Name: 시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여 클라미디아 액포 성장 역학 살아있는 세포에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 형광 단백질을 사용하여 클라미디아 액포 성장 역학을 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 실시간으로 감염 과정을 분석하여 연구자들이 클라미디아 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 합니다.

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저자는 pGFP-SW2 및 pASK-GFP-mKate2-L2 플라스미드에 대해 Ian Clarke와 P. Scott Hefty에게 각각 감사를 표합니다. 기술 지원을 제공해 주신 Paul Miller와 기타 자료를 제공해 주신 Richard Stephens에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 AI095603(KH)의 지원을 받았습니다.

형광 숙주 세포 라인의 1 세대 <ol><li> / 잘 2 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에 일 1. 플레이트 293T 세포 (또는 다른 레트로 바이러스 포장 라인) ~ 75 % 합류 다음날합니다. 원한다면, 각각의 레트로 바이러스에 대한 중복 웰 플레이트가 사용될 수있다. </li><li> 주 2. 대기음 세포 및 2를 가하여 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS + 2 mM의 L- 글루타민). 리포 펙 타민 2000 또는 유사한 시약을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5-8 μg의 레트로 바이러스 벡터 (GFP를 포함) 및 포장 벡터의 각 (예., pVSVg)와 세포를 형질. </li><li> 1 ml의 성장 매체와 매체를 교체 이후 37 ° C CO 2 배양기에서 4-6 시간 동안 DNA와 세포를 품어합니다. </li><li> 37 ° C CO 2 배양기에서 48 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 일 3. 플레이트 표적 세포 (예., 헬라) 105 세포의 밀도로 대략 6 웰 플레이트 상 / 웰이 될 ~ 50 % 합류다음날. 거꾸로 현미경에 GFP의 형광을 모니터링하여 293T 세포에 긍정적 인 형질을 확인합니다. </li><li> 주 4. 수집 레트로 바이러스 함유 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터를 통해 뜨는을 피펫을 사용하여 필터링 293T 세포 오프 상층 액을. </li><li> 헬라 세포에서 매체를 제거하고 16 μg의 / ㎖의 폴리 브렌를 포함하는 0.5 ml의 성장 매체를 추가합니다. 세포에 필터링 된 레트로 바이러스의 ~ 0.5 ML을 추가 현명한 드롭, 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 세포를 배양한다. 4 ℃에서 (잘 복제에서, 즉) 남아있는 레트로 바이러스를 저장합니다. </li><li> 중복 우물이 순차적으로 나머지 레트로 바이러스 입자와 감염 여분의 레트로 바이러스, 단계를 반복 1.7을 생성하는 사항이있는 경우의 날 (5). </li><li> (예를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신) 10cm 접시 포함 된 선택 항생제로 1 일 6 항로는 헬라 세포 1을 형질 전환. </li><li> 선택 antibio의 존재에 다시 성장 형질 세포에 충분한 시간을 기다립니다셀 선택 항생제의 낮은 농도의 표준 기술에 의해 전달 될 ​​수있는 후 TIC (예., 200 μg의 / ㎖ 네오 마이신). 주 : 필요한 경우 세포 클론 적 또한,이 때 이상적인 밝기 위해 선택 될 수있다. </li></ol> GFP 발현 클라미디아 트라코마 티스의 2 세대 <ol><li> 배 CaCl2를 버퍼 (20 mM 트리스 산도 7.4, 100 mM의 염화칼슘 2)와 4SP 버퍼 (0.4 M 자당, 16 mM의 나 2 HPO 4)를 준비합니다. </li><li> 주 1. 해동 냉동 C. 트라코마 티스 재고 얼음에 즉시 50 μL 배 CaCl2를 버퍼에 10 μL 박테리아를 희석. 3 μg의 플라스미드 DNA를 추가 (예., PASK-GFP - mKate2-L2)를 잘 혼합하고 25 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 이 단계 동안, 원심 분리 튜브에 맥코이 세포를 T-75 플라스크를 trypsinizing하여 숙주 세포를 준비한다. 5 분 50 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. Resuspen1X CaCl2를 버퍼의 적절한 체적 D 세포 펠렛을 4 × 10 7 세포 / ㎖의 최종 농도를 얻었다. </li><li> (단계 2.2)에서 30 분간 인큐베이션 한 후, 형질 전환 혼합물을 튜브 (200 μl의 총 부피)에 맥코이 세포를 제조 100 μL를 추가하고, 25 ℃에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 2 ml의 성장 매체와 6 자 플레이트와 오버레이에서 하나의 잘이 형질 전환 된 세포 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 2 일간 CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 일 3.를 Lyse 맥코이 세포는 C. 감염 구부러진 1,000 μL 피펫 팁으로 세포를 1 ML의 DH 2 O와 매체를 대체하고 긁어 트라코마 티스. C의 효율적인 세포 용해 및 릴리스 5 회 1 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 서스펜션을 통과 트라코마 티스. </li><li> C.를 함유하는 세포 용 해물의 전사 2 ml를 갓 도금 MCC의 합류 단층을 함유하는 T-75 플라스크에 트라코마오우 세포; (FBS)없이 8 mL의 DMEM을 추가 C. 있도록 25 ℃에서 2 시간 동안 배양 트라코마는 세포에 부착합니다. </li><li> 기음 세포는 10 U / ml의 페니실린 G와 1 μg의 / ㎖의 사이클로 헥시 미드와 보충 신선한 성장 매체를 추가하고. 37 ° C CO 2 배양기에서 48 시간 동안 플라스크를 품어. </li><li> 일 4. 세포가 감염되고 흠이 비정상적 클라미디아를 포함하는 광학 현미경으로 확인합니다. 2보다 큰 μm의 직경이다 흠 내 링 형상의 객체로 표준 광학 현미경에 밝은 공포, 그리고 비정상적인 클라미디아 기관 등의 흠을 확인합니다. </li><li> 현탁액으로 세포를 2 ML의 DH 2 O와 매체를 대체하고 긁어로 날 (5)를 Lyse 문화. 2 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 5 번 정지를 전달합니다. </li><li> 6 웰 플레이트에 하나의 웰에 맥코이 세포의 신선한 단층을 감염 세포 용 해물을 2 ㎖를 사용합니다. 25 ° C, 흡인에서 2 시간 동안 해물과 세포를 품어 신선한 성장을 추가페니실린 G 및 사이클로 헥시 미드를 포함하는 매체. </li><li> 세포의 건강에 따라 3 ~ 5 일 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 세포를 품어. </li><li> 반복 (비정상적인 몸의 결여) 정상 찾고 흠이 등장 할 때까지 6 웰 플레이트에 신선한 우물에 2.9-2.10 한 번 이상, 필요에 따라, 계대 배양 단계를 반복합니다. 이 때 확인하기 위해 거꾸로 형광 현미경을 사용 C. 트라코마는 mKate2 (빨간색)을 표현한다. </li><li> T-150 플라스크에서 재배 감염 맥코이이나 헬라 세포에서 클라미디아의 형질 전환을 수확하여, 예를 들어 높은 역가 클라미디아 주식의 생성에 감염된 문화, 최대 확장 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 클라미디아와 세포를 감염 <ol><li> IFU 결정 및 멀티 웰 검사 예를 들어 유리 바닥 요리 또는 챔버 슬라이드 고해상도 이미징을위한, 또는 24 웰 플레이트 원하는 배양 용기에 플레이트 GFP - 헬라 세포. </li><li> 이리저리 해동C를 포함하는 선 튜브 트라코마 티스, C. muridarum, 또는 C 예를 MOI 1 = 얼음에 폐렴 및 감염의 원하는 다양성 (MOI)에 HBSS에 희석. </li><li> 사용되는 특정 클라미디아의 변형을 기반으로 정적 또는 원심 분리 주었 중 감염을 수행합니다. <ol><li> C.와 감염 트라코마 티스 LGV의 혈청 형 (L2) 또는 C muridarum, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 세척하고 25 ℃에서 2 시간 동안 희석 세균 배양한다. 기음과는 HBSS로 세포를 씻어, 37 ° C CO 2 배양기에서 배양 배지에서 세포를 배양한다. </li><li> C. trachomatis에의 혈청 형의 D 또는 C와 감염 폐렴은, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 씻어 세포에 희석 박테리아를 추가 할 수 있습니다. 벤치 탑 원심 분리기에서 스윙 버킷 회 전자 첨부의 멀티 웰 플레이트 홀더 멀티 웰 플레이트 (멀티 웰 플레이트 뚜껑을 테이프로 고정) 유리 바닥 접시를 놓습니다. </li><li> 1 시간 동안 25 ° C에서 900 XG에 원심 분리기 세포. </lI&gt; <li> 1 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 원심과 장소에서 문화 혈관을 제거합니다. </li><li> 기음 세포는 바이오 안전성 캐비닛에, HBSS로 두 번 세포를 씻어 신선한 성장 매체를 추가합니다. 37 ° C CO 2 인큐베이터에 넣어 세포. </li></ol></li></ol> 클라미디아 흠 4. 라이브 셀 시각화 <ol><li> CO 2 배양기에서 클라미디아 감염 GFP - 헬라 세포를 제거하고 페놀 5 + 빨간색 %의 FBS없이 RPMI와 매체를 교체하십시오. </li><li> 20 배 이상 오일 목표를 사용하여 거꾸로 형광 현미경 (니콘 이클립스 티-E 또는 이와 유사한 것)에 마운트 세포. </li><li> 큰 블랙홀 (클라미디아 흠)를 포함하는 녹색 세포 : 이미징 소프트웨어 (Volocity 6 또는 유사)를 사용하여,에 초점을 식별 클라미디아는 GFP - 헬라 세포를 감염. </li><li> 마크 이미지 소프트웨어를 이용하여 관심있는 클라미디아 -infected 세포를 포함하는 영역의 XYZ 위치 (용적ocity 6 또는 이와 유사한 것). 수동으로 XY 스테이지보기 모드에서 &#39;포인트 추가&#39;를하여이 작업을 수행합니다. 이러한 방식으로, XYZ 좌표는 각 표시된 위치에 저장됩니다. </li><li> 취득 설치 대화 상자에서, 녹색 (GFP, 헬라 세포질)과 빨간색 (mKate2, C. trachomatis에) 채널, 채널마다 새로운 프레임마다 5 분의 속도를 얻기 위해 소프트웨어를 구성합니다. </li><li> 프로토콜이 &quot;캡처 / 녹음&quot;버튼을 클릭하여 상기 입력을 이용하여 획득 된 이미지 시퀀스를 획득. </li></ol> 라이브 세포에 포함 성장 매개 변수 5. 정량 <ol><li> 원하는 시간에 후 감염 (예., 24, 48 HPI) 클라미디아는 인큐베이터에서 GFP - 헬라 세포를 감염 제거하고 거꾸로 형광 현미경에 장착합니다. 참고 : 높은 NA와 20 배 또는 40 배 공기의 목표는 24 웰 플레이트에 가장 적합하고, 40X 오일 목적은 챔버 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 이 엉덩이에 대한 중 하나를 기판에 세포를 성장AY. </li><li> 흠이 자신의 최대 직경에있는 세포의 미드 플레인에 초점 선명한 가장자리를 얻을 수 있습니다. </li><li> 각 웰 (물론 당 적어도 10)에 많은 분야에 대한 이미지를 수집; 우물은 일반적으로 복제 또는 실험 변수를 나타냅니다. </li><li> 눈으로 (개재물 GFP-HeLa 세포 검정 구획이다), 수동 개재물의 개수를 열거 나 자동으로 개재물을 식별하고 카운트하기 위해 이미지 소프트웨어 알고리즘을 사용한다. <ol><li> 형광 강도에 의해 GFP - 헬라 세포를 찾아 (명령 &#39;개체 찾기&#39;)를 세포의 상대 강도를 기반으로 형광 임계 강도를 조절합니다. </li><li> 그 단지보다 5 μm의 2를 유지의 크기 지침을 사용하여 필터 선택한 객체. 이는 &#39;인구 1&#39;이다. </li><li> 입력으로 &#39;인구 1&#39;을 사용하여 명령 &#39;개체에 구멍 채우기&#39;를 적용합니다. 이 단계는 &quot;인구 2 &#39;를 생성한다. </li><li> &#39;페이지에서 빼기&#39;인구 1 &#39;opulation 2 &#39;인구 3&#39;는 긍정적으로 지정 클라미디아 흠을 표시 얻었다 &#39;. </li><li> 예를 유지하는 객체에 대해, &#39;인구 3&#39;( &#39;필터 인구&#39;명령)에 크기 필터를 적용 24 시간 이상 감염된 세포에서 흠보다 큰 25 μm의 2. 이 흠이 훨씬 작 등의 이전에 18 시간 일찍 감염 시간, 내용, 집합 크기 필터는 4 μm의 2 이상의 개체를 유지합니다. &#39;흠​​&#39;로 지정된 객체의 인구 크기 필터링 결과. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량 예컨대 이미지 데이터, 포접 번호, 개재물 크기 및 포접 둘레를 계산한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 실시간으로 시각화 및 클라미디아 흠의 분석을위한 형광 숙주 세포를 생성하는 실험적인 전략을 설명합니다. 이 공포의 시각화 방법은 시간이 지남에 따라 단일 세포 세포의 인구를 통해 또는에서 클라미디아 개재물의 동적 특성을 조명 추적하고 정량적으로 측정 할 수있는 강력한 능력을 부여한다. 클라미디아 흠을 형광 단백질 표지 세포에서 눈에 띄게 잘 그들이 쉽게 식별되도록, 정의 추가 면역 처리 없이도. 또한,이 방법은 세포 및 포함 곡률 당 공포의 번호와 같은 다른 클라미디아 종과 변종이 소유한다는 서명 형태 학적 차이를 해결하기에 충분히 민감하다. 또, 촬상 소프트웨어가 자동 GFP 발현 숙주 세포에서 개재물을 식별하도록 구성 될 수있는 방법을 보여준다. 김정일에 대한 면역 형광 라벨 단계의 obviation클라미디아 개재물의 lumination는 포함 형성 단위 (IFU)의 결정으로 엔드 포인트 분석에 대해 사용자가 상당한 시간과 비용 절감을 초래한다. 감염된 세포의...

세포 내 세균의 클라미디아의 종에 의해 발생하는 감염성 질환은 성병, 골반 염증성 질환, 실명, 폐렴 가능성이 동맥 경화 1-4을 포함하여 세계 보건에 큰 부담을 유도. 액포 내에서, 숙주 세포와 상호 작용하는 클라미디아의 능력 (포함 되나), 숙주 세포의 성공적인 감염 중요한 결정 요인이다. 포함은 클라미디아 성장을 가능하게하고 동적으로 클라미디아 5의 전체 2~3일 발달주기에 걸쳐 수정 된 새로운 병원성 구획입니다. chlamydiae의 의무적 세포 내 성격은 직접 포함의 독특한 생물학을 연구, 특히 연구 커뮤니티에 많은 과제를 제시한다. 주요 장애는 효율적으로 세포 내 클라미디아 또는 형광 접근하여 그들의 포함를 시각화하는 무능력하고있다살아있는 세포에서 말이지. 최근의 발견은 마지막으로 GFP C를 표현을 생성하는 방법을 공개했다 트라코마 티스 (6); 그러나,이 연구 결과는 아직 포함 특정 라벨을 주도하지 않았습니다. 일부 기술은 박테리아 나 개재물 7,8의 표시에 대해 기재되었지만, 이러한 photobleaching에 비 - 특이 조로 감수성과 같은 단점을 겪는다. 우리 그룹에 의해 중요한 발견은 숙주 세포 (9)을 표현 GFP를 사용하여 포함을 조명하기위한 새로운 전략을 수립. 이 전략은 합리적 이상 520 다 10 분자 포접 막의 극한 투과성을 이용한다. 세포가 안정적으로 특정 세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP 또는 mCherry)를 발현하도록 유전자 조작 된 경우, 클라미디아 흠 형광 자신의 완전한 배제로 놀라운 선명도와 함께 볼 수 있습니다. 이 역 이미징 전략은 모든 엽록소에 대한 흠 즉시 시각화 할 수 있습니다amydia 종과 용이 관심 대부분의 숙주 세포에 대해 적응 될 수있다. 그 유틸리티의 시연으로,이 방법은 클라미디아 종 9 휴대 출구 경로를 공개하고 정의하기 위해 이전에 사용되었다. 여기서, 우리는 또한이 방법을 수행하고, 개재물의 성장 역학에 관한 정량적 데이터 키를 유도하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다. 또한, 비용 효율적 항체 기반 열거 방법을 대체 할 수 있으며 클라미디아 11 mKate2 발현과 같은 다른 형광 라벨과 협력하여 사용될 수있다. 공구의 이러한 강력한 결합은 살아있는 숙주 세포 내부 클라미디아 포함 막의 물성을 탐사 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>시그마</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m 필터</td><td>: Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr>, <tr><td>G418</td>, <td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr>, <tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td>, <td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, 페놀 레드 제외</td>, <td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr>, <tr><td>페니실린 G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>챔버 슬라이드, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

세포 내 세균인 클라미디아(Chlamydia)는 전 세계 공중 보건에 큰 부담을 안겨주고 있습니다. C. 트라코마티스(C. trachomatis)는 성병의 주요 세균 원인이자 전 세계에서 예방 가능한 실명의 주요 원인입니다. 클라미디아에 의한 숙주 세포의 성공적인 감염을 위한 필수 결정 요인은 인포물(inclusion)이라고 하는 새로운 액포 구획 내에서 숙주 세포 신호를 조작하는 박테리아의 능력입니다. 내포물 내에서 클라미디아는 2-3일의 발달 성장에 필요한 영양소를 획득하고, 액포막의 세포질 표면과 숙주 세포질로 효과기 단백질 패널을 추가로 분비합니다. 그러나 클라미디아 생물학에 대한 이해의 격차는 이 세포 내 구획을 시각화하고 분석하는 데 상당한 어려움을 제시합니다. 최근에는 숙주 세포를 발현하는 GFP를 사용하여 내포물을 시각화하기 위한 역이미징 전략이 설명되었습니다. 이 접근 방식은 GFP와 같은 큰 분자에 대한 개포막의 고유한 불투과성을 합리적으로 이용합니다. 이 연구에서는 클라미디아 내포물의 후속 시각화를 위해 GFP 또는 mCherry 발현 숙주 세포가 어떻게 생성되는지 설명합니다. 또한, 이 방법은 비용이 많이 드는 항체 기반 계수 방법을 효과적으로 대체하는 것으로 나타나고, GFP 발현 클라미디아와 같은 다른 형광 표지와 함께 사용할 수 있으며, 다양한 클라미디아 종 및 균주에서 개포막 성장에 대한 주요 정량적 데이터를 도출하는 데 활용될 수 있습니다.

세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP)를 발현하는 포유 동물 세포는 살아있는, 감염된 세포 배양에서 클라미디아 흠의 조명을 사용하도록 설계 될 수있다. 클라미디아 감염시, 포함은 숙주 세포 (그림 1)에 검은 반점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 형광 부족 개재물의 선명도는보기 및 / 또는 치료 (그림 1)의 여러 분야에 걸쳐 개재물의 자동 식별을 위해 이용 될 수있다. 형광 숙주 세포가 생성되면, 강력한 워크 플로우 실험 샘플에서 클라미디아 감염 수준의 빠른, 정량 분석​​에 사용할 수 있습니다. 하나의 주요 응용 프로그램은 라이브, 감염된 세포에서 클라미디아 포함 형성 단위 (IFU) (그림 2)의 결정이다. 이 실험 전략은 일상적 분야에서 사용되는 면역 절차에 대한 필요성을 제거 모두 시간과비용이 많이 드는. 기재된 촬...

클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내에서 클라미디아 봉입체(inclusion) 성장 역학을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포질에서 GFP와 같은 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 형광 숙주 세포를 생성합니다. 그 다음, 숙주 세포를 클라미디아로 감염시킨 후 배양합니다.그 후 감염된 세포를 라이브 형광 현미경으로 시각화합니다. 마지막으로, 현미경 분석 소프트웨어를 통해 클라미디아 봉입체(inclusion)의 특성을 정량화하며, 최종적으로 라이브 형광 현미경을 사용하여 호스트 세포 내의 클라미디아 봉입체를 시각화하고 정량적 결과를 얻기 위해 봉입체의 생물학적 파라미터를 측정합니다. 항체 기반 계수와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이러한 역이미징 전략을 살아있는 세포에 적용할 수 있으며 다른 형광 표지와 병용하여 모든 클라미디아 종의 봉입체 역학을 정량화할 수 있다는 점입니다.또한, 세포 내 박테리아를 표지하는 일반적인 방법과 달리, 이 접근 방식은 살아있는 세포 내의 봉입체 막을 시각화하여 이 병원체 포함 구획의 중요한 동적 특성을 밝혀낼 수 있습니다. 텍스트 프로토콜 플레이트에 따라 형광 HeLa 세포를 생성한 후, 고해상도 이미징을 위한 유리 바닥 접시나 IFU 측정 및 다중 웰 스크리닝을 위한 24 웰 플레이트와 같은 원하는 배양 용기에 GFP HeLa 세포를 분주하십시오. Crich Cotus 또는 다른 원하는 클라미디아 균주가 들어 있는 냉동 튜브를 얼음 위에서 해동하고 HBSS로 희석하여 원하는 감염 다중도(MOI)로 맞춥니다. Crich Cotus, LGV zero VL two를 이용한 정적 감염을 수행하려면, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 HBSS를 사용하여 GFP HeLa 세포를 세척하십시오.희석된 박테리아를 웰에 넣고 25 °C에서 2시간 동안 배양한 후, 세포를 흡입하여 제거하고 HBSS로 세척합니다. 그 후 성장 배지를 첨가하고, 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 세포를 배양하여 crich to serovar D 또는 다른 클라미디아 균주를 이용한 원심분리 보조 감염을 수행합니다. HBSS를 사용하여 GFP hela 세포를 세척하고 희석된 박테리아를 세포에 첨가합니다.그 다음, 감염된 세포가 담긴 디쉬를 벤치탑 원심분리기의 스윙 버킷 로터 내 멀티웰 플레이트 홀더에 넣습니다. 900 ×g, 25 °C에서 1시간 동안 세포를 원심분리합니다. 이후 생물안전작업대 내 37 °C 이산화탄소 배양기에 배양 용기를 1시간 동안 보관한 후, 세포를 흡입 제거하고 HBSS로 2회 세척한 뒤 성장 배지를 첨가합니다.감염된 세포가 담긴 디쉬를 37 °C에서 배양합니다. 클라미디아 봉입체를 시각화하려면, 이산화탄소 배양기에서 클라미디아에 감염된 GFP hela 세포를 꺼내고 phenol red가 없는 RPMI와 5% FBS를 사용하여 배지를 교체합니다. 디쉬 또는 멀티웰 플레이트를 20배 이상의 오일 대물렌즈가 장착된 도립 형광 현미경 위에 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여, 커다란 검은색 구멍을 포함하고 있는 녹색 세포로 보이는 클라미디아 감염 GFP hela 세포를 식별합니다.획득 설정 대화 상자에서 소프트웨어가 녹색 채널과 샘플에 추가된 다른 모든 채널을 획득하도록 구성하십시오. 캡처/녹화 버튼을 사용하여 원하는 시점에 이미지를 획득하십시오. 감염 후, 클라미디아에 감염된 GFP HeLa 세포를 배양기에서 꺼내 접시를 도립 형광 현미경 위에 놓으십시오.봉입체가 최대 직경과 수율을 보이는 세포의 중간 평면에 집중하십시오. 경계가 선명하게 처리된 이미지를 웰당 최소 10개 시야에서 획득하십시오. 일반적으로 웰은 반복 실험군 또는 실험 변수를 나타냅니다.Measurements 탭에서 GFP hela 세포를 찾으려면, find objects 명령을 사용하고 green 채널을 선택하십시오. 세포의 상대적 강도에 따라 임계값 강도를 조정하십시오. 포함물 또는 검은색 구획의 수와 GFP hela 세포의 수를 육안으로 직접 계수하거나, 이미징 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 포함물을 자동으로 식별하고 계수하십시오.선택한 객체 중에서 크기가 5 µm²보다 큰 객체만 남겨 필터링합니다. 이를 모집단 1이라고 합니다. 이 모집단을 사용하여 'fill holes in objects' 명령을 적용하면 모집단 2가 생성됩니다.인구집단 2에서 인구집단 1을 빼서 양성으로 표시된 클라미디아 봉입체인 인구집단 3을 생성합니다. filter population 명령을 사용하여 인구집단 3에 크기 필터를 적용합니다. 예를 들어, 24시간 이상 감염된 세포 내 봉입체의 경우 25 square micrometers보다 큰 객체를 유지하고, 초기 감염 시간의 경우 4 square micrometers보다 큰 객체를 유지하도록 크기 필터를 설정합니다.이러한 봉입체(inclusion)들은 크기가 훨씬 작기 때문에, 크기 필터링을 거치면 봉입체로 지정된 객체 집단이 추출됩니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 봉입체 수, 봉입체 크기 및 봉입체 둘레와 같은 정량적 데이터를 이미지에서 계산하십시오. 클라미디아(chlamydia) 감염 시 봉입체는 검은 점으로, 그리고 숙주 세포 또는 숙주 세포 내에서 형광 단백질을 발현하는 클라미디아로 쉽게 관찰되며, 이러한 명확성을 활용하여 수많은 시야 또는 처리 조건 전반에서 자동 식별을 수행할 수 있습니다.이 그래프에서 보여주듯이, 주요 응용 분야 중 하나는 살아있는 감염 세포 내의 클라미디아 봉입체 형성 단위(inclusion forming units)를 결정하는 것이며, 이는 시간과 비용이 많이 드는 면역형광법 절차의 필요성을 없애줍니다. 이 이미징 접근법의 또 다른 핵심 특징은 모든 클라미디아 종 또는 균주에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다. 본 예시에서는 네 가지 클라미디아 종 또는 균주 중 하나에 감염된 GFP hela 세포의 시간 경과 분석을 각 종과 균주에 대해 수행하였습니다.표시된 시점에서 봉입체를 마킹하고 분석하여 평균 면적, 둘레 길이 및 세포당 봉입체 수를 계산했습니다. 이러한 속성들은 호스트 세포와의 상호작용 방식을 포함하여 클라미디아 봉입체의 생물학적 특성에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 여기 제시된 영상은 GFPC.Tracom L2에 감염된 mCherry HeLa 세포의 영상으로, 감염 48시간 후부터 125분 동안 5분 간격으로 촬영한 타임랩스 이미지로 구성되어 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 이 역이미징 기법을 사용하여 클라미디아 봉입체를 시각화할 뿐만 아니라, 봉입체 면적, 둘레, 세포당 봉입체 수와 같은 봉입체 역동성을 정량화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기법은 기존의 시각화 기법들에 비해 비용 효율적이며, 모든 클라미디아 종 및 균주에 적용 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

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박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

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시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여

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