Name: 쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 배우세요 초음파 유도 하 최소 침습 방광암 이종 이식 기법을. Matrigel에 현탁한 종양 세포를 쥐 방광 점막과 근육층 사이 공간에 정확히 주입하여 신속한 종양 형성과 생체 내 치료 반응 모니터링이 가능합니다.

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저자는 작은 동물 초음파 이미징 플랫폼의 사용에 대한 자신의 명령에 대한 종양 세포 라인과 벤 Deeley의 바이러스 전달을 수행하는 엘리 아나 Beraldi을 인정하고 싶습니다. 이 프로젝트는 독일의 재단 시스템에 의해 지원되었다 (DFG, JA 2117/1-1 : 1), 캐나다 암 협회 연구소 및 밴쿠버 연안 건강 연구소에서 가르 의사 과학자 상. 초음파 이미징 플랫폼은 혁신에 대한 캐나다 재단에 의해 투자되었다.

모든 동물의 절차는 동물 보호에 캐나다위원회 (CCAC)의 지침에 따라 수행 하였다. 프로토콜은 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 관리위원회 (: A10-0192 프로토콜 번호)에 의해 승인되었다. 1. 세포주의 제조 <ol><li> DNA 지문 (7)에 의해 각각 인간 방광암 세포주의 신원을 확인한다. </li><li> 생물 발광에 의한 이종 이식 종양의 성장 분석을 위해, 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 나르는 3 렌티 바이러스 구성체 세포주를 형질. </li><li> 해동 및 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 둘 베코 변성 이글 배지에 존재하는 세포 라인 (DMEM)를 확장. 통로 세포 적어도 3 배 그러나 3개월 초과 문화 시간을 피할 수 있습니다. </li></ol> 2. 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 리겔을 해동. 아래의 온도를 유지젤의 점도가 증가를 방지하기 위해 4 ° C에서. </li><li> 70 % 합류에 세포를 Trypsinize 정상적인 성장 배지에서 중단. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 계산합니다. </li><li> 200 X g에서 5 분 세포 현탁액을 스핀. 뜨는을 제거합니다. </li><li> (8-15 × 106 / ㎖)을 이용 세포주에 따라 원하는 성장 동역학이다 원하는 세포 농도에 도달하기 위하여 DMEM (10 % FBS) 및 마트 리겔 (1:1 비율)의 적절한 부피를 추가. 종양 세포 현탁액의 주입 부피는 40 ㎕를 할 것이다. </li><li> 로 pipetting 아래로 (P1000)에 의해 잘 혼합, 서스펜션에 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li></ol> 3. 동물의 준비 참고 : 지원 단계 4.7에서 요도 카테터에 대한 잠재적 인 필요를, 여성 마우스는이 동물 모델에서 선호하는 성별입니다. <ol><li> 주택의 쥐 기관 및 국가 동물 보호 번지에 따라idelines. 마우스를 포함한 모든 실험 윤리위원회의 승인을 얻습니다. </li><li> 3 % 이소 플루 란 / 산소의 혼합물로 마우스를 마취. 동물의 적절한 마취 (발가락 핀치에 응답하지 않는 등)를 확인합니다. </li></ol> 4. 실험 설정 <ol><li> 평면 단단한 플라스틱 소재 [그림 2 I] 모든 종류의에서 방광 안정화를 잘라. 조심스럽게 끈을 검사하고 마우스에 적용하기 전에 날카로운 모서리를 제거합니다. </li><li> 활력 징후의 지속적인 모니터링과 작은 동물 이미징 플랫폼의 [그림 1 I] 가열 된 영상 테이블에 동물을 탑재합니다. [그림 1 III] 고무 밴드와 낮은 사지를 고정합니다. </li><li> 2 % 클로르헥시딘 글루코 네이트 복부를 소독 및 멸균 면봉으로 피부를 닦아냅니다. </li><li> 방광 안정화 스트랩 방광 [그림 2 II]를 고정시킨다. 따라서, 회피단계 5.6 교내 주입하는 동안 방광 피해야합니다. </li><li> 하복부에 무균 초음파 젤을 적용합니다. </li><li> 천천히 초음파 scanhead (주파수 40 메가 헤르츠) 피부에 [그림 1 IV] (45 ~ 70 °의 두개골 각도와 길이를) 접근하고 초음파 화면에서 방광 [그림 3 I]를 시각화. </li><li> 방광이 비어 있으면, 경 요도 24 G의 angiocatheter 통해 50 ㎕의 멸균 따뜻한 인산 완충 식염수 (PBS)로 채운다. </li></ol> 5. 방광 벽의 레이어의 분리 <ol><li> PBS로 가득하고 30 G에 연결된 1.0 ML의 주사기를 부착, ¾ 바늘의 주사기 클램프 (전방 감독 베벨). </li><li> 30 ~ 45 °의 각도 단지 치골 위의 피부를 향해 바늘 (초음파 scanhead의 길이 방향 축에 대해 80 ~ 90 ° [그림 1]) 위치. </li><li> 바늘을 감지초음파 화면. </li><li> 천천히 피부와 복부 벽의 근육 [그림 3 II]를 관통. </li><li> (현재 후방 감독) 바늘 180 °의 경사를 켭니다. </li><li> 점막을 관통하지 않고 방광 벽에 바늘의 끝 부분을 삽입 [그림 3 III] </li><li> 천천히 인공 공간 [그림 3 IV]를 만들기 위해 근육 층과 점막 사이의 PBS의 50 μl를 주입. 참고 : 점막이 실수 단계 5.6시 천공 된 경우, 천천히 바늘을 당겨 점막 층은 바늘 끝을 통해 다시 반전 한 후 PBS의 50 μl를 주입. </li><li> 바늘을 철회. </li></ol> 6. 방광암 세포의 교내 접종 <ol><li> 30 G와 (리겔에 현탁 암 세포로 가득) 제 1.0 ML의 주사기를 부착, ¾ 주사기 클램프에 바늘. </li><li> 동일하게 바늘의 선단을 안내단계 5.7에서 생성 된 PBS-가득한 공간. </li><li> 이 공간에 세포 현탁액의 40 μl를 주입 [3 V 및 VI 피규어]. </li><li> 바늘을 철회. </li></ol> 7. 사후 중재 적 치료 (Supportive Care) <ol><li> 이미징 플랫폼에서 마우스를 분리합니다. </li><li> 마취에서 회복하는 동안 지속적인 감시 따뜻하고 편안한 환경에서 동물을 유지합니다. </li><li> 의식을 회복하고 정상적인 보행을 재개 한 후, 자신의 홈 케이지에 다시 동물을 배치합니다. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
<li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse%3A+the+importance+of+orthotopic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li>
<li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Kang, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Bladder+Tumor+Model+and+the+Evaluation+of+Intravesical+saRNA+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li>
<li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+transplantable+orthotopic+rat+bladder+transitional+cell+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model.</a> Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).</li>
<li>Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+phototoxicity+of+5-aminolevulinic+acid-induced+PpIX+in+an+orthotopic+rat+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model.</a> J. Urol. 153, 802-806 (1995).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+view%3A+Genetic+profiling+reveals+decades+old+cross-contamination+of+bladder+cancer+cell+line+KU7+with+HeLa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa.</a> J. Urol. (13), (2013).</li>
<li>Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+liposome-mediated+interleukin-2+gene+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model.</a> Gene Ther. 7, 844-851 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Black, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

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암 치료의 거의 모든 주요 발전은 임상 시험을 시작하기 전에 동물 모델에서 테스트가 필요합니다. 암의 동물 모델은 생체 내에서 종양 생물학을 연구하는 연구자 수 있도록 필수적인 도구입니다. 소성을 이종 이식 모델은 1,2 금 표준을 유지하고 (셀 라인의 선택의 측면에서) 가장 유연성을 제공하고, 가장 실용적인 유틸리티를 계속합니다. 예시 된 절차는 우리가 100 %의 기술적 성공률 세 가지 다른 세포 라인의 초음파 유도 경피적 주사로 이종 이식 종양을 설립 이전에 Dinney 등. (12)에 의해 기술 된 동 소성 모델의 최소 침습 수정합니다. 지속적인 추적 관찰 기간 동안, 생쥐의 98 %가 종양의 부피 상수의 증가를 보여 주었다. 최소 침습 기술을 수행함으로써 우리는 교내 모델의 기존의 한계를 해결 할 수 있었다. respe 게다가동물 복지를 cting,이 절차의 감소 침입은 수술 합병증의 수를 감소시켜 생체 실험의 재현성에 기여한다. 그것은 매우 복부 개복 수술과 상처 봉합에 대한 관련 필요성을 피하기 위해 효과적인 시간입니다. 우리는 (1.6 ±) 3.4 분에 크게 동물 당 절차 시간을 단축 할 수 있었다. 그러나, 우리의 새로운 접근 방식의 주요 장점은 정확성입니다. 고해상도 초음파는 우리가 방광 벽의 점막 아래에 생리 식염수 주입에 의해 생성 된 공간을 시각화 할 수 있습니다. 이 첫 번째 단계의 주입은 제 2 단계에서 종양 세포 주입을 촉진하고 종양 세포 누출의 위험을 최소화한다. 이것은 바늘 배치를 시각화하는 것은 불가능하다 사출의 정확한 깊이에 관한 불확실성의 요소가 항상 존재 개복 후의 벽내 주입 기술에 대조. 또한, 우리는 엄격히 전방 방광벽에 종양 세포를 접종 한, 종양 growt후부 방광 벽에 ​​시간을 피할 수 있습니다. 그 후 요관 구멍의 근접 종양의 성장으로 인해 방해 합병증의 비율은 매우 드문 경우입니다. 이 첨부 효과는 더 이상 성장과 치료 기간을 수 있습니다. 초음파 유도 종양 접종의 주요 제한은 적절한 기술 장비에 대한 필요성이다. 따라서이 절차의 성능 가능성이 인간의 암 동물 모델을 전문으로하는 센터로 제한됩니다. 여기에는 새로운 동물 모델링에 전문성을 갖춘 이들 기관 및 단체의 외부 연구 그룹 간의 협력을 장려해야한다. 초음파 영상과 약간의 손재주에 대한 지식에 의존하지만,이 모델은 유능한지도 아래 배우기 쉽습니다. 절차의 주요 단계는 생리 식염수로 방광 벽에 ​​인공 공간 submucosally의 창조이다. 이 공간은 천공 O없이 생성되면점막층 F를, 그것은 몇 분 동안 안정적으로 유지. 종양 세포를 접종하기 위해이 공간에 두 번째 바늘의 지침은 비교적 간단하다. 점막하 공간을 만드는 동안 주요 합병증은 방광 루멘에 바늘 구멍 뚫기입니다. 점막하 공간의 창조는, 그러나 가능한 남아있다. 바늘이 방광 벽으로 천천히 회수되어야하고 식염수 점막층은 바늘의 팁 위에 대칭 갈때 주입했다. 이 기동 후 점막하 공간은 덜 안정하다 (식염수 30-60 초 이내 방광 루멘 탈출한다) 및 종양 세포의 주입은 신속하게 수행되어야한다. 방광 내강으로 종양 세포의 유출은 점막의 천공 이러한 경우에 발생할 수있다. 교내 공간에서 종양 세포의 손실이 추적 관찰 기간 동안 감소 종양 볼륨을 초래할 수도 있지만, 우리는 어떤 방광 종양 흡수를 관찰 적이 없다. 또 다른 잠재적 인 Complication는 주입 채널을 통해 복강에 종양 세포의 누출이다. 우리는 (50) 동물의 하나의 복강 내 종양 세포의 확산을 관찰하고, 이것은 우리의 첫 번째 시도 중 하나가 발생했습니다. 우리는 너무 큰 종양 세포 현탁액 부피의 주입이 때문이다. 이것은 50-40 μL의 볼륨을 줄이는 것이 더 이상의 복강 내 유출의 결과는 사실에 의해 지원되었다. 쥐 동소 방광 암 이종 이식이 최소 침습 접종은 동일하게 조사 및 동물 모두를 혜택을 기존의 &quot;교내 모델&quot;의 혁신적인 변경을 나타냅니다. 이 모델의 장점은 최소한의 침습적 인 방식으로 소성을 이종 이식 종양을 확립하기 위해 신장, 전립선, 간 등의 다른 장기에의 적응을 권장합니다.

암 연구는 종양 생물학에 대한 우리의 이해를 심화하기 위해 환자의 종양에서 유래 세포주를 사용하여 인간의 암 동물 모델에 따라 달라집니다. 다른 치료 전략 하에서 생체 내 성장 분석 뮤린 동소 방광암 모델은 참조 표준 1,2 남아있다. 면역 결핍 마우스 (이종 이식 모델)에서 인간의 방광 암 세포의 접종은 방광 내 점적에 방광 벽에 ( &quot;방광 모델&quot;) 3,4,5 또는 직접 분사 ( &quot;교내 모델&quot;) 6.7을 사용합니다. 두 가지 기술로는 8,9 래트에서 수행 될 수있다. 방광 내 점적은 새로운 치료 에이전트의 후속 방광 점적 의무가 있습니다 방광의 rats에서 방광 상피 세포의 표면에 종양의 형성을 유도한다. 그러나,이 방법을 통해 전달 될 때 안정적이다 종양 형성 세포 라인의 개수는 제한된다D 이들 세포주 KU7 중 하나는, 최근 헬라 4,10 것으로 입증되었다. 방광 내 점적 또한 시간으로 인해 필요한 체류 시간을 소모하고, 빈번히 요도, 요관, 신우 및 11 등 요로의 인접 요소에서 종양의 성장을 유도한다. 또한, 방광 내 점적은 종종 요관 방광을 입력 방광의 바닥에 종양의 성장을 이끌고, 이는 상부 협착과 동반 신장 장애를 일으킬 수 있습니다. 전신 치료에 적합한 차 침략 방광 암 이종 이식은 방광 벽 (12)에 종양 세포를 직접 주입에 의해 만들어집니다. 많은 세포주가이 모델에서 적절히 성장하지만, 그것의 제한은 복부 절개 (13)의 필요성에 관한 모델의 침입이다. 또한이 모델은 때문에 정확하게 근육의 벽에 세포를 주입의 기술적 어려움으로 배우고 도전방광. 쥐에서 동소 일차 침습적 방광 암 이종 이식을 확립하기 위해 새로운 접근 방식은 &quot;벽내 모델&quot;기존의 단점을 해결하기 위해 우리 부서에서 개발되었다. 우리는 성공적으로 설립 침습 모형을 대체하기 위해 새로운 기술의 결과 전방 방광벽에 방광암 세포의 경피적, 초음파 유도 주사를 최적화 할 수 있었다. 또한 우리는 잠재적으로 &quot;교내 모델&quot;의 정확성과 재현성을 강화했다.

<table><tbody><tr><td>클로르헥시딘 글루코네이트 (2%)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' Thermo</td> <td>Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>트립신 (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3004202</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1 ml)</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (30 G; &frac34; in)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter (24 G)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 소동물 이미징 플랫폼</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706 초음파 스캔 헤드</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>캘리퍼 생명 과학</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

동 소성 방광 암 이종 이식은 생체 내에서 세포 분자 조작과 새로운 치료제를 연구하는 골드 표준입니다. 적합한 세포주 방광 점적 (nonmuscle 침략 성장 모델) 또는 방광 벽에 ​​교내 주사 (침략의 성장 모델)에 의해 하나 접종. 두 절차가 복잡하고 매우 시간 소모적이다. 또한, 표면 모델은 종양 형성 다음 점안 세포주의 부족으로 인한 단점을 갖는다. 벽내 주입은, 다른 한편으로는, 절차의 침입 및 호스트 마우스 연관된 병적 상태에 의해 손상된다. 마음에 이러한 단점과 함께, 우리는 동소 방광 암 이종 이식을 만들기위한 최소 침습적 방법을 개발하기 위해 이전의 방법을 수정했습니다. 초음파지도를 사용하여 우리는 성공적으로 방광암 세포주 UM-UC1, UM-UC3 및 UM-경피적 접종을 수행 한(50)를 누드로 UC13. 우리는이 방법이 효율적으로 정확하고 안전한 시간이 있음을 입증 할 수 있었다. 이 기술로, 초기 공간 PBS와 함께 방광 점막 아래에 작성되고, 종양 세포는 그 다음 제 2 단계에서 그 공간에 주입된다. 종양의 성장은 생물 발광 이미징 및 초음파 정기적으로 모니터링된다. 평균 종양 볼륨은 연구 기간에 우리의 50 마우스 중 하나를 제외하고 모두에서 꾸준히 증가했다. 본원에서, 최소 침습 신속하고 고정밀 방식 방광 암 이종 이식을 허용 접종이 신규 한 방법은, 기존의 모델을 대체했다.

<html> 세 가지 종양 세포 라인 (UM-UC1의 루크, UM-UC3의 루크와 UM-UC13의 루크)의 교내 주사를 세 번 연속 일에 초음파지도하에 50 동물에서 수행되었다. 접종을 효율적으로 수행되었다 (시간 5.7 분 / 동물을 의미) 및 내 또는 사후 중재 적 합병증과 관련되지 않았습니다. 종양 성장의 모니터링은 초음파 이미징 및 생물 발광에 의해 수행되었다. 하루 # 3에서 종양이 50 동물의 전방 방광 [그림 4 I] 초음파에 의해 감지 될 수있다. 생쥐의 98 %는 추적 관찰 기간 동안 일정 종양의 성장을 보였다 [그림 4와 그림 5]. UM-UC3의 루크의 접종에 따라, 하나의 마우스 복강 내 종양의 보급 및 제 동물 [표 1] 하루 # 7 후 involuted 종양을 개발했다. 이것은이 새로운 기술을 접종 마우스의 첫 번째 그룹이었다. NT &quot;&gt; 마우스는 하루 # 24, # 28에 희생되었고, # 37에 각각 UM-UC3의 루크, UM-UC1의 루크와 UM-UC13의 루크, 접종 후. 이종 이식 종양은 헤 마톡 실린 및 에오신에 수확하여 조사 하였다 (H &amp; E ) 섹션. 모든 종양은 근육 침략했고, 일부는 perivesical 지방에 침투하지만, 인접 장기에 어떤 침략은 [그림 6 I]. UM-UC13의 루크 종양을 갖는 마우스의 60 %와 UM-UC3의 루크 베어링 생쥐의 20 %는 관찰되지 않았다 종양은 염색 [그림 6 II]를 H &amp; E에 의해 확인 된 후 복막 림프절 전이를 개발했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> 그림 1. 이미지 및 실험 장치의 개략도. 마우스는 가열 작업 테이블 (I)에 탑재되며, &lt;(마취하에 개최강한&gt; II) 3 % ​​이소 플루 란 / 산소 혼합. 낮은 사지는 고무 밴드 (III)로 고정되어 있습니다. 피부 (45 ~ 70 °의 두개골 각도 세로 정렬)에 초음파 scanhead (IV)에 접근 한 후 방광 (V)가 초음파 화면에 시각화된다. 30 G 바늘 (VI)와 주사기는 30-45 °의 각도 (초음파 scanhead의 종축에 대하여 80 ~ 90 °)에서 피부로 안내된다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> 그림 2. 방광의 고정. 치수 및 방광 안정화 스트랩 (I)를 구성하는 그림은 스트랩은 낮은 복부에 부착 방광 (II)를 움직이게된다. 의 따라서 회피<html> 교내 주입하는 동안 방광은 피할 수 있습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> 그림 3. 초음파 화면 (I)에서 방광의 종양 세포의 접종 벽내. 시각화. 피부와 복부 벽의 근육의 천공 (II). 점막의 침투없이 방광 벽에 바늘을 삽입 (III). 근육 층과 느린 주입 후 점막 사이의 PBS (50 μL) (IV). 교내 인위적으로 만들어진 공간 (V, VI)에 리겔에 현탁 종양 세포. 1123fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. . 초음파에 의한 후속 초음파에 의해 지속적인 후속 종양 부피의 유의 한 증가를 보였다 (I : 1 일 3 위, II : 1 일 7 위, III : 하루 # 13). <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> 그림 5. 생물 발광에 의한 후속 생물 발광에 의해. 지속적인 후속 연구 기간 동안 발광의 지속적인 증가를 보여 주었다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> 그림 6. 이종 이식 종양과 림프절 전이의 조직학. 대표 이종 이식 TU의 토토 H &amp; E 섹션에서<html> MOR은 인접 장기 (I)에 침입하지 않고 근육에 침략적인 성장을 보여. UM-UC13의 루크 종양을 갖는 마우스의 60 %와 UM-UC3의 루크 종양 제시 후 복막 림프절 전이 (II)을 베어링 생쥐의 20 %. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 접종 세포주 </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1의 루크 </td><td style="width:64px;"> UM-UC3의 루크 </td><td style="width:64px;"> UM-UC13의 루크 </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> 마우스의 수 </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> (20) </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 볼륨 주입 μL </td>idth : 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> (40) </td><td style="width:64px;"> (50) </td><td style="width:64px;"> (50) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 세포 수, 절대 </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.6 × 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 × 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5.5 × 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 동물 당 시간, 분 </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.4 (1.6 ±) </td><td style="width:64px;"> 7.7 (3.7 ±) </td><td style="width:64px;"> 6.8 (2.9 ±) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 종양 발생 </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98 %) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100 %) </td><td style="width:64px;"> 14 (93 %) </td><td style="width:64px;"> 15 (100 %) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> 림프절 전이 </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20 %) </td><td style="width:64px;"> 9 (60 %) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> 후속 (일) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [치료 전] </td><td style="width:64px;"> 28 [치료 전] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> 종양 부피 (μL) </td><td style="width:64px;"> 4 일 </td><td style="width:64px;"> 11.6 (± 1.3) </td><td style="width:64px;"> 12.5 (± 1.7) </td><td style="width:64px;"> 14.4 (± 1.3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" row스팬 = &quot;2&quot;스타일 = &quot;높이 : 61px; 폭 : 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 끝 </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394.6 (± 72.4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288.7 (± 66.1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78.3 (13.4 ±) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> 추적 조사 </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> 종양 발광 (광자 / 초) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 4 일 </td><td style="width:64px;"> 4.6 × 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2.0 × 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5.8 × 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (9.4 × 10 7 ±) </td><td style="width:64px;"> (3.7 × 10 7 ±) </td><td style="width:64px;"> (1.3 × 10 8 ±) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"스타일 = &quot;높이 : 67px; 폭 : 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 끝 </td><td style="width:64px;"> 1.9 × 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1.4 × 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1.5 × 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> 추적 조사 </td><td style="width:64px;"> (4.0 × 10 9 ±) </td><td style="width:64px;"> (2.3 × 10 9 ±) </td><td style="width:64px;"> (1.9 × 10 9 ±) </td></tr></tbody></table> 표 1. 초음파 유도 종양 세포 주입 - 절차 및 결과.

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 빠르고 정밀하며 최소 침습적인 방식으로 정위성 방광암 이종 이식 모델을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 특정 종양 세포주를 확장하고 종양 세포를 Matrigel 현탁액으로 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 동물을 영상 플랫폼에 고정하고 초음파를 통해 방광을 시각화합니다.그 후, 식염수 주입을 통해 방광의 점막층과 근육층을 분리합니다. 마지막으로, 종양 세포 매트리젤 현탁액을 이렇게 인위적으로 생성된 공간에 주입합니다. 최종적으로, 초음파 영상 및 생물 발광을 통해 종양 성장을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 기술이 일차 이종이식편 접종을 위한 개복술 사용과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 갖는 주요 장점은 신속하고 정확하며 최소 침습적이라는 점입니다. 이러한 기술의 영향은 방광암의 진단 및 치료로 확장되는데, 이는 자가 이종이식편이 새로운 치료법의 전임상 연구를 위한 표준 지표이기 때문입니다. 주입 단계는 학습하기 매우 어렵고 수관(water way)이 매우 얇기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 도움이 될 것입니다.Igor Mosca는 연구 보조원을, Wolfgang Yeager는 박사후 연구원을 두고 있으며, 두 사람 모두 비뇨기과 전문의입니다. 각각의 인간 방광암 세포주의 정체성을 확인한 후, 본 연구에서는 DNA 핑거프린팅을 통해 확인된 세포주에 Xenograft 종양의 생물 발광 성장 분석을 위한 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase) 유전자를 포함하는 렌티바이러스 컨스트럭트를 사용하여 형질전환을 수행합니다.실험을 시작할 준비가 되면, 10% FBS가 포함된 DMEM을 해동하여 기존 세포주를 확장하고, 습도가 유지되는 5% CO2 분위기의 37°C에서 배양합니다. 해동 후 주입을 위한 세포 현탁액을 준비하기 위해, matrigel을 준비하고 trypsin을 얼음 위에 보관하며, 70% confluence 상태의 세포를 일반 성장 배지로 부유시킨 후 세포 수를 측정하고 현탁액을 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 동물당 40 µL의 볼륨을 주입하기 위해 원하는 세포 농도에 도달하도록 적절한 양의 동일 부피 DMEM-FBS와 MATRIGEL을 첨가합니다.평평하고 단단한 플라스틱 재질의 도구를 사용하여 기포가 생기지 않도록 잘 섞어줍니다. 방광 안정기(bladder stabilizer)를 절단한 후, 마우스에 적용하기 전에 스트랩을 주의 깊게 검사하여 날카로운 모서리를 제거합니다. 암컷 마우스를 3% isoflurane이 포함된 산소로 마취시키고 발가락 꼬집기(toe pinch) 테스트를 수행한 후.적절한 진정 상태를 유지하기 위해 동물을 소동물 영상 플랫폼의 가열 영상 테이블에 올리고, 고무줄을 이용하여 생체 징후를 지속적으로 모니터링합니다. 하지를 고정한 후 0.5% chlorhexidine gluconate를 사용하여 복부를 소독하고, 멸균 면봉으로 피부를 닦아냅니다. 다음으로 방광 고정 스트랩을 사용하여 방광을 고정함으로써 벽내 주사 시 방광이 밀려나지 않도록 합니다.그 다음 하복부에 멸균 초음파 젤을 도포합니다. 초음파 스캔 헤드를 피부에 대고 천천히 이동시키며 초음파 화면에서 방광을 시각화합니다. 방광이 비어 있는 경우, 방광벽 층을 분리하기 위해 24 gauge angio 카테터를 통해 50 µL의 따뜻한 PBS를 주입하여 방광을 채웁니다.PBS가 채워진 1.0 milliliter 주사기에 30 gauge 3/4 inch 바늘을 연결하여 주사기 클램프에 부착하는 것으로 시작합니다. 치골 바로 위의 피부 방향으로 바늘을 위치시킵니다. 30에서 45도 각도로, 초음파 화면에서 바늘을 확인한 후 피부와 복벽 근육을 천천히 관통시킵니다.다음으로, 바늘의 베벨을 180도 회전시켜 후방을 향하게 한 후, 점막을 관통하지 않도록 바늘 끝을 방광벽에 삽입합니다. 그다음 인공 공간을 만들기 위해 바늘을 제거하기 전 근육층과 점막 사이에 50 µL의 PBS를 천천히 주입합니다. 방광암 세포를 주입하기 위해, 암세포 마트리젤 현탁액이 채워진 두 번째 1.0 mL 주사기와 30 gauge 3/4인치 바늘을 주사기 클램프에 부착합니다.바늘 끝을 PBS가 채워진 공간으로 안내합니다. 방금 생성된 공간에 현탁액 40 µL를 주입합니다. 그 다음, 이미징 플랫폼에서 마우스를 분리한 후 바늘을 제거합니다.지속적인 모니터링 하에 따뜻하고 편안한 환경에서 유지하십시오. 의식을 회복하고 정상적인 보행이 가능해지면 동물을 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 초음파 유도 하에 50마리의 동물을 대상으로 3일 연속으로 세 가지 서로 다른 종양 세포주를 근육 내 주사하였습니다.접종은 효율적으로 수행되었으며, 중재 중 또는 중재 후 합병증은 발생하지 않았습니다. 종양 성장은 초음파 영상 및 생물 발광을 통해 모니터링되었습니다. 3일 차에 모든 50마리 동물의 전방 방광에서 초음파로 종양이 검출되었으며, uc.Three 접종 후 추적 관찰 기간 동안 생쥐의 98%에서 지속적인 종양 성장이 나타났습니다.마우스 한 마리에서 복강 내 종양 전이가 발생했으며, 두 번째 동물에서는 7일 이후에 종양이 퇴행했습니다. 이는 uc.Three 접종 후 이 새로운 기술로 접종한 첫 번째 마우스 그룹이었습니다. Luke uc, one Luke, and uc.13 Luke. 마우스는 각각 24일, 28일 및 37일에 희생시켰습니다. 이종이식 종양을 적출하여 H&amp;E 염색 절편을 통해 분석하였습니다.모든 종양은 근육 침습성였으며 일부는 주변 내장 지방으로 침전되었으나, 인접 장기로의 침범은 관찰되지 않았습니다. uc의 60%, Luke 13마리, 그리고 uc의 20%에서 나타났습니다. Luke 종양 이식 마우스 3마리에서 후복막 림프절 전이가 발생하였으며, 이는 H&amp;E 염색을 통해 확인되었습니다.숙달되면 이 기술은 3분 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하기 위해서는 초음파 영상에 대한 숙련도가 필수적입니다. 이러한 방식으로 종양을 접종한 후, 초음파를 통해 시간 경과에 따른 종양 성장을 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 마이크로버블을 이용해 종양 관류를 관찰할 수 있습니다. 또한 새로운 실험 제제를 이용한 종양 내 주사를 수행하는 것도 가능합니다.

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