시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여

이 실험 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내에서 클라미디아 봉입체(inclusion) 성장 역학을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포질에서 GFP와 같은 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 형광 숙주 세포를 생성합니다. 그 다음, 숙주 세포를 클라미디아로 감염시킨 후 배양합니다.

그 후 감염된 세포를 라이브 형광 현미경으로 시각화합니다. 마지막으로, 현미경 분석 소프트웨어를 통해 클라미디아 봉입체(inclusion)의 특성을 정량화하며, 최종적으로 라이브 형광 현미경을 사용하여 호스트 세포 내의 클라미디아 봉입체를 시각화하고 정량적 결과를 얻기 위해 봉입체의 생물학적 파라미터를 측정합니다. 항체 기반 계수와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이러한 역이미징 전략을 살아있는 세포에 적용할 수 있으며 다른 형광 표지와 병용하여 모든 클라미디아 종의 봉입체 역학을 정량화할 수 있다는 점입니다.

또한, 세포 내 박테리아를 표지하는 일반적인 방법과 달리, 이 접근 방식은 살아있는 세포 내의 봉입체 막을 시각화하여 이 병원체 포함 구획의 중요한 동적 특성을 밝혀낼 수 있습니다. 텍스트 프로토콜 플레이트에 따라 형광 HeLa 세포를 생성한 후, 고해상도 이미징을 위한 유리 바닥 접시나 IFU 측정 및 다중 웰 스크리닝을 위한 24 웰 플레이트와 같은 원하는 배양 용기에 GFP HeLa 세포를 분주하십시오. Crich Cotus 또는 다른 원하는 클라미디아 균주가 들어 있는 냉동 튜브를 얼음 위에서 해동하고 HBSS로 희석하여 원하는 감염 다중도(MOI)로 맞춥니다. Crich Cotus, LGV zero VL two를 이용한 정적 감염을 수행하려면, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 HBSS를 사용하여 GFP HeLa 세포를 세척하십시오.

희석된 박테리아를 웰에 넣고 25 °C에서 2시간 동안 배양한 후, 세포를 흡입하여 제거하고 HBSS로 세척합니다. 그 후 성장 배지를 첨가하고, 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 세포를 배양하여 crich to serovar D 또는 다른 클라미디아 균주를 이용한 원심분리 보조 감염을 수행합니다. HBSS를 사용하여 GFP hela 세포를 세척하고 희석된 박테리아를 세포에 첨가합니다.

그 다음, 감염된 세포가 담긴 디쉬를 벤치탑 원심분리기의 스윙 버킷 로터 내 멀티웰 플레이트 홀더에 넣습니다. 900 ×g, 25 °C에서 1시간 동안 세포를 원심분리합니다. 이후 생물안전작업대 내 37 °C 이산화탄소 배양기에 배양 용기를 1시간 동안 보관한 후, 세포를 흡입 제거하고 HBSS로 2회 세척한 뒤 성장 배지를 첨가합니다.

감염된 세포가 담긴 디쉬를 37 °C에서 배양합니다. 클라미디아 봉입체를 시각화하려면, 이산화탄소 배양기에서 클라미디아에 감염된 GFP hela 세포를 꺼내고 phenol red가 없는 RPMI와 5% FBS를 사용하여 배지를 교체합니다. 디쉬 또는 멀티웰 플레이트를 20배 이상의 오일 대물렌즈가 장착된 도립 형광 현미경 위에 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여, 커다란 검은색 구멍을 포함하고 있는 녹색 세포로 보이는 클라미디아 감염 GFP hela 세포를 식별합니다.

획득 설정 대화 상자에서 소프트웨어가 녹색 채널과 샘플에 추가된 다른 모든 채널을 획득하도록 구성하십시오. 캡처/녹화 버튼을 사용하여 원하는 시점에 이미지를 획득하십시오. 감염 후, 클라미디아에 감염된 GFP HeLa 세포를 배양기에서 꺼내 접시를 도립 형광 현미경 위에 놓으십시오.

봉입체가 최대 직경과 수율을 보이는 세포의 중간 평면에 집중하십시오. 경계가 선명하게 처리된 이미지를 웰당 최소 10개 시야에서 획득하십시오. 일반적으로 웰은 반복 실험군 또는 실험 변수를 나타냅니다.

Measurements 탭에서 GFP hela 세포를 찾으려면, find objects 명령을 사용하고 green 채널을 선택하십시오. 세포의 상대적 강도에 따라 임계값 강도를 조정하십시오. 포함물 또는 검은색 구획의 수와 GFP hela 세포의 수를 육안으로 직접 계수하거나, 이미징 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 포함물을 자동으로 식별하고 계수하십시오.

선택한 객체 중에서 크기가 5 µm²보다 큰 객체만 남겨 필터링합니다. 이를 모집단 1이라고 합니다. 이 모집단을 사용하여 'fill holes in objects' 명령을 적용하면 모집단 2가 생성됩니다.

인구집단 2에서 인구집단 1을 빼서 양성으로 표시된 클라미디아 봉입체인 인구집단 3을 생성합니다. filter population 명령을 사용하여 인구집단 3에 크기 필터를 적용합니다. 예를 들어, 24시간 이상 감염된 세포 내 봉입체의 경우 25 square micrometers보다 큰 객체를 유지하고, 초기 감염 시간의 경우 4 square micrometers보다 큰 객체를 유지하도록 크기 필터를 설정합니다.

이러한 봉입체(inclusion)들은 크기가 훨씬 작기 때문에, 크기 필터링을 거치면 봉입체로 지정된 객체 집단이 추출됩니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 봉입체 수, 봉입체 크기 및 봉입체 둘레와 같은 정량적 데이터를 이미지에서 계산하십시오. 클라미디아(chlamydia) 감염 시 봉입체는 검은 점으로, 그리고 숙주 세포 또는 숙주 세포 내에서 형광 단백질을 발현하는 클라미디아로 쉽게 관찰되며, 이러한 명확성을 활용하여 수많은 시야 또는 처리 조건 전반에서 자동 식별을 수행할 수 있습니다.

이 그래프에서 보여주듯이, 주요 응용 분야 중 하나는 살아있는 감염 세포 내의 클라미디아 봉입체 형성 단위(inclusion forming units)를 결정하는 것이며, 이는 시간과 비용이 많이 드는 면역형광법 절차의 필요성을 없애줍니다. 이 이미징 접근법의 또 다른 핵심 특징은 모든 클라미디아 종 또는 균주에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다. 본 예시에서는 네 가지 클라미디아 종 또는 균주 중 하나에 감염된 GFP hela 세포의 시간 경과 분석을 각 종과 균주에 대해 수행하였습니다.

표시된 시점에서 봉입체를 마킹하고 분석하여 평균 면적, 둘레 길이 및 세포당 봉입체 수를 계산했습니다. 이러한 속성들은 호스트 세포와의 상호작용 방식을 포함하여 클라미디아 봉입체의 생물학적 특성에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 여기 제시된 영상은 GFPC.Tracom L2에 감염된 mCherry HeLa 세포의 영상으로, 감염 48시간 후부터 125분 동안 5분 간격으로 촬영한 타임랩스 이미지로 구성되어 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 이 역이미징 기법을 사용하여 클라미디아 봉입체를 시각화할 뿐만 아니라, 봉입체 면적, 둘레, 세포당 봉입체 수와 같은 봉입체 역동성을 정량화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기법은 기존의 시각화 기법들에 비해 비용 효율적이며, 모든 클라미디아 종 및 균주에 적용 가능합니다.