2015년 10월 13일
클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 클라미디아 함유 성장 역학을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 세포질에서 GFP와 같은 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 형광 숙주 세포를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 숙주 세포는 클라미디아에 감염되어 배양됩니다.
그런 다음 감염된 세포를 실시간 형광 현미경으로 시각화합니다. 마지막으로, 클라미디아 함유 특성은 현미경 분석 소프트웨어를 통해 정량화되며, 궁극적으로 라이브 형광 현미경 검사는 숙주 세포 내의 클라미디아 함유물을 시각화하고 정량적 결과를 위해 함유물의 생물학적 매개변수를 측정하는 데 사용됩니다. 항체 기반 계수와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 역 이미징 전략을 살아있는 세포에 사용할 수 있으며 다른 형광 표지와 협력하여 모든 클라미디아 종의 봉입 역학을 정량화할 수 있다는 것입니다.
또한, 세포 내 박테리아를 라벨링하는 일반적인 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포의 봉입막을 조명하여 이 병원체 포함 구획의 중요한 동적 특성을 밝힐 수 있습니다. 텍스트 프로토콜 플레이트에 따라 형광 헬라 세포를 생성한 후, 고해상도 이미징을 위한 유리 바닥 접시와 같은 원하는 배양 용기에 GFP 헬라 세포를 IFU 측정 및 다중 웰 스크리닝을 위한 4개의 24웰 플레이트를 사용하여 크리크 코투스 또는 기타 원하는 클라미디아 균주를 포함하는 동결된 튜브를 얼음에서 해동하고 HBSS에서 원하는 감염 다중성으로 희석합니다. Crich Cotus에 정적 감염을 수행하기 위해 LGV zero VL 2는 우물에서 배지를 흡인하고 HBSS를 사용하여 GFP 헬라 세포를 세척합니다.
웰에 희석된 박테리아를 넣고 섭씨 25도에서 2시간 동안 배양하고 세포를 흡인하고 HBSS로 세척합니다. 그런 다음 성장 배지를 첨가한 후 이산화탄소 배양기에서 섭씨 37도의 세포를 배양하여 혈청형 D 또는 기타 클라미디아 균주에 대한 원심분리 보조 감염을 수행합니다. HBSS를 사용하여 GFP 헬라 세포를 세척하고 희석된 박테리아를 세포에 첨가합니다.
그런 다음 감염된 세포가 담긴 접시를 벤치탑 원심분리기의 스윙 버킷 로터의 다중 웰 플레이트 홀더에 넣습니다. G의 900배와 섭씨 25도에서 1시간 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛에서 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 1시간 동안 배양 용기를 놓고 HBSS로 세포를 두 번 세척하고 성장 배지를 추가합니다.
감염된 세포가 있는 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. 클라미디아 함유물을 시각화하려면 이산화탄소 인큐베이터에서 클라미디아에 감염된 GFP 헬라 세포를 제거하고 페놀 레드 및 5% FBS가 없는 RPMI를 사용합니다.배지를 교체하려면 20배 이상의 오일 대물렌즈가 있는 도립 형광 현미경에 접시 또는 멀티웰 플레이트를 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 큰 블랙홀을 포함하는 녹색 세포로 나타나는 클라미디아에 감염된 GFP 헬라 세포를 식별합니다.
수집 설정 대화 상자에서 녹색 채널과 샘플에 추가된 다른 채널을 획득하도록 소프트웨어를 구성합니다. 캡처 슬래시 녹화 버튼을 사용하여 원하는 시간에 이미지를 획득합니다. 감염 후. 인큐베이터에서 클라미디아에 감염된 GFP 헬라 세포를 제거하고 접시를 인버터 형광 현미경에 놓습니다.
내포물이 최대 직경과 수율에 있는 세포의 중간 평원에 초점을 맞춥니다. 선명한 가장자리는 웰당 최소 10개의 필드에서 이미지를 획득합니다. 웰은 일반적으로 반복 실험 또는 실험 변수를 나타냅니다.
측정 탭에서 GFP 헬라 셀을 찾으려면 개체 찾기 명령을 사용하고 녹색 채널을 선택합니다. 세포의 상대적 강도에 따라 임계값 강도를 조정합니다. 개재물 또는 블랙 컴파트먼트 및 GFP 헬라 세포의 수를 눈으로 수동으로 계수하거나 이미징 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 개재물을 자동으로 식별하고 계수합니다.
5제곱마이크로미터보다 큰 개체만 유지하여 선택한 개체를 필터링합니다. 이를 population one이라고 합니다. 이 채우기를 사용하여 개체의 구멍 채우기 명령을 입력으로 적용하면 이 단계에서 모집단 2가 생성됩니다.
개체군 2에서 개체군 1을 빼면 개체군 3으로 지정된 양수로 표시된 클라미디아 내포물이 생성됩니다. filter population 명령을 사용하여 population 3에 크기 필터를 적용합니다. 예를 들어, 세포에 내포된 25제곱마이크로미터보다 큰 물체를 24시간 동안 감염시키거나 초기 감염 시간을 위해 더 오래 보관하면 4제곱마이크로미터보다 큰 개체를 유지하도록 크기 필터를 설정합니다.
이러한 내포물은 훨씬 더 작기 때문에 크기 필터는 내포물로 지정된 개체 모집단을 생성합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 개복 수, 개재, 크기 및 포함과 같은 정량적 데이터를 계산합니다. 클라미디아 내포물 감염 시 둘레는 검은 반점과 숙주 세포 또는 숙주 세포 내에서 클라미디아를 발현하는 형광 단백질로 쉽게 볼 수 있으며, 그 투명도는 다양한 시야 및/또는 치료에 걸쳐 자동화된 식별을 위해 활용될 수 있습니다.
이 그래프에서 볼 수 있듯이, 한 가지 주요 응용 분야는 살아있는 감염된 세포에서 클라미디아 함유 형성 단위를 측정하는 것인데, 이는 시간과 비용이 많이 드는 면역 형광 절차의 필요성을 없애줍니다. 이 이미징 접근 방식의 또 다른 주요 특징은 모든 클라미디아 종 또는 균주에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 예에서는 4개의 클라미디아 종 또는 균주 중 하나에 감염된 GFP 헬라 세포의 시간 경과 분석을 이러한 종 및 균주 각각에 대해 수행했습니다.
내포물을 표시하고 분석하여 표시된 시간에 셀당 평균 면적, 둘레, 길이 및 수를 계산했습니다. 이러한 특성은 숙주 세포와 상호 작용하는 방식을 포함하여 클라미디아 내포물의 생물학에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 여기에 표시된 것은 감염 후 48시간부터 125분 동안 5분 간격으로 촬영한 타임랩스 이미지로 구성된 GFPC, Tracom L two에 감염된 m cherry hela 세포의 비디오입니다.
이 동영상을 시청한 후에는 이 역이미징 기법을 사용하여 클라미디아 개재물을 시각화할 뿐만 아니라 개재물 면적 둘레 및 세포당 개재물 수와 같은 개재물 역학을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 기존의 시각화 기술에 비해 비용 효율적이며 모든 클라미디아 종 및 균주에서 작동합니다.
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이 기사는 형광 단백질을 사용하여 살아있는 세포에서 클라미디아 포함체 성장 동력학을 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 클라미디아 감염력의 신속한 결정을 가능하게 하며 종합적인 분석을 위해 다른 형광 표지와 결합할 수 있습니다.
Quantitative live-cell imaging of Chlamydia inclusion growth using fluorescent proteins addresses a critical need for dynamic, high-content infection models in early discovery. This approach enables real-time measurement of pathogen-host interactions, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method's compatibility with multiple chlamydial species and fluorescent labels enhances its portfolio value for translational infectious disease research.
This live-cell imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation, phenotypic screening, and translational infection modeling.