3.15: 예쁜 꼬마 선충 주화성 분석

화학적 자극에 반응하여 세포나 유기체가 움직이는 것을 화학주성(chemotaxis)이라고 합니다. 이 비디오에서는 선충인 C. elegans를 사용하여 화학주성 분석을 수행하는 방법을 배웁니다. 또한 예쁜꼬마선충의 화학주성 분석법이 학습 및 기억, 후각 적응 및 알츠하이머병을 연구하는 데 어떻게 적용되는지에 대해서도 논의할 것입니다.

먼저 두 가지 유형의 화학주성에 대해 논의해 보겠습니다. 화학적 자극을 향한 움직임을 양성 화학주성(positive chemotaxis)이라고 합니다. 대조적으로, 화학적 자극으로부터 멀어지는 것을 음성 화학주성이라고 하며, 이를 통해 유기체는 유해한 화학 물질로부터 멀어질 수 있습니다.

화학주성은 유기체가 먹이 공급원을 향해 이동함에 따라 유기체 수준에서 발생할 수 있습니다. 화학주성은 또한 유기체 내의 세포 수준에서 발생합니다. 예를 들어, 면역 세포는 병원체나 염증 부위로 이동합니다. 또 다른 예로, 정자 세포는 난자가 방출하는 화학 유인 물질에 반응하여 난자를 향해 움직입니다. 화학주성은 또한 세포가 화학적 자극에 반응하여 이동하여 발달 중인 유기체의 조직과 기관을 형성하는 발달 과정의 중요한 과정입니다.

토양에 서식하는 야생 예쁜꼬마선충의 경우, 화학주성은 박테리아를 검출하고 주요 먹이 공급원인 박테리아로 이동하는 데 중요합니다. 대조적으로, 예쁜꼬마선충은 중금속, pH가 낮은 물질 및 유기체에 독성이 있는 세제에 의해 거부됩니다.

Chemotaxis assay는 일반적으로 chemotaxis plate를 준비하는 것으로 시작합니다. 눈금자와 마커를 사용하여 선충 성장 배지가 있는 5cm 플레이트를 4개의 동일한 사분면으로 나눕니다. 그런 다음 사분면 중심을 중심으로 반경이 0.5cm인 원을 그립니다. 이것은 웜의 시작점이 될 것입니다. 각 사분면의 점을 표시하고 레이블을 지정하여 각 점이 중심에서 그리고 서로 같은 거리에 있도록 합니다.

분석을 위해 기생충을 준비할 때 연령 동기화된 젊은 성인 기생충을 사용하여 화학주성의 차이가 발달 단계의 인공물이 되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 기생충이 동기화되면 먼저 2ml의 S-basal buffer를 젊은 성인이 들어 있는 접시에 피펫팅하여 수집합니다. 접시를 소용돌이치고 기울여 접시에서 벌레를 씻어냅니다.

다음으로, 웜/S-기저 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 웜/S-기저 용액을 잠시 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 웜 펠릿에 또 다른 밀리리터의 S-기저 용액을 첨가하여 웜을 세척합니다. 튜브를 뒤집고 세척을 두 번 더 반복합니다. 세척 후 약 100μl의 S-기저 용액을 제외한 모든 용액을 제거합니다. 다음으로, 웜/S-기저 혼합물 2μl를 NGM 플레이트에 추가합니다. 현미경을 사용하여 존재하는 벌레의 수를 세십시오. 이상적으로는 S-basal 2?l당 50-250개의 웜이 있을 것입니다.

이제 화학주성 플레이트와 웜이 준비되었으므로 화학주성 분석을 시작할 수 있습니다. 먼저, 동일한 부피의 테스트 용액을 0.5M 아지드화나트륨과 혼합하는데, 이 마취제는 기생충이 목적지에 도착하면 마비시킵니다. 제어 솔루션에서도 동일한 작업을 수행합니다. 다음으로, 웜/S-기저 혼합물 2μl를 화학주성 플레이트의 중앙에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 테스트 용액 또는 대조 용액의 피펫 2 μl를 화학주성 플레이트의 적절하게 라벨링된 지점에 놓습니다. 테스트 및 제어 용액이 흡수되면 뚜껑을 다시 덮고 플레이트를 뒤집고 타이머를 1시간으로 설정합니다.

지렁이가 접시의 화학적 자극에 반응할 수 있도록 한 시간을 준 후 데이터를 분석할 수 있습니다. 각 사분면 내에 있는 웜의 수를 수동으로 계산합니다. 웜이 테스트 화학 물질에 끌리면 해당 사분면에 더 많은 웜이 존재합니다. 그들이 그 화학 물질에 대해 중립적이라면, 벌레는 각 사분면에 동등하게 존재할 것입니다.

이 데이터를 사용하여 테스트 사분면의 웜 수에서 제어 사분면의 웜 수를 뺀 값을 총 웜 수로 나눈 화학 주축 지수를 계산합니다. +1에 가까운 화학주성 지수는 인력을 나타내고, -1에 가까운 화학주성 지수는 반발을 나타냅니다.

이제 화학주성 분석을 설정하는 방법을 배웠으므로 이러한 실험이 과학적 질문에 답하는 데 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans)의 화학주성 분석법이 적용된 방법 중 하나는 학습과 기억을 연구하는 것입니다. 예를 들어, 기생충은 화학적 자극을 먹이 공급원과 연관시키도록 조건화될 수 있습니다. 잘 먹은 벌레는 한 시간 동안 굶어 죽인 다음 음식과 부타논과 같은 화학 물질로 조건화됩니다.

다음으로, 벌레는 음식과 함께 접시에 담지만 부타논은 없습니다. 그런 다음 화학주성 분석을 실행하면 기생충이 부타논을 음식과 연관시키는 방법을 학습했는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 실험의 많은 변형은 어떤 유전자 또는 뉴런이 학습과 기억에 중요한지와 같은 다른 정보를 결정하기 위해 수행될 수 있습니다.

후각 적응은 감각 뉴런이 시간이 지남에 따라 자극에 대한 반응을 감소시켜 동물이 다른 더 중요한 자극에 반응할 수 있도록 할 때 발생하는 현상입니다. 예를 들어, 일정 기간 동안 냄새에 노출된 야생형 예쁜꼬마선충은 후각 적응으로 인해 화학주성 분석 중에 해당 냄새에 끌리기보다는 무시합니다. 따라서 egl-4와 같은 후각 적응의 유전자 조절자를 밝히기 위해 고처리량 유전자 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 또한, 형광 표지된 단백질을 발현하는 형질전환 기생충은 후각 적응 중 국소화의 변화를 관찰할 수 있습니다.

마지막으로, 화학주성 분석법은 알츠하이머병을 연구하기 위해 예쁜꼬마선충에서 사용할 수 있습니다. 과학자들은 알츠하이머병의 특징인 형광 태그가 붙은 인간 아밀로이드 베타 펩타이드를 예쁜꼬마선충의 뉴런에서 발현할 수 있습니다. 흥미롭게도, 화학주성 분석법은 뉴런 집단에서 아밀로이드 베타를 발현하는 기생충이 대조군에 비해 화학유인물질에 대한 화학주성이 감소된 것으로 나타났습니다. 이 실험은 다른 뉴런 집단 또는 조직에서 아밀로이드 베타를 발현하거나 아밀로이드 베타 발현의 영향을 완화할 수 있는 화합물이 있는지 여부를 결정하여 궁극적으로 잠재적인 치료법으로 이어질 수 있는지 여부를 포함하여 다양한 변형을 수행할 수 있습니다.

당신은 방금 C. elegans에서 chemotaxis에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 먼저, 화학주성이 무엇인지, 그리고 화학주성이 자연에서 유기체와 세포에 중요한 이유를 정의했습니다. 그런 다음 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 사용하여 화학주성 분석을 수행하는 방법을 시연했습니다. 마지막으로, 학습과 기억, 후각 적응 및 알츠하이머병을 이해하기 위해 화학주성을 적용할 수 있는 방법에 대해 논의했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!