연속의 설계 및 운영

이 절차의 전반적인 목표는 식물 전체에 걸쳐 균일하게, 또는 구조 조직과 대사 조직에 차등적으로 탄소 13과 질소 15가 고농도로 농축된 식물 시료를 생산하는 것입니다. 이는 먼저 식물 성장을 위한 기밀 챔버를 구축함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 챔버 내의 온도, 습도 및 이산화탄소 수준을 조절하여 식물에 적합한 성장 조건을 유지하는 것입니다.

다음으로, 식물을 13C가 포함된 공기, 이산화탄소, 그리고 질소 15가 포함된 관수 및 시비 조건의 밀폐 챔버에서 성장시킵니다. 마지막 단계는 수확 수주 전 챔버에서 서로 다르게 표지된 식물들을 제거하여 표지를 중단함으로써, 대사 물질 내의 탄소 13과 질소 15의 농축도를 낮추는 것입니다. 식물체 수확 후 구조적 성분과 비교하여, 열수 추출 및 동위원소 비 질량 분석법을 사용하여 전체적인 동위원소 표지 정도와 표지 강도의 차이를 측정합니다.

엽면 시비나 반복적인 펄스 표지법과 같은 다른 방법보다 연속 표지법이 갖는 주요 장점은, 대사 또는 구조적 성분별로 차등 표지가 가능한 균일하게 표지된 식물 시료를 생성할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면, 흰색으로 도색된 강철 바닥이 있는 알루미늄 프레임에 3.18 millimeter 두께의 투명 아크릴 벽과 6.35 millimeter 두께의 투명 아크릴 천장을 장착하여 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표지 챔버를 구축하십시오. 챔버의 크기는 특정 식물 성장 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 여기에 표시된 챔버의 크기는 1.2 by 2.4 by 3.6 meter이며 15 liter 화분 40개를 수용할 수 있습니다. 모든 이음매를 적절한 실리콘 밀봉제로 처리하여 챔버가 기밀 상태인지 확인하십시오.

탈착 가능한 윙 너트를 사용하여 조이고 풀 수 있는 기계 나사에 도어를 장착하십시오. 라벨링 챔버와 직접 인접한 영역에서 공기 누출을 방지하기 위해 웨더스트립으로 도어를 밀봉하십시오. 컨트롤 센터를 모니터에 장착하고 챔버 내의 온도, 습도 및 이산화탄소를 조절하십시오.

챔버 내부로 들어가는 전기 배선과 가스 튜브가 실리콘으로 잘 밀봉되어 공기 누출이 없는지 확인하십시오. 선택 사항으로, 빛 투과율을 높이고 일장(day length)을 조절하며 챔버 온도를 조절하기 위해 챔버에 조명을 추가하십시오. 증발기 코일은 챔버 내부에, 컴프레서와 응축기 코일은 열을 방출할 수 있도록 챔버 외부에 설치된 상업용 분리형 에어컨을 설치하십시오.

다음으로, 챔버 내에 소형 실내 제습기를 설치합니다. 제습기 옆 바닥에 구멍을 뚫고, 제습기의 배수관을 이 구멍을 통해 물이 담긴 병 속으로 통과시킵니다. 이렇게 하면 배수관에 기밀 씰이 형성되어 압력 평형이 이루어집니다. 습도 센서가 포함된 Omega eye 시리즈와 같은 프로그래밍 가능 컨트롤러를 제습기에 연결하여 챔버 내의 습도를 조절합니다.

그런 다음 다이아프램 펌프가 장착된 적외선 가스 분석기 또는 ER A를 설치하여, 챔버의 공기를 ER A를 통해 지속적으로 흡입한 후 다시 챔버로 되돌려 보내도록 합니다. 이를 통해 폐쇄형 시스템을 유지하면서 챔버 내의 이산화탄소 농도를 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 이어서, 두 개의 순수 이산화탄소 가스 탱크를 이산화탄소 제어 시스템에 연결합니다.

탱크 중 하나에는 10 atom percent 이상의 13 C 이산화탄소가 포함되어 있어야 하며, 다른 하나에는 천연 존재비의 13 C 이산화탄소가 포함되어 있어야 합니다. 탱크 조절기를 20 PSI로 설정한 후, Ergo 소프트웨어를 통해 이산화탄소 주입을 제어할 수 있도록 가스 라인의 조절기 뒤에 솔레노이드 밸브를 설치하십시오.

솔레노이드 밸브를 솔리드 스테이트 릴레이 프로그램을 통해 ER rga에 연결하여 개폐를 제어하십시오. ergas 소프트웨어의 저알람(low alarm) 설정을 통해 챔버 내 이산화탄소 농도가 특정 값 미만으로 떨어질 때 솔레노이드 밸브가 열리도록 하고, 이산화탄소 농도가 상한 설정값에 도달하면 밸브가 닫히도록 데드밴드(deadband)를 설정하십시오. 솔레노이드 밸브 뒤에 두 개의 가스 탱크 라인 각각에 미터링 밸브를 부착하고, 이를 조심스럽게 조정하여 대기 중의 carbon 13 농축 수준을 원하는 정도로 맞추십시오.

여기서는 4.4 atom %의 탄소-13 농축물을 사용합니다. 배출구를 서로 연결하고, 마지막으로 라인을 팬 사이의 챔버 중앙으로 연결하여 표지된 이산화탄소가 챔버 전체에 고르게 분산되도록 함으로써 관수 시스템을 설정합니다. 먼저, 화분당 하나의 점적 관수 링을 만들고 관수 튜브를 챔버 벽면에 만든 작은 구멍을 통해 외부로 연결합니다.

그 다음, 챔버 외부에 공기가 새는 것을 방지하기 위해 실리콘 코킹으로 관수 튜브 주변의 구멍을 밀봉합니다. 관수 튜브를 연동 펌프 튜브에 연결하고, 관수 간에 공기가 새지 않도록 작은 호스 클램프를 장착합니다. 생존력을 보장하기 위해 화분에 심기 전 미리 발아시킨 후, 신선한 토양 슬러리로 묘목을 접종합니다. 유익한 미생물을 도입하기 위해, 토양으로부터 표지되지 않은 탄소와 질소가 유입되는 것을 차단할 수 있도록 무토양 상토를 화분에 채웁니다.

여기서는 모래, 버미큘라이트와 다공성 세라믹 프로파일의 혼합물을 사용합니다. 종자가 발아하면, 최소량의 배양토가 담긴 화분에 묘목을 조심스럽게 이식합니다. 그런 다음 화분을 챔버로 옮기고, 각 화분에 개별 관수 호스를 연결하여 조립합니다.

마지막으로 챔버 도어를 밀폐하고, 이산화탄소 농도가 최소 200에서 250 ppm까지 낮아질 때까지 에어 펌프에 소다라임 스크러버를 연결하여 외부 이산화탄소를 제거합니다. 그 후 13 C 이산화탄소 혼합 탱크를 사용하여 챔버를 다시 400 ppm까지 채웁니다. 천연 존재비 이산화탄소 오염을 최소화하기 위해 재배 기간 내내 챔버를 닫힌 상태로 유지하십시오.

먼저 98 atom % $^{15}\text{N}$ 질산칼륨과 천연 존재비 $^{15}\text{N}$ 질산칼륨을 혼합하여 $^{15}\text{N}$ 표지 Hyland형 비료 용액을 만든 다음, 이를 나머지 Hoagland 용액에 첨가합니다. 여기서는 7 atom % $^{15}\text{N}$ 용액을 사용하여 시비합니다. 연동 펌프를 사용하여 $^{15}\text{N}$ 표지 비료 용액을 관수 튜브를 통해 공급합니다.

UNC 클램프로 관수 호스를 고정하고, 요구 사항 및 실험 설계에 따라 개별 식물에 다양한 양의 비료를 투여합니다. 그 다음, 호스에 물을 펌핑하여 관수 호스 내의 비료를 씻어냅니다. 비료 낭비를 최소화하기 위해 추가하는 액체의 총량은 화분의 보수력을 초과하지 않아야 합니다.

수분 및 관수 후, 챔버의 공기 누출을 방지하기 위해 모든 호스의 클램프를 다시 조입니다. 구조적 성분과 대사 성분을 차별적으로 표지하려면, 수확 1~3주 전에 표지 챔버에서 식물을 꺼냅니다. 균일하게 표지할 식물은 수확 시까지 챔버 내에 유지합니다.

노화를 유도하기 위해, 준비가 되었을 때 관수를 중단하십시오. 먼저 지상부 생물량을 절단하여 식물을 수확합니다.

지상부 바이오매스를 수확한 후, 상토와 뿌리를 6mm 코어 스크린 위에 부어 상토로부터 뿌리를 분리합니다. 그런 다음 뿌리를 2mm 스크린 위에서 헹구어 남아 있는 상토 잔여물을 제거합니다. 뿌리에 엉겨 붙어 있는 상토가 있을 경우 핀셋을 사용하여 제거하고, 이후의 실험을 위해 뿌리를 공기 중에서 건조시킵니다.

3번의 성장 시즌 운영 기간 동안, 챔버는 제어 센터에서 설정한 대로 온도 26~29°C, 습도 36~56%, 그리고 이산화탄소 농도 360~400 ppm 사이를 성공적으로 유지하였습니다. 여기 제시된 것은 2011년 성장 시즌의 *Andra pogon* Girard의 대표적인 결과입니다. 야간 호흡 중의 이산화탄소 축적은 성장 중인 식물에 피해를 주지 않는 것으로 보이며, 일출 후 빠르게 흡수됩니다.

목표치인 7 atom % $^{15}\text{N}$ 호글리 용액을 통한 질소 15 표지는 6.7 atom % $^{15}\text{N}$의 고표지 식물 시료를 생성했으며, 목표한 $^{15}\text{N}$ 표지에서 약간의 희석이 발생한 것은 분갈이 흙에 포함된 일부 천연 존재 질소 또는 토양 접종균으로 인한 것일 수 있습니다. 목표치인 4.4 atom % $^{13}\text{C}$ 이산화탄소를 이용한 탄소 13 표지는 4.46 atom % $^{13}\text{C}$의 결과를 나타냈습니다. 균일하게 표지된 식물 시료 전체에 걸쳐, 수확 7일, 14일 또는 22일 전에 챔버에서 제거된 차등 표지 식물들은 $^{13}\text{C}$ 및 $^{15}\text{N}$ 함량에서 유의미한 차이를 보였습니다.

온수 추출물로 얻은 대사 성분과 온수 추출 잔류물로 얻은 구조 성분은 식물의 대사 및 구조 재료가 차별적으로 표지되었음을 나타냅니다. 이러한 기술 개발 이후, 지속적인 이중 동위원소 표지는 생지화학 연구자들이 거시 및 나노 규모에서 환경 내 식물 성분의 운명과 변형을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.