다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

이 실험 절차의 전반적인 목적은 장기간의 in vivo 라이트 시트 현미경 관찰을 위해 제브라피시 배아를 고정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 불소화 에틸렌 프로필렌 또는 FEP 튜브를 세척하고 메틸셀룰로스(Methylcellulose)로 코팅합니다. 그다음, 분석 대상인 제브라피시 배아를 코팅합니다.

그 후 배아를 먼저 녹인 아가로스에 옮긴 다음, 코팅된 FEP 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 튜브 바닥을 aros 플러그로 밀폐하고, 고정된 배아의 방향을 주의 깊게 확인합니다. 최종적으로, in vivo 라이트 시트 현미경을 통해 높은 공간 및 시간 해상도로 며칠 동안 제브라피쉬 배아의 방해받지 않는 발달 과정을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

기존 기술과 비교하여 가장 큰 장점은 제브라피쉬 배아를 단 몇 시간이 아니라 수일 동안 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 라이트 시트 현미경을 이용해 제브라피쉬의 장기적인 배아 발생 과정에 대한 가치 있는 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 작은 해양 생물과 같은 다른 소형 생물들에게도 적용이 가능합니다.

이 방법은 광학 투영 토모그래피, 와이드필드 현미경 또는 공초점 현미경과 같은 다른 현미경 기술과 함께 사용할 수도 있습니다. 이 방법이 처음인 연구자는 프로토콜에 시간적으로 중요한 단계가 포함되어 있고 배아의 최종 위치를 판단하는 데 어느 정도의 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. FEP 튜브를 준비하려면, 먼저 1 M sodium hydroxide로 반복해서 세척하십시오. 그런 다음 0.5 M sodium hydroxide가 채워진 50 mL 원심분리 튜브에 튜브를 옮기고 10분 동안 초음파 처리하십시오.

폴리머 튜브를 증류 탈이온수가 담긴 작은 수조로 옮겨 세척합니다. 그 다음 70% ethanol로 세척한 후, 새로운 원심 분리 튜브로 옮깁니다. ethanol 상태에서 초음파 처리를 수행합니다.

튜브를 10분 동안 초음파 처리한 후, 증류 탈이온수가 담긴 작은 수조로 옮겨 세척합니다. 이 과정을 반복합니다. 깨끗해진 FEB 튜브를 3 cm 길이의 조각으로 자르고, 필요한 경우 곧게 폅니다. 세척된 튜브 조각들은 증류 탈이온수가 채워진 새로운 50 mL 튜브에 보관합니다.

Trica 표준 용액을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 3% Methylcellulose와 1.5% 및 0.1% Aros를 모두 준비합니다. 1.5% agarro를 녹인 후 페트리 접시에 부어 두께가 약 2mm인 층을 형성합니다.

선택한 형광 유전자가 양성으로 발현된 원하는 단계의 제브라피시 배아를 수집하여 입체 현미경 하에서 신선한 E three 배지가 담긴 디시로 옮깁니다. 두 개의 날카로운 핀셋을 사용하여, 한 쪽 핀셋으로 난막(chorion)을 잡고 다른 쪽 핀셋으로 이를 찢어 제거함으로써 다층 마운팅(multi-layer mounting)을 수행하기 위해 배아의 난막 제거(dechorionation)를 조심스럽게 진행합니다. 장갑을 낀 손으로 둔단 캐뉼라(blunt end cannula)를 시린지에 부착합니다.

세척된 FEP 튜브의 한쪽 끝에 캐뉼라를 약 3mm 정도 조심스럽게 삽입합니다. 다음으로, FEP 튜브의 반대쪽 끝을 3% Methylcellulose에 담가 튜브 내부를 용액으로 채웁니다. 그런 다음 시린지를 천천히 밀어 E three medium을 사용하여 메틸셀룰로오스를 배출하며, 담그기와 배출 단계를 반복합니다.

그동안 히트 블록에서 0.1% aros의 분주액 하나를 70 °C까지 가열합니다. 반응 튜브를 짧게 볼텍싱한 후 38 °C로 설정된 히트 블록으로 옮깁니다. 가열 후 튜브를 잠시 식히고, 최종 농도가 133 ~ 200 mg/L가 되도록 trica를 첨가한 후 볼텍싱합니다.

다시 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅된 배아를 예열된 aros가 들어 있는 반응 튜브로 옮기되 E3 배지는 가능한 한 적게 옮깁니다. FEP 튜브와 연결된 주사기로 배아를 흡입하기 전에 소량의 aros를 조심스럽게 빨아들인 후, 튜브를 aros로 완전히 채웁니다.

배아는 머리가 개구부를 향하도록 튜브의 양끝 중 하나에 위치시켜야 합니다. 내용물이 새는 것을 방지하려면 튜브를 수평으로 유지하여 막아주십시오. 면도날을 사용하여 캐뉼라에서 배아를 잘라냅니다.

그 다음 튜브를 수직으로 잡고 1.5% agarose 층 전체에 끝부분을 천천히 밀어 넣은 뒤 약간 회전시킵니다. 건조를 방지하기 위해, 이미징 전까지 고정된 표본을 E3 배지가 채워진 1.5 milliliter 반응 튜브에 보관하십시오. FEP 튜브 내부의 물고기가 일직선으로 위치해 있는지 확인하고, 이미징을 위해 머리 부분이 플러그 바로 위에 놓이도록 합니다.

이미징 챔버 내의 배지에 trica를 추가합니다. 여기에는 혈관 발달을 관찰하기 위해 이틀 동안 이미징한 수정 후 1일 된 K-G-R-L-G-F-P 형질전환 제브라피쉬 배아가 나와 있습니다.

제브라피시는 마운팅 매질의 제약을 받지 않으며 정상적으로 성장할 수 있습니다. 예를 들어, 머리가 위로 들리며 꼬리가 확장되고 혈관 발아(vascular sprouting)가 방해 없이 나타납니다.

이 기술은 적절하게 수행되고 모든 재료가 즉시 준비되어 있다면 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 모든 주요 단계를 지체 없이 수행하십시오. 오염물질은 최종 이미지 품질을 저하시킬 수 있으므로 모든 용액을 깨끗하게 유지하십시오.