li>5mm 유리 커버슬립으로 눈을 덮습니다.</li>
	<li>정립 현미경의 현미경 대물렌즈 아래에 위치할 플렉시글라스 보드에 동물을 놓습니다. 전략적으로 수술용 거즈를 머리 아래에 배치하여 대물렌즈를 통해 중앙 망막과 시신경 디스크로 직접 축을 이룰 수 있도록 합니다.</li>
	<li>현미경을 통해 광학 디스크의 초점을 맞추고, 저전력 4X 대물렌즈가 있는 디스크를 찾고 플루오레세인 필터를 사용합니다.</li>
</ol>
4. 속도를 측정하기 위한 형광 미세구의 주입
<ol>
	<li>4X 대물렌즈를 사용하여 광학 디스크가 시야 중앙에 있는 망막에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>형광 마이크로스피어 용액을 250μl/min/kg의 속도로 주입합니다.</li>
	<li>~8msec의 카메라 노출 시간을 사용하여 광학 디스크 주변에서 볼 수 있는 망막을 비디오로 녹화합니다.</li>
	<li>충분한 길이의 비디오가 녹화되면(1-2분) 마이크로스피어 주입을 중단하십시오. 일부 마이크로스피어 용액은 사용되지 않은 상태로 남아 있을 가능성이 높습니다.</li>
</ol>
5. 직경을 측정하기 위한 형광 플라즈마 마커 주입
<ol>
	<li>4X 대물렌즈를 사용하여 광학 디스크가 시야 중앙에 있는 망막에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>준비된 형광 덱스트란 용액을 대퇴 정맥에 볼루스로 ~5초 동안 주입하고 비디오를 녹화합니다. 이 비디오는 세동맥과 정맥의 정체성을 결정하는 데 도움이 되며, 세동맥을 먼저 관류합니다. 정확한 노출 시간은 중요하지 않지만 카메라 노출 시간을 ~8msec로 설정하여 이 단계를 수행합니다.</li>
	<li>10X 대물렌즈와 20-40msec의 노출 시간으로 전환하여 표재성 망막의 4-7개 세동맥과 4-7개의 정맥 각각을 비디오로 촬영할 수 있는 해상도를 향상시킵니다. 한 번에 볼 수 있는 망막의 약 한 사분면에 초점을 맞추고(및 비디오 녹화), 광학 디스크의 중심이 시야의 한쪽 모서리에 있도록 합니다. 빛/염료 유도 광독성의 가능성을 줄이기 위해 현미경 빛이 조직을 비추는 시간을 최소화하기 위한 시도가 이루어져야 합니다17.</li>
</ol>
6. 비디오 분석
<ol>
	<li>마이크로미터 스케일을 사용하여 μm/픽셀 변환을 위해 비디오 시스템을 보정합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 녹화된 비디오를 재생합니다.</li>
	<li>형광 덱스트란의 볼루스 주입 비디오에서 세동맥과 정맥을 식별합니다.</li>
	<li>10X 대물렌즈로 기록된 4-7개의 세동맥과 4-7개의 정맥 각각에 대해 형광 덱스트란으로 채워진 직경을 측정하고 볼 수 있는 길이를 따라 혈관당 평균 5개의 직경을 측정합니다.</li>
	<li>동일한 세동맥과 정맥 각각에 대해 선택 편향을 피하기 위해 각 혈관에서 10개의 연속적인 미세구 줄무늬를 사용하여 형광 미세구의 줄무늬 길이를 측정합니다. 줄무늬 길이를 노출 시간으로 나누어 마이크로스피어 속도를 계산합니다(예: 160μm/8msec = 20μm/msec = 2cm/sec). 선박당 평균 10 속도.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 각 선박에 대한 체적 유량을 계산합니다: 유량 = 평균 속도 × π × 직경2/4.</li>
	<li>세동맥 유속과 정맥 유속을 별도로 합산하여 총 망막 혈류를 구합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

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이 생체 내 비디오 현미경 기술은 생쥐뿐만 아니라 쥐에게도 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 몇 가지 가정에만 의존하지만 우리가 설명한 대로 마취 상태와 동공 확장과 함께 사용하도록 제한됩니다. 다른 가정 및 제한 사항은 다음과 같습니다.
1. 눈의 굴절 특성으로 인한 최소 광학 배율 오류의 가정. 다른 사람들18-20에서 설명한 바와 같이, 각막과 커버슬립 사이의 공간을 점안액 유체 층으로 채우는 방법은 각막의 굴절력을 상쇄합니다. 설명되지 않은 배율은 길이와 직경 측정에 영향을 미칩니다.
2. 광학 해상도의 한계. 우리는 일반적으로 직경 측정에 10X 대물렌즈(작동 거리 = 1.05cm)를 사용하며, 이 대물렌즈의 개구수는 0.25이고 공칭 분해능은 ~1.2μm(측정의 불확실성에 대략)입니다. 전체 해상도는 이 배율에서 카메라/이미지 프로세서 해상도...

망막은 신체에서 가장 신진대사가 활발한 조직 중 하나이므로 충분한 혈액 공급이 필요합니다. 두 개의 분리된 순환이 이 요구를 충족시킵니다: 망막의 바깥쪽 부분에 대한 맥락막 순환과 망막의 안쪽 부분에 대한 망막 순환. 당뇨병성 망막병증, 산소유발 망막병증, 망막 동맥 또는 정맥 폐색, 뇌졸중의 병리학적 메커니즘과 결과를 이해하기 위해서는 망막 관류에 대한 조사가 필수적입니다. 망막 혈류를 정량화하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었으며, 각 기술에는 장점, 단점, 한계 및 가정이 있습니다. 이러한 기술 중에는 모세혈관 전 세동맥1,2, 정량적 자가방사선 촬영3,4, 광학 미세혈관병증-광학 일관성 단층 촬영5,6, 자기 공명 영상7,8 및 생체 내 비디오 현미경9-16에 머무르는 7-8 μm 직경의 미세구의 주입이 있습니다. 후자의 장점으로는 망막 혈관 및 혈류를 직접 실시간 시각화할 수 있고, 몇 가지 사소한 가정에만 의존할 수 있으며, 비디오 카메라가 부착된 형광 현미경을 갖춘 실험실의 경제성을 들 수 있습니다. 생체 내 비디오 현미경검사 9-16에 대한 이전 연구에서는 형광 덱스트란이 혈장 마커로 사용되었으며, 형광 표지된 적혈구(기증자 동물에서 추출)가 속도 마커로 사용되었습니다. 현재 프로토콜에서는 적혈구 대신 직경 1.9μm의 형광 표지된 미세구를 사용하여 속도를 측정하며, 이러한 변경은 혈액 세포 기증자의 필요성을 무효화합니다.

<table><tbody><tr><td>형광 미세구</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (녹색)</td><td></td></tr><tr><td>고분자량 형광 덱스트란</td><td>분자 프로브</td><td>D-7137 (녹색); D-7139 (빨간색)</td><td></td></tr><tr><td>현미경 시스템</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + 첨부 파일</td><td></td></tr><tr><td>4X 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>개구수 0.13; 작동 거리 17.2 mm</td></tr><tr><td>10X 대물</td>렌즈 <td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>개구수 0.25; 작동 거리 10.5 mm</td></tr><tr><td>트로피카미드 점안 솔루션</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% 트로피카미드</td><td></td></tr><tr><td>Hypromellose 안과 솔루션</td><td>HUB 제약</td><td>2.5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>캘리포니아 대학교 샌프란시스코 베일 랩</td><td>마이크로 매니저</td><td></td></tr><tr><td>현미경 용 디지털 비디오 카메라</td><td>광도 인식</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 픽셀 해상도; 픽셀 크기 6.45 x 6.45 &mu; 중</td></tr></tbody></table>

생쥐의 망막 혈류에 대한 intravital video microscopy 측정

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

망막 혈류의 변화는 안구 질환 및 시각 기능 장애에 기여하거나 그 결과일 수 있습니다. 따라서 변경된 관류의 정량화는 망막 병리학의 메커니즘에 대한 연구에 도움이 될 수 있습니다. 형광 추적자의 생체 내 비디오 현미경은 망막 혈관 구조, 특히 중앙 망막 동맥에서 분기하는 세동맥과 중앙 망막 정맥으로 이어지는 정맥의 혈관 직경과 혈류 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 혈류량은 직경과 속도, 세동맥 흐름의 합계와 별도로 정맥 흐름으로 계산하여 총 망막 혈류의 값을 제공할 수 있습니다. 이 논문 및 관련 비디오는 1) 마취된 동물의 생체 내 현미경 검사를 위한 눈 준비, 2) 혈류 속도를 측정하기 위한 형광 미세구의 정맥 주입, 3) 망막 미세혈관 구조의 현미경 시각화를 돕기 위한 고분자량 형광 덱스트란의 정맥 주입, 4) 관류된 망막의 비디오를 얻기 위해 디지털 현미경 카메라를 사용하고 5) 비디오를 분석하기 위해 이미지 처리 소프트웨어를 사용합니다. 쥐의 망막 혈류량을 측정하는 데에도 동일한 기술을 사용할 수 있습니다.

그림 1은 실험에서 얻은 비디오의 단일 프레임을 보여주며, 패널 A-D 및 F-I는 4X&#160;대물렌즈와 8 msec 노출 시간(및 비디오 파일 크기를 줄이기 위한 2 x&#160;2 픽셀 비닝)으로 캡처한 형광 미세구체 스트리크를 보여줍니다.그림 1E는 그림의 다른 패널에 나타난 망막 혈관의 방향을 보여줍니다. 모든 비디오 프레임에서 형광 스트리크가 초점에 맞는 것은 아니지만, 일부 프레임에는 분석에 사용할 수 있는 여러 개의 스트리크가 있을 수 있습니다 (예:&#160;패널 C, D, G, H 및 I). 본 실험에서 (8 msec 노출 시간 동안 캡처된) 대부분의 형광 스트리크 길이는 120-170 µm 범위였으며, 이는 1.5-2.1 cm/sec의 속도에 해당합니다.
그림 2는 2 x&#160;106 분자량의 fluorescein isothioc...

Intravital 현미경 검사는 동물에서 망막 혈관 직경, 혈류 속도 및 총 망막 혈류를 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 망막 혈류에 대한 Intravital Video Microscopy 측정

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 망막 혈류를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 마취된 쥐의 캐뉼레이션된 대퇴 정맥을 통해 형광 미세구를 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 쥐의 망막 혈관을 통해 흐르는 미세구를 비디오로 기록하는 것입니다.다음으로, 대퇴 정맥을 통해 형광 덱스트란을 주입하고 망막 혈관을 통해 흐르는 모습을 비디오로 캡처합니다. 마지막 단계는 망막 혈류를 계산하기 위해 녹화된 비디오에서 미세구 속도와 혈관 직경을 측정하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 형광 현미경을 사용하여 망막 혈류를 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다.이 방법은 혈류의 변화가 당뇨병성 망막병증에 기여하는 정도와 같은 망막 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 쥐의 망막에서이 기술을 시연 할 것입니다. 일반적인 방법은 다른 조직과 쥐에서도 사용할 수 있습니다.직경 1.9 미크론 마이크로 스피어의 1 % 스톡 용액을 초음파 처리하고, 10 마이크로 리터의 스톡 용액을 300 마이크로 리터 주사기로 회수 한 다음 240 마이크로 리터의 멸균 식염수를 주사기로 끌어 들여 마이크로 스피어를 희석합니다. 다음으로, 주입 용량이 킬로그램 당 5 밀리그램이 될 수 있도록 충분한 멸균 식염수에 용해 된 형광 덱스트란의 50 마이크로 리터 용액을 준비합니다. 그런 다음 융합 시간이 될 때까지 덱스트란을 알루미늄 호일로 덮습니다.동물을 마취하고 견인 핀치로 적절한 마취를 테스트한 후 동물 아래에 발열 패드를 놓습니다. 인산염 완충 식염수로 눈을 촉촉하게 유지하십시오. 그런 다음 주사기 바늘의 날카로운 끝을 지혈기로 앞뒤로 구부려 부러뜨립니다.그런 다음 무딘 바늘 끝에 20cm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 놓고 튜브에 헤파린 식염수를 채웁니다. 이제 밀리리터당 25단위의 헤파린 식염수를 준비합니다. 하복부 한쪽을 면도한 후 주사기에 헤파린 식염수를 채우고 복부와 다리 사이의 전이 부위를 1cm 절개하여 대퇴 정맥을 노출시킵니다.그런 다음 대퇴 정맥이 넓어지는 것에 바로 근접한 혈관을 5개의 T 봉합사로 묶습니다. 다음으로, 혈관 직경의 절반을 부분 절개하고 수평에서 20-30도 각도로 축을 따라 튜브를 혈관에 삽입합니다. 캐뉼러 섹션 주위에 봉합사가 묶인 튜브를 고정합니다.현미경 검사를 위해 동물을 준비하려면 1% 트로픽 에이드 점안액 한 방울로 눈동자를 확장한 다음 2.5% 하이퍼 멜로 점안액 한 방울을 떨어뜨

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스의 망막 혈류에 대한 생체 내 동영상 현미경 측정

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

이 기사는 이미지 획득 및 분석을 위한 특정 방법론과 함께 생체 내 현미경 이미징을 사용하여 마우스 간 혈관 구조의 개별 혈관 내 혈류 속도를 동적으로 측정하고 정량화하는 자세한 방법에 대해 보고합니다.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

형광 추적자를 사용하는 개방형 혈관 창 접근 방식은 달팽이관 혈류(CoBF) 측정에 충분한 분해능을 제공합니다. 이 방법은 정상 및 병리학 적 조건에서 마우스에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화에 대한 연구를 용이하게합니다.

열린 혈관 창과 생체 내 형광 현미경을 사용한 마우스 달팽이관의 심방 혈류 측정

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

생쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 패턴 형성의 메커니즘을 이해하는 데 특히 흥미롭습니다. 이 프로토콜은 광학 디스크에서 고정된 거리에서 형광 혈관 조영술 안저 영상에서 마우스 망막 혈관의 직경을 자동으로 측정합니다.

Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

학습하세요 생쥐 망막 혈류 측정을 위한 intravital video microscopy 기법을 활용하여 혈관 직경과 혈류 속도를 정량화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 안과학 및 혈관 생물학 연구에 활용됩니다.

생쥐의 망막 혈류에 대한 Intravital Video Microscopy 측정

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