Name: 연속의 설계 및 운영 13 C 및 15 N 레이블 상공 회의소, 대사 및 구조, 식물 동위 원소 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 식물 조직의 균일 및 차등 동위원소 라벨링을 위한 연속 13C 및 15N 라벨링 챔버 설계 및 운영 방법을. 이 기술은 대사 및 구조 성분의 정량적 분석에 필수적입니다.

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콜로라도 주립 대학의 식물 성장 시설과 EcoCore 분석 시설에이 프로젝트에 도움을 준 많은 학생들과 교사들에게 특별한 감사. 이 작품은 USDA 국립 교제를 요구 NSF DEB 부여 # 0918482, 토양 생태 연구를위한 Cotrufo-Hoppess 기금에 의해 투자된다.

1. 상공 회의소 건설 <ol><li> 식물의 성장에 대한 최대 자연광 잠재력 수 있도록 온실에서 라벨 챔버를 구축합니다. 충분한 전원 공급 장치는 모든 챔버 부품에 전원을 공급하는 데 사용할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 3.175 ㎜ 두께의 투명 아크릴 벽 (폴리 카보네이트도 적합 할 것)와 6.35 mm 태양 반사율을 극대화하기 위해 흰색으로 그린​​ 스틸 바닥 알루미늄 프레임에 두꺼운 투명 아크릴 천장을 설치하여 라벨 챔버를 구축합니다. 챔버의 치수는 개별 연구 목적에 맞게 맞춤화 할 수있다. </li><li> 콘크리트 블록 (19 ㎜) 합판에 ¾에 챔버를 탑재합니다. </li><li> 아크릴 유리, 알루미늄 프레임과 강 바닥과 함께 모든 구성 요소를 고정하는 나사를 사용에 구멍을 뚫습니다. </li><li> 완벽한 밀봉을 보장하기 위해 실리콘 코킹 모든 솔기를 밀봉. </li><li> 레모를 사용하여 아래 나사 될 수있다 긴 나사의 아크릴 패널의 한 부분을 장착하여 문을 구축vable 날개 너트. </li><li> 공기 누출을 방지하기 위해 기상 스트리핑과 도어를 밀봉. </li><li> 모든 온도, 습도, CO 2 제어 및 감시 장비를 장착하는 제어 센터와 같은 챔버에 직접 인접 영역을 선택합니다. </li><li> 조심스럽게 모든 전기 배선 및 가스 배관에 대한 제어 센터에 인접한 챔버 벽에 작은 구멍을 드릴. 공기 누출을 방지하기 위해 전선 및 튜브 주위 구멍을 밀봉하는 실리콘 코킹을 사용한다. </li><li> CO 2의 높은 수준 (예 : 800 ppm)를 함께 작성하고 밤새 앉아 시켜서 공기 누출에 대한 실을 테스트합니다. 챔버 내의 CO 2 농도는 원래의 수준으로 유지되고있는 경우, 그것은 기밀이다. 농도가 하룻밤 인하의 경우 밀폐 밀봉이 달성 될 때까지 모든 솔기는 검사 및 실리콘 코킹으로 재 밀봉해야한다. </li><li> 높은 빛의 조건에 맞게 일부 식물의 경우, C의 바로 외부로 타이머에 연결 등을 추가hamber 빛의 침투 및 공장의 생산성을 높일 수 있습니다. </li></ol> 2. 온도 및 습도 제어 <ol><li> 챔버 내부에 위치한 냉각 (증발기) 코일과 열을 발산하는 온실 외부에 압축기 및 응축기 코일과 상용 분리형 공기 조화 장치를 설치하여 챔버 온도를 조절한다. 원하는 온도를 유지하기 위해 에어컨을 설정한다. </li><li> 실내에 습도를 제어하는​​ 작은 방 제습기를 사용합니다. <ol><li> 제습기에 인접한 챔버의 바닥을 통해 배수 구멍을 드릴. </li><li> 제습기에서 응축수 콜렉터를 제거하고, 챔버의 바닥에 배수 구멍을 통해 제습로부터 배액관을 연결한다. </li><li> 챔버 아래로 직접 배출 할 수있는 제습기에 물이 가득 열려있는 항아리를 놓습니다. 이 밀폐 씰을 만들어뿐만 아니라 압력 평형을 허용. </li></ol></li><l난&gt; 챔버 내부의 습도 센서와 제어 센터에서 이러한 오메가 iSeries의 컨트롤러와 컨트롤러를 설치합니다. <ol><li> 솔리드 스테이트 릴레이 제습 시스템 제어기를 연결하고 높은 알람 조습을 설정하고 챔버 내의 최적의 성장 조건을 유지하는 스윙. 최적의 온도와 습도 조건이 다른 식물 종에 따라 다를 것입니다. </li></ol></li></ol> 3. CO 2 제어 <ol><li> 13 C-CO 2는 농축이 순수한 CO 2 가스 탱크, 10 원자 %의 하나를 사용하여 달성된다 (13) C-CO 2 이상, 1.1 원자 %, C (13)-CO 2 (천연 풍부) 중 하나. </li><li> 다이어프램 펌프가 지속적으로 적외선 가스 분석기 (IRGA)를 통해 챔버 공기를 그린 다음 다시 챔버에 공기 펌프, 따라서 폐쇄 된 시스템 (그림 1)를 유지함으로써 CO 2 농도를 모니터링합니다. </li><li> SE원하는 범위 내에서 CO 2 농도를 유지하기 위해 IRGA 소프트웨어에 따 낮은 경보 및 데드 밴드. 여기, 우리는 360-400 ppm의 사이에 CO 2 농도를 유지하기 위해 40 ppm의 데드 밴드와 함께 360 ppm으로 낮은 알람을 사용합니다. </li><li> 각각의 탱크에 계량 밸브를 연결하고 신중하게 목표 13 C의 농축 수준을 달성하도록 조정합니다. 20 PSI에 탱크 조절기를 설정합니다. </li><li> 계량 밸브와 각 탱크의 조절기 사이에 솔레노이드 밸브를 삽입합니다. 함께 두 개의 계량 밸브의 콘센트와 챔버의 중심에 파이프를 가입. 와이어 솔레노이드 밸브 (도 1)를 제어하기 IRGA 출력 고체 릴레이. </li></ol> 4. 웹 기반 원격 모니터링 시스템 <ol><li> 로컬 파일에 한 번씩 30 초에 로그인하여 IRGA 소프트웨어의 CO 2 농도를 모니터링합니다. </li><li> 선택하는 (펄의 예 또는 다른 프로그래밍 언어) 사용자 정의 유틸리티를 만들기현재까지 노트북 타임 스탬프와 함께 로컬 CO 2 로그 파일로부터 항목, 및 백엔드 웹 애플리케이션에 업로드. </li><li> 온도 및 습도 센서 데이터를 쿼리하는 웹 애플리케이션을 설정한다. </li><li> 공기 조화 시스템이 실패하면 식물을 파괴 할 가능성이 온도 스파이크를 방지하기 위해 상기 챔버를 5 분마다의 온도의 상태를 확인하기 위해 모니터링 시스템을 사용한다. </li><li> 예기치 않은 온도 스파이크 또는 CO 2 방울을 즉시에 참석 할 수 있도록 모든 표준 웹 브라우저에서 CO 2, 온도 및 습도 데이터를 모니터링합니다. </li></ol> 5. 관개 시스템 <ol><li> 포트 당 아크릴 유리 챔버의 벽에있는 하나의 작은 구멍을 드릴. </li><li> 포트 당 하나의 관개 링을 생성하고 외부로 챔버 벽을 통해 관개 튜브를 공급하는 관개 튜브를 사용합니다. </li><li> 실리콘 코킹과 관개 튜브 주위에 구멍을 밀봉공기 누출을 방지한다. </li><li> 챔버의 외부에, 연동 펌프의 튜브에 관개 튜브를 연결합니다. </li><li> 물 사이에 공기 누출을 방지하기 위해 모든 관개 튜브를 닫 작은 호스 클램프를 사용합니다. </li></ol> 6. 화분 용 식물 <ol><li> 재배되고있는 식물에 적합한 냄비 크기를 선택합니다. 여기, 40, 15 L 포트가 사용됩니다. </li><li> 모래, 질석 및 프로필 다공성 세라믹을 혼합하여 토양이없는 화분 믹스를 만듭니다. </li><li> , 채워진 냄비 건조 무게 물을 냄비에 몸을 담근 채가 완전히 배출 할 수 있도록하고, 냄비에 젖은 무게로 포팅 믹스의 수분 보유 능력을 테스트합니다. 그 초과 표시 비료와 물을 물을 때 냄비에서 누출하지 않도록하기 위해이 최대 물 보유 용량을 사용합니다. </li><li> 전에 냄비를 심는 화분 용 흙에 씨앗을 발아. 이 경우에만 성공적으로 발아 씨앗 라벨 챔버에서 시작되었는지 확인합니다. </li><li> T 접종<html> 그는 유익한 미생물을 소개하는 신선한 토양 슬러리 모종. </li><li> 씨앗이 발아 한 후, 조심스럽게 원하는 수의 화분에 모종을 이식. </li><li> 화분에 심은 후, 챔버에 냄비를 이동하고 개별 관개 호스로 각 포트를 조립합니다. </li></ol> 7. 상공 회의소 씰링 <ol><li> 우선 챔버 도어를 밀봉 할 때, 외부 공기의 질량이 큰 챔버 공간을 채운다. 13 C-CO 2 탱크의 혼합물을 사용하여 400 ppm의 최대 다시 실을 작성하기 전에 적어도 200 ~ 250 ppm으로 아래로 CO 2 농도를 제거하기 위하여 공기 펌프에 소다 석회 스크러버를 연결하여 외부 CO 2를 닦습니다. </li><li> 자연의 풍요 로움 CO 2 오염을 최소화하기 위해 성장시기의 기간을 통해 챔버는 폐쇄 유지하십시오. </li><li> 시각적으로 식물의 성장을 모니터링하고 필요에 따라 수정 및 관개를 조정합니다. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. 수정 및 관개 <ol><li> 관개 시스템을 통해 식물을 비옥하게하는, 그런 수정 호글 랜드의 솔루션 (23), 비료 솔루션을 사용합니다. </li><li> 자연의 풍요 로움 (15)와 15 N-KNO 3 98 원자 %를 혼합하여 타겟 원자의 15 % N 수준에서 15 N-KNO 3 subsolution를 사용하여 15 N과 비료 레이블 N-KNO 3 (0.37 원자 % 15 N). </li><li> 포팅 믹스의 수분 보유 능력을 기준으로 전체 실에 대한 각각의 수정 이벤트에 따라 비료 솔루션, 충분히 섞는다. 유리 항아리에 하나의 냄비에 비료의 적절한 금액을 놓고 많은 항아리 화분이 준비를합니다. </li><li> 관개 호스를 언 클램프 및 비료 솔루션을 항아리에 각각 배치하고 그들을 연동 펌프에 연결합니다. </li><li> 개별 드립 IRRI를 통해 연동 펌프를 통해 물을 펌프로 물 식물증거 자료 호스 정기적으로 식물이 필요로. </li><li> 호글 랜드의 솔루션과 시비가 생산성을 극대화 할 수있는 공장의 생산성이 증가함에 따라 증가하는 영양 수요, 공장 수요 또는 실험 설계를 수행한다. </li><li> 우선, 튜브 조류 및 박테리아 성장을 최소화 통해 물 린스를 펌핑 한 다음, 관개 호스를 통해 호글 랜드의 용액 펌프. </li><li> 수정 및 챔버 공기 누설을 제거하기 위해 관개 후 모든 호스를 Reclamp. </li></ol> 9. 통일 및 차등 라벨링 <ol><li> 구조 및 대사 성분의 차이 라벨의 경우 1-3 주 전에 수확에 라벨 실에서 식물을 제거합니다. 균일하게 표시 할 수있다 식물은 수확 할 때까지 지속적으로 봉인 라벨 챔버에 남아있는 15 N-호글 랜드의 솔루션과 관개 수 있습니다. </li><li> 그들은 충분한 빛을받을 수 있도록이 기간 동안 온실에서 제거 된 식물 유지자연 풍부한 13 ℃에서 CO 2 </li><li> 차동 15 N 표시를 들어, 비옥하고 평소와 같이 식물을 관개 계속하지만, 호글 랜드의 비료 용액에 자연의 풍요 15 N-KNO 3를 사용합니다. </li></ol> 10. 수확 <ol><li> 식물 senesce하기 시작 포팅 매체가 마르기 때문에 이전에 수확하는 식물 일주에 물을 중지합니다. </li><li> 챔버를 열고 지상 바이오 매스의 즉각적인 클리핑 수확 냄비를 이동 </li><li> 거친 화면에 포팅 믹스와 뿌리를 부어. </li><li> 포팅 믹스에서 뿌리를 분리하고 포팅 믹스 무료 뿌리를 흔들어 화면을 사용합니다. </li><li> 2mm 체에 뿌리를두고 나머지 포팅 물질을 제거하기 위해 물로 씻어 내십시오. 뿌리에 집착 수있는 지렁이를 제거하는 핀셋을 사용합니다. </li><li> 미래의 실험을위한 준비에 자연 건조시킨 뿌리를 허용합니다. </li></ol><ol><li> 라벨 챔버 바이오 매스를 결정하기 위해 자연 건조 식물 재료의 무게를. </li><li> 화학 분석을위한 표본 그라인드. </li><li> 125 ㎖의 산에 오븐 건조 (60 ° C) 쓰레기의 2.0 g을 놓고 플라스크를 세척하고 탈 이온수 50 ㎖를 추가합니다. </li><li> 예열 (60 ° C) 교반기 플레이트에 샘플을 놓고 플라스크에 교반기 막대를 배치합니다. 200 RPM의 교반을 설정하고 샘플을 30 분 동안 가열 할 수 있습니다. </li><li> 30 분 후, 나일론 진공 여과 시스템에서 메쉬 20 μm의 관통 담가 용액을 고를. </li><li> preweighed 산 세척 튜브 추출물을 전송하고 동결. </li><li> 60 ° C에서 preweighed 알루미늄 팬과 건조한 고체 쓰레기 잔류 물을 전송 뜨거운 물 잔류 물 질량을 결정하기 위해 건조 후 팬과 쓰레기의 무게를 측정. </li><li> 열수 추출물을 동결 건조 및 열수 추출물의 질량을 결정하기 위해 무게. </li><li> 오븐 건조 분석 (60 ℃) 쓰레기, 동결 건조 뜨거운 물추출하고, 원소 분석기에서 오븐 건조 뜨거운 물 잔류 - 동위 원소 비율 질량 분석기 (EA-IRMS). </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

연속 동위 원소 라벨 챔버위한이 디자인은 균일하고 차분 13 C를 생성하기 위해 사용하고 15 N은 A.를 표지 하였다 이후 현장 및 실험실 실험 gerardii. 세 가지 작업 성장 시즌 동안, 챔버는 성공적으로 온도, 습도, 설정 매개 변수 내에서 CO 2 농도 (그림 2)를 유지하고있다. 온도 제어 시스템의 신뢰성은 높은 태양 복사가 밀폐 챔버가 과열 될 수있는 여름의 피크시 중요합니다. 성장하는 식물의 증산에 의한 여분의 습기를 제거하는 것은 그 식물의 기공은 광합성 흡수 (22)와 물 응축 빛 침투를 억제하거나 챔버의 구조를 손상하지 않습니다에 대해 열린 상태로 유지 보장합니다. IRGA 소프트웨어에 의해 CO 2 농도의 거의 지속적으로 모니터링을 지속적으로 유지식물의 13 C 라벨들은 챔버에서 성장하는 동안. 때문에 A의 높은 광합성 활동 gerardii이 챔버에서 성장, CO 2는 광합성 활동이 360 ppm으로, 대략 매 15 ~ 20 분까지 CO 2 농도를 그린 피크 성장시기의 일광 시간 동안 자주 시스템에 주입 하였다. 의 계량 충실하고 균일 한 식물 조직 라벨의 성장시기를 통해 제어 4.4 원자 %, 13 C 분위기 허용 자연의 풍요 13 C-CO 2 탱크. 13 C-CO 2 생산도 13 C-나트륨을 혼합함으로써 달성 될 수있다 중탄산염 또는 13 C-탄산나트륨 염산, 시스템 그러나이 유형은 더 복잡하고 더 많은 모니터링 및 유지 보수가 필요, 그래서 우리는 13 C-CO 2 가스를 사용하는 것이 좋습니다. CO 2 conce을 모니터링하기위한 중요한 고려IRGA를 사용 ntrations 13 C-CO 2를 측정 할 때 적외선 분석기는 민감도의 3 분의 2를 잃는 것입니다. 우리의 4.4 % 13 C-CO 2 혼합물 약 2.9 % PPM이 과소 평가는 우리에게 큰 관심사가 아니었지만, 더 높은 13 C 레벨 27에서 라벨을 때 더 중요한 문제가 될 수 있습니다. A.의 gerardii 다년생 사라졌고가 graminoid 종 대초원 따뜻한 계절입니다. 이 챔버의 설계는 A.에 최적화 된 gerardii 생산 (그림 1). 챔버의 크기 및 높이가 A.의 최대 높이 생산성을 고려하여 선택되었다 현장에서 gerardii뿐만 아니라, 미래의 실험에 대해 원하는 식물 바이오 매스 생산을위한. A. gerardii는 필드 (24, 25)의 제한 등으로 알려져있다. 외부 구조 층 (26)에 비교하여 온실 내에서 PAR는 30-47% 의해 감소 될 수있다. 이후 우리의 공장의는 온실 내부에 아크릴 유리 실에서 성장했다, PAR 제한은 우려했다. 전원을 켜면 형광등이 빛에 민감 종의 생산성을 향상하는 데 도움이되었을 수도있는, 9.5 %로 챔버 내에서 PAR 증가했다. 크기, 조명, 영양 요구, 온도 민감성, 및 토양 수분 등의 식물 특정 생리적 요구의 다른 유형의 성장이 챔버 디자인을 사용할 때는 신중 식물 성장을위한 최적의 조건을 유지하도록 맞추어 질 것이다. 이러한 10 원자 % 13 C-CO 2, 98 원자 % 15 N-KNO 3, 라벨의 효율성 비싼 동위 원소 표지 화합물, 작업을 할 때 고려해야하는 중요한 사항이다. 이 챔버 설계는 챔버를 밀봉 에어 누설에 최소화하기 위해 모든 노력을함으로써 챔버의 13 중 C 라벨을 최적화합니다. 이 챔버는 성장 기간 동안 개방하지 않으면, 13 C 레이블 없음챔버로부터 ED CO 2는 대기로 유출된다. CO 2는 야간 호흡하는 동안 구축하면 성장하는 식물을 손상 나타나지 않고 빨리 일출 (그림 2) 후 촬영됩니다. 차동 표시하는 동안, 챔버는 간단히 차동 표시된 냄비를 제거하기 위해 열린하지만이 지속적으로 표시 식물 (표 1)의 대상으로 4.4 원자 %, 13 C 라벨을 희석을하지 않은 것으로 보입니다. 13 C 라벨도 밖으로 세척하여 최적화 된 초기 대기는 밀봉에 실에 갇혀있다. 대기 CO 2의 초기 스크럽없이 챔버에 예비 시험 중에 식물을 생산하기 잎에 비해 생산 제 나뭇잎 희석 13 C 레벨이 측정되었다. 챔버 폐쇄에 따라 대기 CO 2의 초기 스크럽에서 연속 13 C 라벨을 허용하여이 문제를 제거하기 위해 나타납니다성숙 모종. 모래, 질석, 점토의 토양이없는 포팅 혼합물을 유지하는 것은 또한 자연의 풍부한 토양 호흡에서 이산화탄소 오염을 제거한다. 시스템에서 토양의 제거는 다른 식물 종에 고유 수있는주의 수정 및 접종 고려 사항을 요구한다. 6.7 원자 % 15 N (테이블에 매우 표시된 식물 재료를 생산 대상으로 7 원자 % 15 N Hoegland의 솔루션을 통해 15 N 표시 1). 대상 15 N 레이블에서 약간 희석 포팅 혼합 또는 기본 토양 접종에서 일부 자연 풍부 N에 의해 발생할 수 있습니다. 화합물의 생합성 동안 13 C (15 N)의 자연적인 차별 운동 분류하고 합성 된 화합물의 nonstatistical 동위 원소 분포의 결과로 발생합니다. 따라서, C의 경우는, 보조 용품 (예 : 지질기본 제품 (탄수화물)에 비해, 페놀 화합물)는 일반적으로 13 C 고갈된다. 온수 추출하고 균일하게 표시 식물 (표 1의 뜨거운 물 잔류 원자 % 13 C의 약간의 차이에서 알 수있는 바와 같이 식물이, 풍부한 13 C 분위기에서 재배되는 때 자연 (13) C 차별은 계속 나타납니다 ). 이 자연스러운 운동 분획은 농축에 비해 매우 작고, 라벨링의 균일 성을 손상시키지 않는다. 구조 및 대사 식물 조직의 차동 라벨은 쓰레기 분해, 미생물 생태학 및 토양 유기물의 형성에 고급 연구에 대한 가능성이있는 새로운 기술이다. C (13) 및 온수 추출 및 온수 잔기의 15 N의 차이가 낮은, 상당한 13 C의 희석 및 침출 15 N을 나타낸다구조 식물 재료 (뜨거운 물 잔류)에서 분자량 화합물 (뜨거운 물 추출물) 차동 라벨 (P &lt;0.005)의 7, 14, 22 일 후에. 식물 조직이 차등 라벨링 생태계를 통해 별도의 구조와 대사 구성 요소의 운명을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 13 C 차동 라벨은 15 N 차동 라벨보다 더 극단적이었다. 13 C-CO 2라는 분위기에서 식물을 제거 할 때 15 N 라벨이 여전히 약간의 시간 포팅 믹스에 남아있는 15 N 희석이 더 느리게 발생하면서는, 13 C 희석의 직접 원인 일 수 있습니다. 15 N의 더 과감한 차동 표시를 들어, 하나의 챔버 외부 성장의 마지막 주 동안 이전에 자연의 풍요 수정에 물을 냄비 세척을 고려할 수 있습니다. 이 연속 (13)의 설계 및 운영 &lt;균일 또는 차등, 신진 대사 및 구조, 식물 조직 라벨링 / SUP&gt; C, 15 N 라벨링 시스템은 첨단 연구를위한 동위 원소 표지 된 식물 재료를 제조하는 새로운 방법을 제공합니다. 이 챔버의 설계 및 운영 세부 사항은 4.4 원자 %, 13 C, 7 원자 % A. 15 N 표시를 위해 선택되었다 gerardii하지만, 다른 식물의 종류와 동위 원소 표지의 수준에 맞게 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 성장 조건은 관심의 특정 식물 종의 크기, 온도, 습도, 빛, 물, 영양 요구에 맞게 맞게 조정해야합니다. 18 O 2와 H 레이블링은 관개 시스템에 사용되는 물을 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 여기에 설명 된 시스템은 균일의 여러 문제점을 해결하고 식물 재료의 13 C 라벨 차동. 이 기본적인 챔버 설계는 ADV위한 높게 표시된 식물 물질을 생산하는 다른 연구 그룹에 의해 사용될 수있다생태계의 생지 화학적 연구를 잡힌.

식물 - 토양 - 대기 프로세스의 역학을 이해하는 것은 정확하게 예측하기위한 중요한 방법 글로벌 탄소 (C), 질소 (N) 현재와 미래의 환경 조건에서주기 기능. 안정 동위 원소는 식물 - 토양 - 대기 C와 N 순환의 양적 연구에 강력한 도구입니다. 식물 재료의 생태계를 통해 희귀 안정 동위 원소를 추적하는 생물 지구 화학적 순환 연구에 중요한 정보를 제공하고, CO 2 플럭스 및 예를 들면 4,8,9 프로빙 소규모 안정 동위 원소 바이오 마커에 ​​토양 유기물 형성. 15 N 라벨, 또는 2 H 또는 식물 조직에서 18 O 등의 안정 동위 원소 13 C 라벨을 결합하여 높은 탐지, 식물과 토양의 생화학의 결합 연구에 사용 추적, 아직 복잡한 기판을 제공한다. 균일 또는 차동 구조 및 대사 식물 재료 광고 레이블을 할 수있는 능력C와 N 생태계를 순환에 대한 복잡한 문제를 해결하기 위해 DS 추가 기능. C 및 N 회계 정량적 연구에서 동위 원소 표지 된 식물 물질을 사용하는 이점은, 그러나, C (13) 및 하나 또는 균일 차분 레이블이 15 N 표지 물질을 생산하는 능력에 달려있다. 동위 원소 표지 식물 C와 N 동화 (10), 분배 (11)와 rhizodeposition 12를 해결 연구에 사용되었다. 균일하게 13 C, 15 N 표시 식물 재료는 쓰레기 분해 1,4의 연구를위한 복잡한 표시 기판을 제공하고, 토양 유기물 형성 2,6, 토양의 CO 2 토양 먹이 그물 (13)을 연구 배출량 4, 토양 C의 연구 체류 시간 2,14. 라는 식물 재료에서 13 C 레이블 바이오 숯을 이용한 연구는 또한 이전에 간과에 대한 새로운 정보를 공개하기 시작토양 문자 풀 15. 15 N 2, H, 18 O 표시 물과 비료 처리를 통해 달성하기 위해 상대적으로 쉬운 반면, 문제는 13 C-CO 2 고정을 통해 균일하게 13 C라는 식물 재료를 생산하는 존재합니다. 밀폐 된 챔버 내에서 만기 모종의 연속 동위 원소 표지는 식물 전체에 균일 한 동위 원소 라벨을 생산하고 있습니다. 이러한 반복 펄스 라벨 (16)와 잎 신청 또는 (17, 18)를 위킹과 같은 다른 방법으로 균일하게 동위 원소 표지 된 식물 재료, 또는 특정 C-화합물의 명확한 차이 라벨 (예를 들면 신진 대사 대 구조) 19을 생산하지 않습니다. 동위 원소 표지에 중요한 고려 사항으로 인해 라벨에 사용 된 희귀 동위 원소가 풍부한 화합물의 높은 비용 효율을 라벨링한다. 연속 13 C 라벨이 과거 2-4,20에 사용되었지만, 우리의 지식이없는높은 라벨링 효율과 양의 동위 원소 표지의 균일 정확한 제어의 증거 연속 라벨 챔버의 게시 된 세부적인 기술 설명입니다. 쓰레기 분해 및 토양의 최전선에서 유기물 형성 연구는 신진 대사 식물 재료 (즉, 침출, 불안정한, 저 분자량 화합물) 및 구조 식물 재료 (예. 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스가) 미생물의 관점에서 다르게 처리되는 개념이다 효율성, 토양 유기물의 형성, 장기 토양 C 저장 5-7를 사용합니다. 차등의 구조와 대사 구성 요소에 표시되는 식물 재료는, 그러므로, 쓰레기 분해 및 토양 유기물 형성 연구 발전에 유용한 도구입니다. 이중 동위 원소 차동 라벨은 여러 풀 동위 원소 techniqu을을 사용하여 에코 시스템을 통해 별도의 구조와 대사 구성 요소의 추적을 허용전자 21. 밀폐 된 챔버 내에서 13 C와 다른 동위 원소 연속 동위 원소 표지 식물의 생산성 및 동위 원소 표지 효율을 극대화하기 위해 생리적 조건을 심는 세심한주의가 필요합니다. 낮 온도 스파이크는 밀폐 된 챔버 내에서 성장하면 식물의 손상을 방지하기 위해 제어 할 수 있어야합니다. 습도와 온도의 최적 범위는 오픈 공장 기공 및 CO 2 흡수 (22)를 유지하기 위해 필요합니다. 빛 가용성을 최소화하고 챔버 구조가 손상 될 수 있습니다 챔버 벽의 습도 원인 흐림, 높은 수준의. 고가의 무거운 동위 원소 표지 화합물로 작업 할 때 (예를 들면 토양 유기물로 포팅에서 오는) 챔버의 자연 풍부한 동위 원소를 제거하고 외부 공기에 노출을 방지하여 라벨 효율을 동위 원소주의 깊은 고려가 중요합니다. 여기서, 우리는 건물 및 운영하기위한 방법을 제시수정 및 15 N 라벨링 동안 균일하게 표지 된 또는 별개의 단계에서 표지 된 구조적 및 대사 성분을 갖는다 어느 식물 재료의 제조를위한 연속적인 이중 13 C, 15 N 동위 원소 라벨 챔버. 13 C 라벨링은 챔버 레벨에서 제어된다 개별 포트 수준에서 제어. 대표적인 결과는 성장시기에 걸쳐 온도, 습도, 및 CO 2 농도를 제어하기위한 본 방법의 기능을 설명하기 위해 도시된다. 성장 Andropogon의 gerardii의 결과는, 카우는 균일 또는 차등라는 식물 재료를 생산하는이 방법의 능력을 보여줍니다. 기재된 특정 챔버 설계 및 동작 방식은 상이한 종의 식물을 성장뿐만 아니라, H 2 O (18) 또는 라벨을 수용하도록 변형 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>40인치 원격 타워 팬</td><td>리빙 액센트</td><td>FS10-S3R-A</td><td></td></tr><tr><td>42인치 전기 타워 팬(리모컨 포함</td><td>LASKO</td><td>2559</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Slim 분할형 에어컨</td><td>미쓰비시 전기</td><td>R410A</td><td></td></tr><tr><td>전자 24시간 시간 스위치</td><td>Intermatic</td><td>ET100C</td><td>작동 형광등 시스템</td></tr><tr><td>iSeries 습도 및 온도 컨트롤러</td><td>오메가</td><td>CHiTH-i8DV33-5-El</td><td></td></tr><tr><td>솔리드 스테이트 릴레이</td><td>오메가</td><td>SSRL240</td><td></td></tr><tr><td>CKR 시리즈 솔리드 스테이트 릴레이</td><td>크라이돈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>솔레노이드 코일</td><td>데이턴</td><td>6X543</td><td></td></tr><tr><td>가스하운드 CO2 분석기</td><td>LI-COR</td><td>LI-800</td><td></td></tr><tr><td>제습기</td><td>데이턴</td><td>1DGX4</td><td></td></tr><tr><td>특수 가스 조절기</td><td>Airgas</td><td>CGA 580</td><td></td></tr><tr><td>T5 Hight 출력 상업용 형광등 시스템</td><td>수력 발전소</td><td>FLT48</td><td></td></tr><tr><td>에어 펌프</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-1901</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 카트리지 펌프 헤드 시스템</td><td>Cole Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>1900 시리즈 네트워크 스위치</td><td>촉매</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로필 Porus Ceramic 탑 드레싱</td><td>그린 학년</td><td></td><td></td></tr><tr><td>산업용 석영 40 메쉬</td><td>Unimin</td><td>4095</td><td></td></tr><tr><td>Mycorrhizae 전문 성장 매체</td><td>ProMix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>질석 및 펄라이트</td><td>Thermo-Ran</td><td>C633</td><td></td></tr><tr><td>질산 칼륨 - 15 N 98 원자 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>335134</td><td></td></tr><tr><td>탄소 - 13C Dioxide 10 원자 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>600180</td><td></td></tr><tr><td>의료용 CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레귤레이터</td><td>Airgas</td><td>CGA 350</td><td></td></tr><tr><td>4 in box fans</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT 튜빙</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-06508-24</td><td></td></tr></tbody></table>

연속의 설계 및 운영<sup&gt; 13</sup&gt; c 및<sup&gt; 15</sup통일 또는 차등을위한&gt; n 레이블 상공 회의소, 대사 및 구조, 식물 동위 원소 라벨링

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

식물 재료의 생태계를 통해 희귀 안정 동위 원소를 추적하는 것은 생태계 과정에 대한 가장 중요한 정보를 제공하며, CO에서 작은 규모의 안정 동위 원소의 바이오 마커 2 플럭스와 토양 유기물 형성 프로빙. 18 O 2 H는 생지 화학적 변환하는 동안 복잡한 화학 양 론적 관계에 대한 더 많은 정보를 공개 할 수있는 잠재력을 가지고, 15 N과 같은 13 C 여러 안정 동위 원소를 결합. 동위 원소 표지 된 식물 재료는 쓰레기 분해 및 토양 유기물의 형성 1-4의 다양한 연구에 이용되고있다. 이들 및 다른 연구에서, 그러나, 식물 재료의 구조적 요소를 다르게 미생물 활용 및 장기 탄소 저장 5-7 환산 대사 성분 (예. 침출 가능한 저분자 화합물)보다 동작 것이 명백했다. 구조 및 대사 구성 요소를 연구 할 수있는 능력별도 생태계 생지 화학 연구의 선두 발전을위한 강력한 새로운 도구를 제공합니다. 여기에서 우리는 13 C 균일 식물 전체에 표시하거나 차동 구조적 및 대사 식물 성분에 표시되는 어느 하나 15 N 표지 된 식물 재료를 제조하는 방법을 설명한다. 여기서, 우리는 연속 13 C 및 다양한 연구 목적에 맞게 수정 될 수있다 (15) N 라벨 챔버의 구성 및 동작을 제시한다. 차동 라벨이 이전에 수확 챔버 주에서 성장하는 식물을 제거함으로써 달성되는 동안 균일하게 표시 식물 재료는 수확하는 모종의 연속 라벨에 의해 생산됩니다. 성장 Andropogon 대표 결과 카우가 목표 수준에서 효율적으로 라벨 식물 재료에 대한 시스템의 능력을 입증 gerardii. 이 방법을 통해 우리는 4.4 원자 %, 13 C, 6.7 원자 % 15 &lt;으로 식물 재료를 생산합니다/ SUP&gt; N 유니폼 식물 라벨, 또는 차별적으로 최대 1.29 원자 % 13 C 0.56 원자 %로 표시되어 물질의 대사와 (각각 뜨거운 물 추출 및 온수 잔류 성분) 구조 구성 요소에있는 15 N. 도전은 밀폐 13 성공적인 공장 생산을위한 C-CO 2 분위기에서 적당한 온도, 습도, 이산화탄소 농도, 빛의 수준을 유지하는 거짓말. 이 챔버 기술을 효과적으로 생태계 생물 지구 화학적 순환에 실험에 사용하기 위해 균등 또는 차등 다중 동위 원소 표지 된 식물 재료 생산하는 유용한 연구 도구를 나타냅니다.

우리의 라벨 챔버의 크기는 1.2 MX 2.4 MX 3.6 m이며, 40,15 L 포트 (그림 1)를 보유하고있다. 컴퓨터 IRGA 제어 시스템은 하루의 광합성 활성 기간 (그림 2a) 동안 360과 400 ppm으로 우리의 설정 값 사이의 CO 2 농도를 유지했다. IRGA의 낮은 CO 2 알람 기능은 농도가 최소 임계 값 (예 : 360 ppm)를 하회 할 때 13 C에서 CO 2 챔버로 자연의 풍요 로움 탱크에 충실 할 수 있도록 솔레노이드 밸브를 트리거. 농도가 상위 설정 점 (예를 들면 400 PPM)에 도달 할 때 데드 밴드 기능의 흐름을 중단했다. iSeries의 온도와 성장시기에 걸쳐 설정 매개 변수 내에서 기후 조건을 개최 에어컨과 제습기에 연결 습도 모니터링 시스템 (그림 2B). 우리는 애에 하나의 톤 (3.5 kW 급) 공기 조절 장치를 사용챔버 멋진 EP. 원격 모니터링 시스템은 기록 된 데이터가 표준 웹 브라우저에 의해 언제든지 볼 수 있었다. CO 2 농도, 온도 및 습도 값은 아래로 24 시간 단위로, 지난 24-240 시간에 그래프를 표시 할 웹 응용 프로그램에서 샘플링되었다. 이 매일 변동이 예상 범위 내에서 이었다는 것을 확인하는 빠른 영상을 만들었습니다. 웹 인터페이스를 보는 또한 최근의 데이터를 수신하지 같은 잠재적 문제 챔버 현재 상태뿐만 아니라 제공된 경고를 보였다. 언제든지 완전한 데이터 집합은 웹 인터페이스에서도 다운로드 할 수 있습니다. 우리의 광합성 활성 복사 (PAR)를 측정 즉시로와 양자 센서를 사용하여 여름과 하루의 중간 중간에의 표시등이없는 네 개의 지점에서 내부와 챔버의 외관. 챔버의 PAR은 외부보다 31.5 % 낮은 때 챔버 등 w오프 감수하고 표시등이 켜져 있었다 외부보다 22 % 낮은. 따라서, 챔버 조명 크게 9.5 % (P &lt;0.05)에 의해 챔버 내에 PAR 침투를 향상시키는 데 도움. 우리의 지속적인 라벨링 시스템은 A.의 2천7백59그램을 생성 할 수 있었다 gerardii 바이오 매스의 37 %는 지상 바이오 매스이었고, 63 %는 belowground 바이오 매스했다. 우리는 (그림 1, 표 1 참조) 이에 따라 두 CO 2 탱크에 솔레노이드 밸브를 설정하여 우리의 균일 한 식물 재료에서 4.4 원자 %, 13 C 전체 공장의 라벨을 달성했다. 우리는 수정 호글 랜드의 솔루션 (23)의 KNO 3 subsolution (표 1)에 15 N-KNO 3 0.37 원자 %로 15 N-KNO 3 98 원자 %를 혼합하여 우리의 균일 한 식물 재료에서 6.7 원자 % 15 N 전체 공장의 라벨을 달성 . 우리는 A를 물을 성장 바다에 걸쳐 750 ㎖의 총 유체 (물 플러스 호글 랜드의 솔루션)와 gerardii 주간아들. 우리는 공장의 생산성에 따라 주당 호글 랜드의 솔루션을 표시 15 N의 200 ~ 500 ㎖로 수정 된. 우리는 균일하고 차별적으로 표지 된 식물 재료 동위 원소 간의 차이가 있다면 결정하기 위하여 온수 추출 방법을 이용했다. 차동 표시 식물을 수확에 우리는 완전히 죽은 그들이 가능성이 차별적으로 표시되지 않은 별도로 이들을 취급 된 잎을 제거. 13 C의 내용을 볼 때, 네 개의 내장 일 전체 공장과 열수 추출물에 서로 유의 한 차이가 있었지만, 뜨거운 물 잔류 물 하루에 14, 22 (표 1) 서로 유의 한 차이가 없었다. 매일 내의 식물 조직 분획을 비교할 경우, 열수 추출물과 잔류 물을 모두 나흘 서로 크게 달랐다과 일 (22)에 의해 전체 식물, 추출물, 및 잔류 물을 모두 signi되었습니다서로 다른 ficantly (표 1). 식물 성분으로 15 N의 설립을위한 법인 설립 및 식물 조직 분수의 일의 차이가 있었다. 열수 추출물의 경우 편입 일의 네 15 N에 서로 유의 한 차이가 있었고, 전체 공장과 뜨거운 물에 설립 짧은 일 설립 (표 1)의 긴 일에 비해 유의 한 차이가 있었다 잔류. 균일 한 식물에서 식물 조직 분획은 15 N으로 서로 차이가 없었다하지만 열수 추출물과 잔류 물을 차등 적 표지 깔짚을위한 15 N으로 서로 크게 달랐다. 모든 동위 원소 값은 % 농후 높은 수준으로 사용하는 것보다 더 정확한 표기 원자 % (원자 %) 표기법 (식 1)을 사용하여보고된다동위 원소 농축 21. 예를 들면 : <img alt="" height="54" src="/files/ftp_upload/51117/51117eq2.jpg" width="202" /> (1) 이 연구를 위해, 우리는 SAS 버전 9.2을 사용하여 통계 분석을 실행했습니다. 우리는 쌍 t-검정을 사용하여 챔버 내부 및 외부 조명 레벨 사이의 차이를 시험했다. 우리는 13 C 및 PROC ANOVA에 일원 변량 분석 (ANOVA)를 사용하여 뜨거운 물 추출 및 온수 잔기의 15 N 라벨 사이의 차이점을 시험 하였다. 우리는 다중 비교 분석을 위해 던컨의 여러 범위의 테스트를 사용했습니다. 의미는 0.05 P 수준에서 받아 들여졌다. 우리는 데이터 분석의 가정을 만족하는지 테스트하는 윌 콕슨 순위 합 시험을 사용 하였다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1.jpg" /> 그림 1. Schemat조감도에서 40 포트 용량 연속 멀티 동위 원소 표지 챔버의 IC도. 실선은 가스 또는 물 튜브를 대표하는 동안 점선은, 전기 배선을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2.jpg" /> . 그림 2) 평균 CO 2 농도 (ppm)를 (+ / -. 전체 성장시기에 대한 이십사 시간 동안 SE) B) 평균 기온 (° C), 열린 원, 습도 (%)을, 원 마감 . 전체 성장시기에 대한 이십사 시간 동안 (+ / - SE)는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" target="_blank">큰 메신저를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>나이. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="17"><td height="17" style="height:17px;width:77px;"></td><td style="width:85px;"></td><td style="width:92px;"> 통일 (0) </td><td style="width:97px;"> 차동 (7) </td><td style="width:104px;"> 차동 (14) </td><td style="width:104px;"> 차동 (22) </td></tr><tr height="19"><td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;"> 전체 쓰레기 </td><td> 13 C 원자 % </td><td> 4.46 ± 0.02 AAB </td><td> 3.93 ± 0.05 바 </td><td> 3.64 ± 0.03 칼슘 </td><td> 3.35 ± 0.06 DB를 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15 N 원자 % </td><td> 6.69 ± 0.07 금주 모임 </td><td> 6.72 ± 0.01 금주 모임 </td><td> 6.33 ± 0.06 바 </td><td> 6.41 ± 0.07 바 </td></tr><tr height="19"><td height="38" rows팬 = &quot;2&quot;스타일 = &quot;높이 : 38px; 폭 : 77px;&quot;&gt; 온수 추출 </td><td> 13 C 원자 % </td><td> 4.59 ± 0.04 금주 모임 </td><td> 3.35 ± 0.06 비비 </td><td> 2.79 ± 0.06 CB </td><td> 2.37 ± 0.03는 Dc </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15 N 원자 % </td><td> 6.69 ± 0.03 금주 모임 </td><td> 6.43 ± 0.01 비비 </td><td> 5.89 ± 0.07 DB를 </td><td> 6.16 ± 0.05 CB </td></tr><tr height="19"><td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;"> 온수 잔류 </td><td> 13 C 원자 % </td><td> 4.37 ± 0.06 AB </td><td> 4.1 ± 0.03 바 </td><td> 3.79 ± 0.10 칼슘 </td><td> 3.66 ± 0.05 칼슘 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> 15 N 원자 % </td><td> 6.57 ± 0.04 바 </td><td> 6.71 ± 0.02 금주 모임 </td><td> 6.45 ± 0.02 칼슘 </td><td> 6.44 ± 0.03 칼슘 </td></tr></tbody></table> 표 1. <strong&gt; 균일하고 차별적으로 표시 쓰레기에 대한 동위 원소 조성과 쓰레기 화학. 챔버 외부 차동 라벨의 일이 괄호에 있습니다. 정관의 일 사이의 비교는 각 변수 (열 아래) 소문자입니다 (행에서) 대문자와 쓰레기 분수 사이.

이 방법은 연속 13 C 균일 또는 차동 식물 조직 라벨 15 N 동위 원소 표지 챔버를 구축하고 운영하는 방법을 설명합니다. 신진 대사 및 Andropogon의 gerardii의 구조 라벨링 대표 결과에 대해 설명합니다.

연속의 설계 및 운영<sup&gt; 13</sup&gt; C 및<sup&gt; 15</sup통일 또는 차등을위한&gt; N 레이블 상공 회의소, 대사 및 구조, 식물 동위 원소 라벨링

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

이 절차의 전반적인 목표는 식물 전체에 걸쳐 균일하게, 또는 구조 조직과 대사 조직에 차등적으로 탄소 13과 질소 15가 고농도로 농축된 식물 시료를 생산하는 것입니다. 이는 먼저 식물 성장을 위한 기밀 챔버를 구축함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 챔버 내의 온도, 습도 및 이산화탄소 수준을 조절하여 식물에 적합한 성장 조건을 유지하는 것입니다.다음으로, 식물을 13C가 포함된 공기, 이산화탄소, 그리고 질소 15가 포함된 관수 및 시비 조건의 밀폐 챔버에서 성장시킵니다. 마지막 단계는 수확 수주 전 챔버에서 서로 다르게 표지된 식물들을 제거하여 표지를 중단함으로써, 대사 물질 내의 탄소 13과 질소 15의 농축도를 낮추는 것입니다. 식물체 수확 후 구조적 성분과 비교하여, 열수 추출 및 동위원소 비 질량 분석법을 사용하여 전체적인 동위원소 표지 정도와 표지 강도의 차이를 측정합니다.엽면 시비나 반복적인 펄스 표지법과 같은 다른 방법보다 연속 표지법이 갖는 주요 장점은, 대사 또는 구조적 성분별로 차등 표지가 가능한 균일하게 표지된 식물 시료를 생성할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면, 흰색으로 도색된 강철 바닥이 있는 알루미늄 프레임에 3.18 millimeter 두께의 투명 아크릴 벽과 6.35 millimeter 두께의 투명 아크릴 천장을 장착하여 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표지 챔버를 구축하십시오. 챔버의 크기는 특정 식물 성장 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 여기에 표시된 챔버의 크기는 1.2 by 2.4 by 3.6 meter이며 15 liter 화분 40개를 수용할 수 있습니다. 모든 이음매를 적절한 실리콘 밀봉제로 처리하여 챔버가 기밀 상태인지 확인하십시오.탈착 가능한 윙 너트를 사용하여 조이고 풀 수 있는 기계 나사에 도어를 장착하십시오. 라벨링 챔버와 직접 인접한 영역에서 공기 누출을 방지하기 위해 웨더스트립으로 도어를 밀봉하십시오. 컨트롤 센터를 모니터에 장착하고 챔버 내의 온도, 습도 및 이산화탄소를 조절하십시오.챔버 내부로 들어가는 전기 배선과 가스 튜브가 실리콘으로 잘 밀봉되어 공기 누출이 없는지 확인하십시오. 선택 사항으로, 빛 투과율을 높이고 일장(day length)을 조절하며 챔버 온도를 조절하기 위해 챔버에 조명을 추가하십시오. 증발기 코일은 챔버 내부에, 컴프레서와 응축기 코일은 열을 방출할 수 있도록 챔버 외부에 설치된 상업용 분리형 에어컨을 설치하십시오.다음으로, 챔버 내에 소형 실내 제습기를 설치합니다. 제습기 옆 바닥에 구멍을 뚫고, 제습기의 배수관을 이 구멍을 통해 물이 담긴 병 속으로 통과시킵니다. 이렇게 하면 배수관에 기밀 씰이 형성되어 압력 평형이 이루어집니다. 습도 센서가 포함된 Omega eye 시리즈와 같은 프로그래밍 가능 컨트롤러를 제습기에 연결하여 챔버 내의 습도를 조절합니다.그런 다음 다이아프램 펌프가 장착된 적외선 가스 분석기 또는 ER A를 설치하여, 챔버의 공기를 ER A를 통해 지속적으로 흡입한 후 다시 챔버로 되돌려 보내도록 합니다. 이를 통해 폐쇄형 시스템을 유지하면서 챔버 내의 이산화탄소 농도를 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 이어서, 두 개의 순수 이산화탄소 가스 탱크를 이산화탄소 제어 시스템에 연결합니다.탱크 중 하나에는 10 atom percent 이상의 13 C 이산화탄소가 포함되어 있어야 하며, 다른 하나에는 천연 존재비의 13 C 이산화탄소가 포함되어 있어야 합니다. 탱크 조절기를 20 PSI로 설정한 후, Ergo 소프트웨어를 통해 이산화탄소 주입을 제어할 수 있도록 가스 라인의 조절기 뒤에 솔레노이드 밸브를 설치하십시오.솔레노이드 밸브를 솔리드 스테이트 릴레이 프로그램을 통해 ER rga에 연결하여 개폐를 제어하십시오. ergas 소프트웨어의 저알람(low alarm) 설정을 통해 챔버 내 이산화탄소 농도가 특정 값 미만으로 떨어질 때 솔레노이드 밸브가 열리도록 하고, 이산화탄소 농도가 상한 설정값에 도달하면 밸브가 닫히도록 데드밴드(deadband)를 설정하십시오. 솔레노이드 밸브 뒤에 두 개의 가스 탱크 라인 각각에 미터링 밸브를 부착하고, 이를 조심스럽게 조정하여 대기 중의 carbon 13 농축 수준을 원하는 정도로 맞추십시오.여기서는 4.4 atom %의 탄소-13 농축물을 사용합니다. 배출구를 서로 연결하고, 마지막으로 라인을 팬 사이의 챔버 중앙으로 연결하여 표지된 이산화탄소가 챔버 전체에 고르게 분산되도록 함으로써 관수 시스템을 설정합니다. 먼저, 화분당 하나의 점적 관수 링을 만들고 관수 튜브를 챔버 벽면에 만든 작은 구멍을 통해 외부로 연결합니다.그 다음, 챔버 외부에 공기가 새는 것을 방지하기 위해 실리콘 코킹으로 관수 튜브 주변의 구멍을 밀봉합니다. 관수 튜브를 연동 펌프 튜브에 연결하고, 관수 간에 공기가 새지 않도록 작은 호스 클램프를 장착합니다. 생존력을 보장하기 위해 화분에 심기 전 미리 발아시킨 후, 신선한 토양 슬러리로 묘목을 접종합니다. 유익한 미생물을 도입하기 위해, 토양으로부터 표지되지 않은 탄소와 질소가 유입되는 것을 차단할 수 있도록 무토양 상토를 화분에 채웁니다.여기서는 모래, 버미큘라이트와 다공성 세라믹 프로파일의 혼합물을 사용합니다. 종자가 발아하면, 최소량의 배양토가 담긴 화분에 묘목을 조심스럽게 이식합니다. 그런 다음 화분을 챔버로 옮기고, 각 화분에 개별 관수 호스를 연결하여 조립합니다.마지막으로 챔버 도어를 밀폐하고, 이산화탄소 농도가 최소 200에서 250 ppm까지 낮아질 때까지 에어 펌프에 소다라임 스크러버를 연결하여 외부 이산화탄소를 제거합니다. 그 후 13 C 이산화탄소 혼합 탱크를 사용하여 챔버를 다시 400 ppm까지 채웁니다. 천연 존재비 이산화탄소 오염을 최소화하기 위해 재배 기간 내내 챔버를 닫힌 상태로 유지하십시오.먼저 98 atom % $^{15}\text{N}$ 질산칼륨과 천연 존재비 $^{15}\text{N}$ 질산칼륨을 혼합하여 $^{15}\text{N}$ 표지 Hyland형 비료 용액을 만든 다음, 이를 나머지 Hoagland 용액에 첨가합니다. 여기서는 7 atom % $^{15}\text{N}$ 용액을 사용하여 시비합니다. 연동 펌프를 사용하여 $^{15}\text{N}$ 표지 비료 용액을 관수 튜브를 통해 공급합니다.UNC 클램프로 관수 호스를 고정하고, 요구 사항 및 실험 설계에 따라 개별 식물에 다양한 양의 비료를 투여합니다. 그 다음, 호스에 물을 펌핑하여 관수 호스 내의 비료를 씻어냅니다. 비료 낭비를 최소화하기 위해 추가하는 액체의 총량은 화분의 보수력을 초과하지 않아야 합니다.수분 및 관수 후, 챔버의 공기 누출을 방지하기 위해 모든 호스의 클램프를 다시 조입니다. 구조적 성분과 대사 성분을 차별적으로 표지하려면, 수확 1~3주 전에 표지 챔버에서 식물을 꺼냅니다. 균일하게 표지할 식물은 수확 시까지 챔버 내에 유지합니다.노화를 유도하기 위해, 준비가 되었을 때 관수를 중단하십시오. 먼저 지상부 생물량을 절단하여 식물을 수확합니다.지상부 바이오매스를 수확한 후, 상토와 뿌리를 6mm 코어 스크린 위에 부어 상토로부터 뿌리를 분리합니다. 그런 다음 뿌리를 2mm 스크린 위에서 헹구어 남아 있는 상토 잔여물을 제거합니다. 뿌리에 엉겨 붙어 있는 상토가 있을 경우 핀셋을 사용하여 제거하고, 이후의 실험을 위해 뿌리를 공기 중에서 건조시킵니다.3번의 성장 시즌 운영 기간 동안, 챔버는 제어 센터에서 설정한 대로 온도 26~29°C, 습도 36~56%, 그리고 이산화탄소 농도 360~400 ppm 사이를 성공적으로 유지하였습니다. 여기 제시된 것은 2011년 성장 시즌의 *Andra pogon* Girard의 대표적인 결과입니다. 야간 호흡 중의 이산화탄소 축적은 성장 중인 식물에 피해를 주지 않는 것으로 보이며, 일출 후 빠르게 흡수됩니다.목표치인 7 atom % $^{15}\text{N}$ 호글리 용액을 통한 질소 15 표지는 6.7 atom % $^{15}\text{N}$의 고표지 식물 시료를 생성했으며, 목표한 $^{15}\text{N}$ 표지에서 약간의 희석이 발생한 것은 분갈이 흙에 포함된 일부 천연 존재 질소 또는 토양 접종균으로 인한 것일 수 있습니다. 목표치인 4.4 atom % $^{13}\text{C}$ 이산화탄소를 이용한 탄소 13 표지는 4.46 atom % $^{13}\text{C}$의 결과를 나타냈습니다. 균일하게 표지된 식물 시료 전체에 걸쳐, 수확 7일, 14일 또는 22일 전에 챔버에서 제거된 차등 표지 식물들은 $^{13}\text{C}$ 및 $^{15}\text{N}$ 함량에서 유의미한 차이를 보였습니다.온수 추출물로 얻은 대사 성분과 온수 추출 잔류물로 얻은 구조 성분은 식물의 대사 및 구조 재료가 차별적으로 표지되었음을 나타냅니다. 이러한 기술 개발 이후, 지속적인 이중 동위원소 표지는 생지화학 연구자들이 거시 및 나노 규모에서 환경 내 식물 성분의 운명과 변형을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

design-operation-continuous-13c-15n-labeling-chamber-for-uniform-or

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

채용 안정 동위 원소 라벨 작업...

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

식물에서 영양소 및 독성 플럭스의 측정은 식물 영양 및 독성 연구에 필수적입니다. 여기에서는 칼륨(K+) 및 암모니아/암모늄(NH3/NH4+) 플럭스를 예로 사용하여 온전한 식물 뿌리의 유입 및 유출 측정을 위한 방사성 추적자 프로토콜을 다룹니다. 이러한 기술의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

시각화 및 루트 성장에서 제자리에 매우 도전 이다. 우리는 루트 개발 및 영양 농축에 대 한 응답에서 시간이 지남에 확산을 추적 하는 사용자 정의 rhizobox 방법을 제시. 이 메서드는 루트 소성 유기 질소 소스에 대 한 응답에서에 옥수수 genotypic 차이 분석 하는 데 사용 됩니다.

루트 성장 및 지역화 된 양분에 응답을 시각화 하는 최적화 된 Rhizobox 프로토콜

15N 추적기 연구를 위한 마이크로플롯 설계는 여러 계절식물 및 토양 샘플링 이벤트를 수용하기 위해 설명된다. 15N분석을 위해 연삭 및 계량 프로토콜을 포함한 토양 및 식물 샘플 수집 및 처리 절차가 제시됩니다.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.

13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

이 프로토콜은 "루프 방법"[11C]메틸화를 통해 4개의 탄소-11 방사성 추적자를 준비하는 자세한 절차를 제시합니다. [11C]ER-176을 3개의 추가 방사성 추적자([11C]MRB, [11C]mHED 및 [11C]PiB)에 대한 데이터와 함께 합성하는 절차를 설명합니다. 루프 방법은 전통적인 반응 용기 [11C] 메틸화에 대한 증가된 방사성 화학적 수율로 효율적인 합성을 제공합니다.

Enhancing Efficiency and Radiolabeling Yields of Carbon-11 Radioligands for clinical research with the loop method(루프 방법을 사용한 임상 연구를 위한 탄소-11 방사성 리간드의 효율성 및 방사성 표지 수율 향상)

생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다.  상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

학습하세요 식물 조직의 균일 및 차등 동위원소 라벨링을 위한 연속 13C 및 15N 라벨링 챔버 설계 및 운영 방법을. 이 기술은 대사 및 구조 성분의 정량적 분석에 필수적입니다.

연속의 설계 및 운영

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