다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

이 절차의 전반적인 목표는 장기간의 in vivo 광시트 현미경 검사를 위해 제브라 피쉬 배아를 장착하는 것입니다. 이는 먼저 불소화 에틸렌 프로필렌 또는 FEP 튜브를 세척하고 메틸셀룰로오스로 코팅함으로써 이루어집니다. 다음으로, 관심 있는 제브라 피쉬 배아가 코팅됩니다.

그런 다음 배아는 먼저 용융된 아가로스로 이식된 다음 코팅된 FEP 튜브로 이식됩니다. 마지막으로, 튜브의 바닥을 aros 플러그로 닫고 장착된 배아의 방향을 주의 깊게 확인합니다. 궁극적으로, in vivo light sheet 현미경을 통해 높은 공간 및 시간 해상도로 며칠에 걸쳐 얼룩말 물고기 배아의 교란되지 않은 발달을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

글쎄요, 기존 기술에 비해 가장 큰 장점은 이제 몇 시간이 아닌 며칠에 걸쳐 슈퍼 물고기 배아를 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 광시트 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 장기적인 배발생에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 작은 해양 생물과 같은 다른 작은 생물에도 적용할 수 있습니다.

또한 광학 프로젝션 단층 촬영, 광시야 현미경 또는 컨포칼 현미경과 같은 다른 현미경 기술과 함께 사용할 수도 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로토콜에 시간이 중요한 단계가 포함되고 배아의 최종 위치를 판단하는 데 약간의 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. FEP 튜브를 준비하려면 먼저 1몰 수산화나트륨으로 반복적으로 세척하여 세척합니다. 그런 다음 튜브를 0.5몰 수산화나트륨과 초음파 8로 채워진 50ml 원심분리기 튜브에 10분 동안 옮깁니다.

폴리머 튜브를 증류수 탈이온수가 담긴 작은 대야에 옮기고 세척합니다. 그런 다음 새 원심분리기 튜브로 옮기기 전에 70% 에탄올 플러시를 합니다. 에탄올 울트라 포함.

튜브를 10분 동안 초음파 처리한 후 증류된 이온수가 담긴 작은 대야에 옮기고 세척합니다. 다시. 깨끗한 FEB 튜브를 3cm 길이로 자르고 필요한 경우 곧게 펴십시오. 세척된 튜브를 증류수 탈이온수로 채워진 새 50ml 튜브에 보관하십시오.

Trica 스톡 용액을 준비합니다.텍스트 프로토콜에 따라 3%메틸셀룰로오스 및 1.5% 및 0.1%Aros. 1.5%아가로를 녹여 페트리 접시에 붓고 약 2mm 두께의 층을 형성합니다.

원하는 단계에서 선택한 형광 유전자를 긍정적으로 발현한 제브라피시 배아를 수집하여 입체경으로 E 3의 신선한 접시에 이식합니다. 두 개의 날카로운 집게를 사용하여 한 집게를 사용하여 코리온을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 코리온을 찢고 당겨 다층 장착을 수행하여 배아를 조심스럽게 코팅합니다. 장갑을 낀 손으로 뭉툭한 끝 캐뉼라를 주사기에 부착합니다.

청소된 FEP 튜브 조각의 한쪽 끝에 캐뉼라를 약 3mm 정도 조심스럽게 삽입합니다. 그런 다음 FEP 튜브의 자유 끝을 3% 메틸셀룰로오스에 담그고 튜브에 용액을 채웁니다. 그런 다음 주사기를 천천히 밀어 E 3 매체를 사용하여 메틸 셀룰로오스를 방출하고 침지 및 배출 단계를 반복합니다.

한편, 열 블록에서 0.1%aros의 분취액 하나를 섭씨 70도까지 가열합니다. 반응관을 섭씨 38도로 설정된 열 블록으로 옮기기 전에 잠시 소용돌이칩니다. 가열 후 튜브를 잠시 식히고 트리카를 리터당 133-200밀리그램의 최종 농도와 와류에 첨가합니다.

다시, 유리 파스테르 피펫을 사용합니다. 예열된 aros가 가능한 한 적은 E 3을 전달한 상태에서 코팅된 배아를 반응 튜브로 옮깁니다. FEP 튜브와 부착된 주사기를 사용하여 배아를 흡수하기 전에 소량의 아로스를 부드럽게 흡수하고 튜브를 아로스로 완전히 채웁니다.

배아는 머리가 개구부를 향하도록 튜브의 양쪽 끝에 위치해야 합니다. 내용물이 누출되지 않도록 튜브를 수평 위치에 유지하여 튜브를 연결하십시오. 면도날을 사용하여 캐뉼라를 잘라냅니다.

그런 다음 튜브를 수직으로 잡고 1.5 % aros의 전체 층에 끝을 천천히 붙이고 약간 회전시킵니다. 건조를 방지하려면 이미징하기 전에 E 3 매체로 채워진 1.5ml 반응 튜브에 장착된 표본을 보관하십시오. FEP 튜브 내부의 물고기가 똑바로 배치되어 있고 이미징을 위해 머리가 플러그 바로 위에 있는지 확인합니다.

이미징 챔버 내부의 매체에 trica를 추가합니다. 여기에 표시된 것은 수정 후 1일 형질전환입니다. K-G-R-L-G-F-P 제브라피시 배아를 이틀에 걸쳐 이미지화하여 혈관 구조의 발달을 관찰했습니다.

제브라피쉬는 장착 매체에 의해 제한되지 않으며 정상적으로 발달할 수 있습니다. 예를 들어, 머리를 들어 올립니다. 꼬리가 뻗어 있고 혈관 싹이 트는 것처럼 보입니다.

이 기술은 적절하게 수행하고 모든 재료를 쉽게 구할 수 있다면 10분 안에 완료할 수 있습니다. 지체 없이 모든 주요 단계를 수행하는 것을 잊지 마십시오. 먼지는 최종 이미지 품질을 손상시킬 수 있으므로 모든 솔루션을 깨끗하게 유지하십시오.