Name: 다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 배아를 장기 라이트 시트 현미경 관찰을 위해 FEP 튜브에 장착하는 방법을. 메틸셀룰로스 코팅과 아가로스 고정을 통해 수일간의 생체 발달 과정을 고해상도로 관찰할 수 있습니다.

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우리는 자금 지원을 위해 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP)과 베링거 인 겔 하임 드퐁 감사합니다.

1. 재료 준비 <ol><li> FEP 튜브의 제조 <ol><li> 튜브를 통해 (아래에 언급 된 단계에서) 액체를 세척하고 뭉툭한 끝 정맥 (그림 2B)에 부착 된 주사기를 사용하여 FEP 튜브 (그림 2A)를 청소 주 1 :.. 절차 전반에 걸쳐 사용 장갑을 주 2 : 우리는 추천 캘리포니아의 조각에 튜브를 절단. 1 m 세로 병렬 사람들을 청소. <ol><li> 첫 번째 반복 1 M NaOH로 튜브를 세척하십시오. 그런 다음 0.5 M NaOH로 가득 50 ML의 원심 분리기 튜브에 튜브를 전송하고 10 분 정도를 초음파 처리. </li><li> DDH 2 O와 작은 분지에 폴리머 튜브를 이동 첫 번째 DDH 2 O로하고 70 % EtOH로 튜브를 세척합니다. </li><li> 그 후 70 % EtOH로 신선한 원심 분리 관에 FEP 튜브를 전송합니다. 다시 10 분 동안 원심 분리기 튜브를 초음파 처리. </li></ol></li><li> 조각으로 청소 FEP 튜브를 절단필요한 경우의 약 3 센티미터 (제브라 피쉬의 설치 및 이미징에 사용되는 일반적인 길이)와 똑 바르게. DDH 2 O (그림 2C)로 가득 찬 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브의 청소 FEP 튜브를 저장합니다. </li></ol></li><li> Tricaine 원액의 제조 <ol><li> 97.9 밀리리터 DDH 2 O.에서 400 밀리그램의 Tricaine (MS-222)을 용해하여 0.4 % Tricaine 주식 솔루션을 준비합니다 분말이 완전히 용해 후, 2.1 ㎖의 1M 트리스 (pH를 9.0)을 사용하여 7.0의 pH를 조정한다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. -20 ° C에서 저장 분주 </li></ol></li><li> 3 % 메틸 셀룰로오스의 제조 <ol><li> 후술하는 바와 같이 FEP 튜브의 내측 코팅에 대한 3 % 메틸 셀룰로오스 용액을 준비한다. 약 60 ~ 70 ° C의 유리 병에 E3 (11)를 가열하고 메틸 셀룰로오스 분말의 적절한 금액을 추가합니다. 교반 막대를 추가하고 4 ℃에서 교반 즉시 솔루션이 30 ° C 이하로 냉각 될 때, 마지막 C에 Tricaine의 솔루션을 추가oncentration 100 ㎎ / L. 4 ° C에서 밤새 교반하십시오. </li></ol></li><li> 1.5 %의 제조 및 E3에서 0.1 % 아가 <ol><li> 유리 플라스크에서 E3의 정의 된 부피에서 저 융점 아가로 오스 분말의 적당량을 녹인다. 전자 레인지에서 혼합물을 가열하고 아가로 오스 솔루션은 동종 나타날 때까지 남아있는 결정하지 않고, 가끔 흔들어. </li><li> 1.5 ml의 반응 튜브에 0.1 % 아가 용액 1 ㎖ 분취 량을 준비한다. 분주 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 코트 플라스틱 배양 접시에 1.5 % 용액을 사용합니다. 아가 로스 층의 두께는 CA이어야한다. 2mm. 아가로 오스가 고형화 된 후 건조를 방지하는 층의 상부에 E3 매체를 추가한다. 코팅 접시는 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 제브라 피쉬의 제조 <ol><li> 기존 프로토콜에 따라 11, 12, 28.5 ° C에서 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 성인과 배아를 유지하고이를 처리 할 수 있습니다. </li><li> 오후에 남성과 여성의 물고기를 설정하고 분배기를 사용하여 구분합니다. 물고기의 짝짓기 시간 다음 아침에 디바이더를 제거합니다. </li><li> E3 가득 접시에 배아를 수집하고 실체 현미경을 사용하여 검사합니다. </li><li> 24 HPF (또는 관심의 발달 단계)에서, 형광 식에 대한 제브라 피쉬 배아를 선택하고 신선한 E3와 함께 새로운 요리에 긍정적 인 사람을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 두 개의 날카로운 집게 (그림 2D 및 2E)를 사용하여 배아를 dechorionate. 열린 찢어 그것을 해내 융모막 두 번째 집게를 잡고 개최하는 최초의 집게를 사용하여 주 1 :. 실체 현미경의 도움으로이 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 다층 실장 <ol><li> FEP 튜브 코팅 <ol><li> 주사기에 뭉툭한 끝 정맥을 연결합니다. 청소의 한쪽 끝으로 약 3 mm를 위해 조심스럽게 캐 뉼러를 삽입 한 조각을 잘라. 장갑을 사용하고 관의 굽힘 또는 압착을 방지 : FEP 튜브 (그림 2 층과 2G) 참고 1. </li><li> 3 % 메틸 셀룰로오스에 FEP 튜브의 자유 단부 담그고 용액으로 충진 튜브. </li><li> 천천히 주사기에 밀어 메틸 셀룰로오스를 놓습니다. 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> . 반복 E3 주 1을 사용하여 2.1.2와 2.1.3 단계 : 코팅 튜브는 즉시 설치에 사용되어야합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스에 제브라 피쉬 전송 <ol><li> 열 블록에 70 ° C에 0.1 % 아가로 오스의 한 나누어지는을 가열한다. 소용돌이 반응 관 짧게와 38 ° C (그림 2H)으로 설정 열 블록에 전송합니다. </li><li> 열 블록으로부터 반응 관을 가지고이 잠시 진정하자. 다시 133-200 ㎎ / L와 소용돌이의 최종 농도 (그림 2I)에 Tricaine을 추가합니다. </li><li> dechorionated zebrafish의 배아 중 하나 transfe를 선택. R이 유리 파스퇴르 피펫 (그림 2J 및 2K)를 사용하여 예열 된 0.1 % 아가로 오스와 반응 관에 1 주 : 가능한 한 적은 추가 E3를 전송 해보십시오. </li></ol></li><li> 제브라 피쉬를 장착 <ol><li> 주사기에 연결된 FEP 튜브 (그림 2 L)와 배아를 차지합니다. . 튜브는 튜브의 한쪽 끝 부근에 위치 배아와 헤드가 튜브의 개방를 가리키는, 0.1 % 아가로 오스 완전히 채워 져야 주 1 : 물고기를 복용하기 전에 약간의 아가로 오스를 차지해야합니다. 주 2 : 거품을 방지하기 위해 주사기에 매우 부드럽게 당겨 주 3 :. 콘텐츠 (그림 2M 및 2N)의 누출을 방지하기 위해 수평 방향으로 튜브를 유지. </li></ol></li><li> 튜브를 연결 <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 다층 제브라 피쉬 배아에 장착.) 플루오르 에틸렌 프로필렌 준비. B 전에 케이블 드럼 (FEP) 튜브) 부착 무딘 끝 정맥 주사기. C) 청소 및 FEP 관. D, 24 HPF의 E) Dechorionation 컷 용융의 반응 관 내부의 아가로 오스 0.1 % 열 블록에 전송하는 동안의 제브라 피쉬 배아. F) 뭉툭한 끝 정맥에 관을 부착. G) 정맥 튜브 부착과 주사기. H) 나누어지는. I) 소용돌이로 FEP 튜브. M, N)에 아가로 오스 주변 용융 아가로 오스의 배아. L) 섭취로 태아의 유리 피펫을 사용하여 dechorionated 배아의 아가로 오스. J) 통풍. K) 전송 FEP 튜브 내부의 제브라 피쉬 배아 . <stroNG&gt; O) 아가로 오스 - 코팅 접시를 사용하여 튜브를 연결해) 표본과 정맥. P 사이의 튜브를 절단. Q)는 배아 연결 관. R) 금속 홀더의 최종 샘플 준비 내부. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">을하려면 여기를 클릭하십시오 큰 이미지를 볼 수 있습니다.</a> <ol><li> 정맥 (그림 -20) 오프 튜브를 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 천천히 튜브 (그림 2 P)을 연결하는 플라스틱 접시에 1.5 % 아가로 오스의 전체 층을 통해 물고기가 들어있는 튜브의 끝을 붙여 주 1 :. 거품의 형성을 피하고 잡고 똑 바른 마개 표면을 얻으려고 . 관 정확히 수직 아가로 오스 표면에 주 2 : 약간 좋은 플러그를 얻기 위해 튜브를 돌립니다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 E3와 1.5 ㎖의 반응 튜브에 장착 된 표본을 보관하십시오. 이 샘플은 N입니다이미지가 준비 아야. 이미징 전에 물고기가 플러그 (그림 2 분기 및 2R)의 상단에 바로 앉아 있는지 확인합니다. 또한 설치 매체에서와 같은 농도에서 이미징 챔버 내부의 매체에 Tricaine를 추가해야합니다. </li></ol></li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이러한 빛 시트 현미경 같은 고급 현미경 기술은 몇 일의 과정을 통해 높은 공간적 해상도로 이미지 데이터를 기록 할 수있게뿐만 아니라 개선하기 위해 샘플 장착 기술이 필요합니다. 우리는 지브라​​ 피쉬 개발의 빛 시트 현미경에 장착 다층의 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 구현이 간단하고 우리는 매일 우리의 실험실에서 사용합니다. FEP 튜브 우리 실장 전략의 주요 구성 요소는 플루오르 중합체 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브이다. 우리는 주로하기 때문에 물과 비슷하기 때문에 이상적으로 물 침지 목표와 수성 매체를 필요로하는 표본 빛 시트 현미경 적합 1.338의 굴절률,의 FEP를 사용하기로 결정했다. 0.8 mm, 내경 0.4 mm의 벽 두께를 매우 잘 개발 제브라 피트와 튜브는, 1.6 mm에 적합한 전형적인 샘플 홀더로 사용될 수있다모세 혈관 제시 설치 방법을위한 우리의 첫번째 선택이다. 우리는 우리의 가정 기본 설정뿐만 아니라 상용 시스템 칼 자이스 현미경으로 &quot;Lightsheet Z.1&quot;에서 철저히 테스트 및 FEP 튜브, 장기적인 안정성을 제공하는 광학 성능에 최소한의 영향을 미칠 및 비 형광 10 것으로 나타났습니다. 그러나, 이들은 예를 들어,이 시험편을 맑게 다른 굴절률을 필요 샘플 애플리케이션에 적합하지 않다. 튜브뿐만 아니라 FEP 만들어진 포일은 직경과 두께의 다양한 사용할 수 있습니다. 또한, FEP는 260 ° C에서 용융하여 맞춤 샘플 설치 지원을위한 거의 무한한 가능성을 제공 할 수 있습니다. 중합체 튜브 클리닝 프로토콜 유용한 광학 품질을 보장​​하기 위해 몇 가지 단계를 포함 이유있는, 비 멸균 공급되는 경향이있다. 메틸 셀룰로오스와 코팅은 성장하는 제브라 피쉬 배아의 어떠한 부분이 폴리머 붙어 있는지 확인합니다. 0.1 % 아가로 오스에 대한 결정은, 아가 로스 및 메틸 셀룰로오스 (10)의 다른 농도의 증가율 및 부동성의 광범위한 검사에 기초한다. 0.1 % 이상의 아가 로스 농도는 이미 24 HPF의 지브라 피쉬의 성장 속도에 심각한 영향을 보였다. 또한 우리는 마취 약물 Tricaine의 낮은 복용량을 사용합니다. Tricaine 블록의 활동 전위, 따라서 뇌와 근육 사이의 신호 전달을 억제하고 근육의 수축 16를 표시하지 않습니다. 133-200 ㎎ / L의 농도는 24 ~ 72 HPF 사이에 제브라 피쉬의 충분한 고정을 보장합니다. 그러나 Tricaine 및 기타 마취 약물 우리는 심장 부종 등의 표시 농도 의존적​​ 부작용을 테스트했다. 또한 Tricaine 필요한 용량은 배아의 발달 단계에 따라 달라집니다. 따라서 우리는 이미지를 만들 발달 단계에 필요한 금액에 Tricaine 농도를 줄이는 것이 좋습니다. 최고의 performan을 보장하기 위해CE 및 부산물 독성의 형성을 방지, 새로 제조 또는 해동 Tricaine 원액이 사용하는 빛으로부터 보호하고 30 ℃ 이상으로 가열해야하는지 FEP 튜브에 임베딩은 특정 요구를 고려하여 설치 매체의 쉽게 수정 할 수 있습니다. 마음의 시간 경과 영상을 위해, 우리는 3 % 메틸 셀룰로오스 100 ㎎ / L Tricaine 대신 0.1 % 아가로 오스 및 설치 200 ㎎ / L를 사용하는 것이 좋습니다. 메틸 셀룰로오스 0.1 % 아가로 오스 따라서 자체적 높은 부동성을 제공하고 더 적은 Tricaine는 배아의 협착을 보장하기 위해 사용될 필요가보다 점성이다. Tricaine는 30 ° C 이상의 온도에 민감하고 또한 성능과 배아의 수의 경련 감소로 이어지는, 영상 실에서 매체에 의해 희석 될 수있다. 따라서, 장착 표본이 잠겨있는 영상 매체도 Tricaine을 사용해야합니다. 당신의 실험은 높은의 사용을 필요로하는 경우온도는, 우리는 관류 시스템을 사용하여 수동으로 또는 두 시간 점 사이 관과 주사기 하나 촬상 챔버에서 매체를 교환 권장합니다. 중요한 단계 샘플의 실장 공정 중에 중요한 단계는 튜브에 시료의 흡기 및 아가 플러그의 삽입이다. 섭취 후 변경 성가신 배아의 초기 위치를 정의한다. 다수의 시료를 탑재 할 수 있어야하고 설치 품질은 실체 현미경으로 관찰해야한다. 샘플 방향이 만족스럽지 않은 경우이 종종 배아를 왜곡으로, 시료를 그림과 플런저의 후속 움직임을 피할 수있는 속도를 변경하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1.5 % 아가 플러그는 0.1 % 아가로의 누설을 방지 할 필요가있다. 튜브 내부의 플러그의 표면은 개발 중에 샘플 방향에 영향을주지 할 평평해야합니다. 좋은 서핑을 달성하기 위해ACE, 아가 로스 층의 상이한 두께를 테스트해야하고 튜브의 표면에 수직 인 아가로 끼워 넣을 필요가있다. 관을 조금 회전 튜브를 당기는 조심스럽게 접시에서 플러그를 해제합니다. 장착의 품질은 영상 전에 실체 현미경으로 확인해야합니다. 멀티 뷰 영상 빛 시트 현미경의 하나의 주요 장점은 멀티 뷰 영상, 시편을 회전 여러 각도에서 Z-스택을 획득하고 이후에 등록을 융합 할 수있는 기능입니다. 3D 공간에서 Z-스택을 등록하는 방법은 확립 신탁 마커 (17)로 샘플을 둘러싼 형광 비드를 사용하여 비드 기반 등록이다. 그러나이 방법은 같은 1.5 % 아가로 오스 등의 고체 설치 매체에 의존하기 때문에 다층가 여기에 제시된 실장 호환되지 않는 것 같습니다. 그러나 여러 다른 솔루션은 애플리케이션에 따라 작동한다. 첫째, 형광 구슬은 수획득 동안 시야에 있 아가 플러그에 통합 될 수있다. 둘째, 스테이지 위치는 형광 비드와 함께 1.5 % 아가로 오스 컬럼을 사용하여 실제 실험 이전에 보정 될 수있다. 셋째, 이러한 형광 핵으로서 대체 마커는 서로에 대해 Z-스택의 위치를​​ 식별하기 위해 사용될 수있다. 증발 일반적인 광 시트 현미경 설정은 매체의 증발에 오픈 샘플 챔버, 피할 수없는 리드를 사용합니다. 매체가 설치 매체의 증발을 제한하는 표본의 생존과 광학 및 샘플 사이의 올바른 굴절률을 위해 필수적이기 때문에, 우리는 증발을 방지하기 위해 다음 방법 중 한 가지 이상을 복용하는 것이 좋습니다. 우선, 챔버 내의 매체는 끊임없이 관류 시스템에 의해 교환 될 수있다. 둘째, 매체 수동 리필 할 수있다. 셋째, 챔버 덮개 또는가요 성 호일로 커버 될 수있다. <p클래스 = &quot;jove_step&quot;&gt; 산소 공급 중합체는 FEP 화학 큰 다양성을 견딜 수 있도록 개발하고, 따라서 강력한 화학적으로 불활성 가스에 nonpermeable이다 하였다. 다층 실장 산소의 경우에만 아가 플러그 및 아가 - 공기 계면을 관통하지만, 중합체 튜브를지지 않고 아가 1.5 % 마운팅에 비해 다층 실장에 산소 공급이 심각하게 낮은 경우에는 표시 될 남아있다. 제브라 피쉬 모폴로지가 다층 실장 영향 전에 그러나, 1.5 % 아가로 장착으로 약 두 시간 동안 사용될 수있다 장기 이미징 뛰어난 전체적인 솔루션이 될 것으로 보인다. 개발의 초기 단계 이미징 설치 다층 지금 제브라 피쉬 세 이상 24 HPF의 시간 경과 빛 시트 현미경에 대한 우리의 표준 임베딩 기술이되고있다. 그 외에, 우리는 또한 초기 단계의 배아의 이미징 폴리머 튜브를 사용합니다. 전자mbryos 그들의 chorions에 남아 1mm의 내경 FEP 관에 장착 및 E3로 채워진다. 제브라 피쉬는 자유롭게 융모막 안에 개발할 수 있습니다 여전히 잘 빛 시트 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 시야 제시 다층 샘플 설치는 제브라 피쉬의 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다. 그것은 쉽게 광 투영 단층 촬영 (OPT) 및 다른 생물과 같은 다른 현미경 기술에 채용 될 수있다. 우리는 표준 크기 FEP 튜브가 특정 요구에 맞게 샘플 장착 기법으로 단지 첫 번째 단계입니다 있다고 생각합니다.

배아 동안 복잡한 이벤트와 상호 작용을 이해하기 위해, 발달 생물학의 연구는 점점 더 전체 생물의 생체 내 이미징에 하나의 세포와 장기의 현미경에서 움직이고있다. 전통적인 현미경 기술은 일반적으로 장기간에 걸쳐 급속 이벤트를 수행하기 위해 공간 및 시간 해상도를 제공하지 종종 표백 또는 샘플 1에서 광독성 효과를 일으킨다. 우리와 다른 빛 시트 현미경 (그림 1) 제브라 피쉬 2-4의 생체 내 이미징을위한 이상적인 기술로 발견했다. 검출 축에 직교하는 레이저 광의 얇은 시트와 샘플의 조명은 높은 공간 해상도뿐만 아니라 최소화 광 독성 5 빠른 광학 절편을 제공한다. 동시에, 이로 인해 독특한 광학적 배치에, 페트리 접시 나 배양 챔버를 사용하여 기존의 시료 실장 기술은 적합하지 않다. 일반적인 빛시트 현미경 세 번역 모터 및 회전 모터가 정확하게 위치 할 수 있도록 샘플을, 보류, 설정 및 모든 방향에서 볼. 과거 표본 빛 시트 현미경 종종 유리 모세관 6,7 내부 아가로 오스 1 ~ 2 %에 포함되었다. 이 경우 임베디드 시편 고화 아가 실린더는 촬상 물 같은 매체로 채워진 샘플 챔버 내로 유리 모세관 밖으로 압출된다. 아가로 오스는 물에 가까운 굴절률을 가지므로 물 보정 조명 및 광학 검출을 용이하게 생체 빛 시트 현미경 완벽하게 적합합니다. 샘플 경질 아가 로스에 국한되어 짧은 시간 동안 잘 묘화 될 수 있지만, 몇 시간 7,8위한 묘화 형태 발생 때 변경 및 배아의 성장을 강력하게 손상된다. 다른 응용 프로그램에 대한 솔루션은 비 침습적 장기 시간 경과 제브라 피쉬에게 9을 개발되었지만<html> 광 시트 현미경 촬상 전위는 종래의 1.5 % 아가로 오스를 매립하여 악용 할 수 없습니다. 따라서 우리는 zebrafish의 배아 (10)의 생체 빛 시트 현미경을위한 새로운 설치 전략을 개발했다. 샘플을 광학적으로 맑은 중합체 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 관 안쪽 200 ㎎ / L의 Tricaine으로 0.1 % 아가로 오스에 장착된다. 내장 된 배아 인해 매체의 저점에 일반적으로 개발하고 있습니다. 동시에, FEP 튜브는 실험 기간에 대한 중간 샘플을 한정한다. 여기에서 우리는 기존의 프로토콜을 통해 장점을 반영하는 새로운 설치 기술 및 현재 데이터의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 우리의 방법 지브라 피쉬 개발하여 연속 이틀 이상에 걸쳐 높은 공간 및 시간 해상도로 묘화 될 수 있음을 보여준다. 5 인치 &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; 도 1. 광 시트 현미경의 원리. 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브 내에 장착 지브라 피쉬는 번역 및 검출 목적의 초점 평면을 통해 회전 될 수있다. 레이저 광 (빛 시트)의 얇은 시트를 검출 목적의 초점면에 조명 목적에 의해 계획 및 시편의 두께가 얇은 광학 부분을 조명한다. 방출 된 형광 신호를 검출 대물 의해 수집하고 카메라 칩에 기록된다.

<table><tbody><tr><td>플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜브</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0.8/1.6mm 내경/외경, 기타 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1ml 주사기</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican 일회용 캐뉼라, 무뭉툭한</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0.8mm x 22mm, 기타 크기 사용 가능, 캐뉼라의 외경은 FEP 튜브</td></tr><tr><td>의 내경에 맞아야 합니다.50 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>분말 E3</td></tr> 배지로 공급<tr><td>(제브라피시 배아용)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 ml 반응</td>관 <td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, 저겔화 온도</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>분말</td></tr><tr><td>페트리 접시</td> <td>공급Greiner</td><td>633180</td><td>플라스틱, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>동의어:&nbsp; 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트, MS-222, TS 222, 트리카인 메탄설포네이트&nbsp;</td></tr><tr><td>10X/0.3 W 현미경 대물 렌즈</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor 기술</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

빛 장 현미경은 제브라 피쉬 배아 발달을 연구하는 이상적인 이미징 기술입니다. 때문에 최소한의 사진 독성 및 표백에, 그것은 특히 몇 일까지 많은 시간에 걸쳐 장기적으로 시간 경과 영상에 적합합니다. 그러나, 적절한 샘플 설치 전략은 감금 및 샘플의 정상적인 발달을 모두 제공이 필요합니다. 다층 설치, 광학적으로 명확한 관에서 낮은 농도의 아가로 오스를 사용하여 새 임베딩 기술은 지금이 한계를 극복하고 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다.

Zebrafish의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상 장기 빛 시트 현미경 다층 설치 전략의 장점을 설명하기 위해 13 제브라 피쉬 : 우리는 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 사용합니다. 목표는 이미지는 2 일간의 과정을 통해 전체 제브라 피쉬의 혈관의 개발이다. 제브라 피쉬 배아는 메틸 코팅 폴리머 튜브 내부의 아가로 오스 0.1 %에 장착되었다. 여기에, 제브라 피쉬는 설치 매체에 의해 제한되지 않고, 일반적으로 개발할 수 있습니다. 머리 꼬리 (그림 3)을 확장하고 혈관 싹이 방해받지 나타납니다 발생합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> 그림 3. 제브라 피쉬의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상. multila의 혈관13 제브라 피쉬 이틀에 걸쳐 빛 시트 현미경에 방해받지 않고 개발 : YER은 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 장착. 488 nm의 레이저 광 시트는 여기되어 형광 신호가 10X/0.3 W 및 대물 EMCCD의 카메라를 이용하여 검출 하였다. Z-스택은 인접한 4 개의 위치마다 10 분에 취득 이후 피지 15 스티치되었다. 시간 점의 부분 집합의 최대 강도 예측이 표시됩니다. 스케일 바 :. 500 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 초기 제브라 피쉬 배아의 영상 여기, 우리는 수정 후 첫날 이른 제브라 피쉬 배아의 빛 시트 현미경 장착 지원으로 FEP 튜브의 기능을 보여줍니다. 8 HPF의 Tg (H2A : GFP)은 14 제브라 피쉬 배아는 I와 E3 채워진 튜브 내부의 손상 융모막 장착 된1mm의 nner 직경. 즉, 융모막의 약간의 체결 결과. 배아 동안 모든 발달 과정은 설치에 영향을받지 최적으로 빛 시트 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 이 예제에서, 우리는 12 시간의 과정 (그림 4)을 통해 표본을 이미지. 1.5 % 아가로 오스의 융모막하지 않고 기존의 설치를 사용하는 경우 등의 노른자와 중간 선을 따라 조직의 비후의 증가 신장 등의 초기 배 발생시 일반적인 형태의 변화는 억압 될 것이다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . 초기 제브라 피쉬 배아의 그림 4 이미징의 Tg (H2A : GFP). 14 제브라 피쉬의 초기 배 발생을 통과한다. 488 nm의 레이저 광 시트 흥분 및 GFP 형광 신호가 검출되었다10X/0.3의 W 목표와 EMCCD 카메라와 함께. 두 개의 각도에서 Z-스택은 12 시간의 과정을 통해 매 3 분을 인수했다. 시간 경과의 부분 집합의 정규화 된 최대 강도 예측이 표시됩니다. 아직 마취가 사용되지 않았다으로 취득하는 동안 배아 꿈틀 19 HPF 결과에서 눈에 보이는 모션 블러,. 스케일 바 :. 150 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 장기간의 in vivo 라이트 시트 현미경 관찰을 위해 제브라피시 배아를 고정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 불소화 에틸렌 프로필렌 또는 FEP 튜브를 세척하고 메틸셀룰로스(Methylcellulose)로 코팅합니다. 그다음, 분석 대상인 제브라피시 배아를 코팅합니다.그 후 배아를 먼저 녹인 아가로스에 옮긴 다음, 코팅된 FEP 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 튜브 바닥을 aros 플러그로 밀폐하고, 고정된 배아의 방향을 주의 깊게 확인합니다. 최종적으로, in vivo 라이트 시트 현미경을 통해 높은 공간 및 시간 해상도로 며칠 동안 제브라피쉬 배아의 방해받지 않는 발달 과정을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.기존 기술과 비교하여 가장 큰 장점은 제브라피쉬 배아를 단 몇 시간이 아니라 수일 동안 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 라이트 시트 현미경을 이용해 제브라피쉬의 장기적인 배아 발생 과정에 대한 가치 있는 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 작은 해양 생물과 같은 다른 소형 생물들에게도 적용이 가능합니다.이 방법은 광학 투영 토모그래피, 와이드필드 현미경 또는 공초점 현미경과 같은 다른 현미경 기술과 함께 사용할 수도 있습니다. 이 방법이 처음인 연구자는 프로토콜에 시간적으로 중요한 단계가 포함되어 있고 배아의 최종 위치를 판단하는 데 어느 정도의 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. FEP 튜브를 준비하려면, 먼저 1 M sodium hydroxide로 반복해서 세척하십시오. 그런 다음 0.5 M sodium hydroxide가 채워진 50 mL 원심분리 튜브에 튜브를 옮기고 10분 동안 초음파 처리하십시오.폴리머 튜브를 증류 탈이온수가 담긴 작은 수조로 옮겨 세척합니다. 그 다음 70% ethanol로 세척한 후, 새로운 원심 분리 튜브로 옮깁니다. ethanol 상태에서 초음파 처리를 수행합니다.튜브를 10분 동안 초음파 처리한 후, 증류 탈이온수가 담긴 작은 수조로 옮겨 세척합니다. 이 과정을 반복합니다. 깨끗해진 FEB 튜브를 3 cm 길이의 조각으로 자르고, 필요한 경우 곧게 폅니다. 세척된 튜브 조각들은 증류 탈이온수가 채워진 새로운 50 mL 튜브에 보관합니다.Trica 표준 용액을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 3% Methylcellulose와 1.5% 및 0.1% Aros를 모두 준비합니다. 1.5% agarro를 녹인 후 페트리 접시에 부어 두께가 약 2mm인 층을 형성합니다.선택한 형광 유전자가 양성으로 발현된 원하는 단계의 제브라피시 배아를 수집하여 입체 현미경 하에서 신선한 E three 배지가 담긴 디시로 옮깁니다. 두 개의 날카로운 핀셋을 사용하여, 한 쪽 핀셋으로 난막(chorion)을 잡고 다른 쪽 핀셋으로 이를 찢어 제거함으로써 다층 마운팅(multi-layer mounting)을 수행하기 위해 배아의 난막 제거(dechorionation)를 조심스럽게 진행합니다. 장갑을 낀 손으로 둔단 캐뉼라(blunt end cannula)를 시린지에 부착합니다.세척된 FEP 튜브의 한쪽 끝에 캐뉼라를 약 3mm 정도 조심스럽게 삽입합니다. 다음으로, FEP 튜브의 반대쪽 끝을 3% Methylcellulose에 담가 튜브 내부를 용액으로 채웁니다. 그런 다음 시린지를 천천히 밀어 E three medium을 사용하여 메틸셀룰로오스를 배출하며, 담그기와 배출 단계를 반복합니다.그동안 히트 블록에서 0.1% aros의 분주액 하나를 70 °C까지 가열합니다. 반응 튜브를 짧게 볼텍싱한 후 38 °C로 설정된 히트 블록으로 옮깁니다. 가열 후 튜브를 잠시 식히고, 최종 농도가 133 ~ 200 mg/L가 되도록 trica를 첨가한 후 볼텍싱합니다.다시 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅된 배아를 예열된 aros가 들어 있는 반응 튜브로 옮기되 E3 배지는 가능한 한 적게 옮깁니다. FEP 튜브와 연결된 주사기로 배아를 흡입하기 전에 소량의 aros를 조심스럽게 빨아들인 후, 튜브를 aros로 완전히 채웁니다.배아는 머리가 개구부를 향하도록 튜브의 양끝 중 하나에 위치시켜야 합니다. 내용물이 새는 것을 방지하려면 튜브를 수평으로 유지하여 막아주십시오. 면도날을 사용하여 캐뉼라에서 배아를 잘라냅니다.그 다음 튜브를 수직으로 잡고 1.5% agarose 층 전체에 끝부분을 천천히 밀어 넣은 뒤 약간 회전시킵니다. 건조를 방지하기 위해, 이미징 전까지 고정된 표본을 E3 배지가 채워진 1.5 milliliter 반응 튜브에 보관하십시오. FEP 튜브 내부의 물고기가 일직선으로 위치해 있는지 확인하고, 이미징을 위해 머리 부분이 플러그 바로 위에 놓이도록 합니다.이미징 챔버 내의 배지에 trica를 추가합니다. 여기에는 혈관 발달을 관찰하기 위해 이틀 동안 이미징한 수정 후 1일 된 K-G-R-L-G-F-P 형질전환 제브라피쉬 배아가 나와 있습니다.제브라피시는 마운팅 매질의 제약을 받지 않으며 정상적으로 성장할 수 있습니다. 예를 들어, 머리가 위로 들리며 꼬리가 확장되고 혈관 발아(vascular sprouting)가 방해 없이 나타납니다.이 기술은 적절하게 수행되고 모든 재료가 즉시 준비되어 있다면 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 모든 주요 단계를 지체 없이 수행하십시오. 오염물질은 최종 이미지 품질을 저하시킬 수 있으므로 모든 용액을 깨끗하게 유지하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

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전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

이 보고서에서는, 우리는 전극이나 만성적인 실험에 microdialysis 프로브의 설치 기반에 대한 가벼운 치료 치과 수지의 새로운 응용 프로그램을 제안합니다. 이 자료는 두개골에 직접 접착 수 있습니다.

만성 실험에 장착 전극 또는 Microdialysis 프로브를위한 라이트 - 치료 치과 접착제 수지의 응용

학습하세요 제브라피쉬 배아를 장기 라이트 시트 현미경 관찰을 위해 FEP 튜브에 장착하는 방법을. 메틸셀룰로스 코팅과 아가로스 고정을 통해 수일간의 생체 발달 과정을 고해상도로 관찰할 수 있습니다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

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