인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는
2014년 4월 1일
나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 뇌수막염이라는 박테리아가 생체 내에서 인간의 혈관을 감염시키는 메커니즘을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 면역 결핍 마우스에 인간 피부를 이식하여 인간 피부 혈관을 도입함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 인간화 된 쥐가 박테리아에 감염됩니다.
그런 다음 미리 결정된 기간 동안 감염이 진행되도록 허용합니다. 마지막 단계에서는 감염 결과를 평가하기 위해 혈액 및 조직 샘플을 채취합니다. 궁극적으로 조직학, 면역형광, 혈액 및 조직 분석의 조합이 인간 혈관의 감염 진행을 연구하는 데 사용됩니다.
세포 배양 모델 또는 동물 모델과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 처음으로 이러한 감염 중에 발생하는 전형적인 임상 병리를 관찰할 수 있다는 것입니다. 수집 후 가능한 한 빨리 70 % 에탄올로 인체 피부 표면을 청소한 다음 잘 깨끗한 표면, 바람직하게는 플로우 후드 아래에 평평하게 눕히십시오. 그런 다음 미리 설정된 두께의 진피를 사용하여 피부 상단에서 200-400마이크로미터 절편을 자릅니다.
조각의 무결성을 확인한 다음 2x2cm 정사각형으로 더 자릅니다. PBS에 사각형을 배치 한 다음 외과 수술로 준비된 마취제 6-8 주, 70 % 에탄올과 심각한 결합 면역 결핍 베이지 색 마우스의 면도 부위를 청소하십시오. 이식 부위에 국소 마취제를 바른 후 구부러진 가위를 사용하여 이식 부위보다 약간 작은 부위의 마우스 피부의 표층을 조심스럽게 제거하고 아래에 있는 혈관 조직을 방해하지 않도록 주의합니다.
이식편이 건조해지지 않도록 빠르게 움직이고, 인간 피부 슬라이스 중 하나를 이식편 침대 위에 놓고 표피 면이 위를 향하도록 합니다. 조직의 가장자리를 정렬하고 조직 접착제로 고정합니다. 그런 다음 나머지 인간 피부를 이식 침대에 조심스럽게 끼우고 각 가장자리 주위에 소량의 조직 접착제를 놓습니다.
이식 침대를 더 크게 만드는 것보다 항상 사람의 피부를 크기에 맞게 자르십시오. 각 모서리가 고정되었는지 확인한 후 요오드 용액으로 해당 부위를 청소하고 동물의 호흡에 영향을 미치지 않도록 주의하면서 이식편 위의 쿠션 면으로 단단히 붕대를 바르고 붕대를 드레싱 테이프로 고정하고 동물이 따뜻한 표면에서 회복할 수 있도록 합니다. 일단 깨어나면 박테리아 주입이 하룻밤 동안 플레이트 배양을 액체 배양에 다시 접종할 때까지 동물을 케이지로 되돌립니다.
감염 당일 아침, 박테리아가 원하는 농도에 도달하면 세포를 10의 1배로 희석하여 밀리리터당 7번째 집락 형성 단위를 만듭니다. 그런 다음 마취 후 발가락으로 이식 된 마우스의 진정을 확인하십시오. 동물을 꼬집어 열 패드에 놓습니다.
동물의 눈에 안연고를 바르고 입. 각 마우스에 8mg의 인간 이동을 식염수로 주입합니다. 그런 다음 각 동물에 대해 꼬리 끝을 자르고 꼬리에서 나온 작은 혈액 한 방울을 한천 플레이트에 펴서 혈액이 감염 전에 무균 상태인지 확인합니다.
그런 다음 역안와 주사를 통해 100마이크로리터의 박테리아 배양액을 정맥 주사합니다. 몇 분 후 꼬리 끝을 다시 자르고 이 혈액 샘플을 새 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 감염 직후 혈액 집락 형성 단위를 확립하려면 조직 접착제로 꼬리를 밀봉한 다음 박테리아 접종물을 희석하고 적절한 항생제를 사용하여 한천 플레이트에 펴십시오.
감염 후 6시간에 접종 군집 형성 단위를 확립하기 위해, 각 쥐 꼬리에서 또 다른 소량의 혈액을 채취한 다음, 방금 설명한 대로 혈액 방울을 희석하고 도금하여 6시간에 군집 형성 단위를 확립합니다. 그런 다음 모든 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양하여 장기 집락 형성을 수행합니다. 감염된 동물의 단위 수입니다.
안락사된 각 쥐의 정중선을 절개하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 각 동물에 대해 갈비뼈를 자르고 심장을 절개합니다. 멸균 주사기를 사용하여 심장과 흉강에서 가능한 한 많은 혈액을 추출하고 각 샘플에 대해 개별 멸균 튜브에 분배합니다.
다음으로, 관심 기관을 제거한 다음 피부 이식편과 함께 제공되는 마우스 피부 부분을 동물당 하나의 멸균 플레이트로 옮깁니다. 수집된 혈액을 15분 동안 응고시킨 다음 회전시킵니다. 그런 다음 혈액에서 혈장을 제거하고 나중에 분석할 수 있도록 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
다음으로, 각각 500마이크로리터의 PBS를 포함하는 균질화 튜브의 무게를 잰다. 그런 다음 멸균 생검 펀치를 사용하여 절개된 각 조직에서 4mm 생검 샘플을 채취합니다. 피부 샘플이 들어 있는 각 튜브에 2mm 비드 1개가 있는 균질화 튜브에 생검을 개별적으로 배치합니다.
현미경 검사를 위해 나머지 조직을 섭씨 4도의 4%파라 포름알데히드에 보관하고 균질화 튜브의 무게를 측정하여 생검 중량을 설정합니다. 다음 6, 30 초 동안 000 분당 회전수에 표본을 균질화해, 균질화는 똥이 될 때까지 피부 균질화를 반복하. 마지막으로, 각 튜브의 세포 슬러리를 새로운 한천 플레이트에 펴고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 하룻밤 동안 배양물을 성장시킵니다.
장기 집락 형성 단위를 확립하기 위해 이러한 대표적인 결과에 포함됩니다. N 수막염의 GFP 양성 균주. 혈청군 C가 사용되었습니다.
혈구 수에 의하면 6개의군집 형성 단위의 세균에 10을 1회 정맥주사로 주입한 후 5분 후에 평균 1.5배의 10배의 5번째 군락 형성 단위가 혈액을 순환하는 것으로 나타났습니다. 6 시간 후, 카운트는 평균 4.8 곱하기 10까지 4 번째 군체가 24 시간까지 밀리리터 당 단위를 형성합니다. 평균 개수는 밀리리터당 4번째 군집 형성 단위에 대해 2.4 곱하기 10이었습니다.
그러나 10마리의 쥐로 구성된 이 그룹에서 5마리는 검출할 수 있는 순환 박테리아가 없었고 다른 5마리는 상대적으로 수치가 높았습니다. 이 그래프의 이러한 막대는 스킨에서 가져온 각 그룹 CFU 수의 중앙값을 보여줍니다. 샘플은 인간의 피부에서 상당한 수를 가진 마우스의 대다수를 보여주며, 6 시간에 조직 밀리그램 당 네 번째 CFU에 평균 2.1 곱하기 10, 24 시간에 조직 밀리그램 당 두 번째 CFU에 4.4 곱하기 10을 곱합니다.
반대쪽 마우스 피부 샘플은 24시간에 박테리아 수가 없었고 6시간에는 매우 낮은 수만 나타났으며, 이는 이식된 조직의 인간 혈관에 대한 말기 수막염에 대한 강한 선호도를 보여줍니다. 일반적으로 박테리아 수는 표본 채취된 다른 장기에서 매우 낮거나 검출할 수 없었지만, 두 동물에서 수치가 보였는데, 이는 높은 순환 박테리아 수와 상관관계가 있을 수 있습니다. 이 모델은 또한 생체 내에서 독성 인자의 역할을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 본 실험에서, 이러한 돌연변이 균주에 감염된 마우스는 기능적 4형 알약 I이 결여된 박테리아 균주를 사용하여 인간 피부 이식편에서 세균 접착력을 나타내지 않았으며, 이는 생체 내 접착에서 4형 알약 I이 수행하는 중요한 역할을 확인시켜주었습니다. 감염 후 2시간 후 피부 이식의 이러한 컨포칼 이미지에서 렉틴 UEA 접합 로민으로 염색된 인간 혈관을 관찰할 수 있습니다. 피부의 표피 진피 경계는 명확하게 식별할 수 있으며 감염성 GFP 양성 및 수막염은 혈관 전체에서 명확하게 관찰될 수 있습니다.
이 h와 e로 염색된 인간 피부 이식편은 염증과 혈관 누출뿐만 아니라 표피 피부 경계에 가까운 혈관에 집중된 혈전증을 보여줍니다.감염 후 24시간이 지난 감염의 약 30%에서 피부의 박테리아 부착으로 인해 거시적으로 감지할 수 있는 자반증이 발생했습니다. 따라서 이 기술의 개발은 연구 및 숙주 병원체 상호 작용에 관련된 연구자들이 인간 혈관의 맥락에서 질병의 메커니즘을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.
개요
이 연구는 Neisseria meningitidis가 체내에서 인간 혈관을 감염시키는 메커니즘을 조사합니다. 면역결핍 마우스에 인간 피부를 이식함으로써, 연구자들은 이러한 감염과 관련된 임상 병리를 관찰할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 미생물학
- 전염병
- 혈관 생물학
배경
- Neisseria meningitidis는 인간만을 감염시키는 병원체입니다.
- 혈관을 감염시켜 중대한 혈관 손상을 초래합니다.
- 전형적인 자반증은 일반적인 임상 증상입니다.
- 기존의 모델은 인간 혈관 반응을 효과적으로 재현하지 못합니다.
연구 목적
- 인간 혈관에서 Neisseria meningitidis의 감염 메커니즘을 연구합니다.
- 인간화된 마우스 모델을 사용하여 감염 진행을 평가합니다.
- 인간 사례에서 관찰된 임상 병리를 평가합니다.
사용된 방법
- 면역결핍 마우스에 인간 피부 이식.
- 이식된 마우스에 Neisseria meningitidis 감염.
- 감염 후 혈액 및 조직 샘플 수집.
- 감염 결과를 평가하기 위한 조직학 및 면역형광 분석.
주요 결과
- 감염으로 인해 인간 혈관에 광범위한 박테리아 부착이 발생했습니다.
- 임상 증상과 관련하여 혈관 손상이 관찰되었습니다.
- 감염된 마우스의 여러 시점에서 혈액 콜로니 형성 단위를 정량화했습니다.
- 결과는 감염된 마우스 간의 박테리아 수의 변이성을 나타냈습니다.
결론
- 인간화된 마우스 모델은 인간 감염 병리를 효과적으로 모방합니다.
- 이 접근법은 감염 메커니즘을 직접 관찰할 수 있게 합니다.
- 연구 결과는 수막구균 감염에 대한 향후 치료 전략을 위한 정보를 제공할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This humanized mouse model addresses a critical gap in infectious disease research by enabling direct observation of human-specific pathogen interactions with human vasculature. It provides a physiologically relevant system for de-risking target validation and mechanistic studies of bloodstream infections. The model supports predictive confidence in preclinical evaluation of anti-infective candidates by replicating key clinical pathologies such as vascular leak and purpuric rash formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding bacterial adhesion to human microvasculature.
- Scientific Value: Supports functional validation of virulence factors like type IV pilus in a human-relevant context.
- Scientific Value: Facilitates pathway clarification of vascular damage mechanisms triggered by N. meningitidis.
- Operational Value: Reduces reliance on non-human models that fail to recapitulate human-specific pathogen tropism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of bacterial adherence and tissue burden in human vessels.
- Scientific Value: Enables standardized evaluation of antimicrobial or anti-virulence compounds using CFU quantification in grafted skin.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for assessing dose-dependent effects on vascular pathology.
- Operational Value: Supports assay scalability through consistent graft preparation and infection protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant clinical manifestations including inflammation, thrombosis, and purpuric rash development.
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of infection progression from early adhesion to tissue damage.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating bacterial load with histopathological outcomes.
- Operational Value: Facilitates biomarker discovery through analysis of cytokine profiles and vascular leakage markers in humanized tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for pathogens requiring human-specific receptors or microenvironmental cues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathogen-host interactions in human dermal microvessels.
- Screening: Enables quantitative assessment of compound effects on bacterial adhesion and survival in human tissue.
- Analytics: Provides CFU counts, histological scoring, and immunofluorescence data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo pathology through replication of human vascular responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other human-specific bloodstream pathogens beyond N. meningitidis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling human-specific vascular pathology absent in conventional models.
- Operational Value: Standardizes complex tissue grafting and infection procedures for cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying ineffective virulence-targeted inhibitors early.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of candidates based on ability to prevent vascular damage in human-relevant tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical grafting and handling of immunocompromised animal models.
- Dependent on access to sterile human skin tissue and dermatome equipment for standardized graft preparation.
- Necessitates biosafety level 2 (BSL-2) containment for handling N. meningitidis and other bloodborne pathogens.
- Requires standardized protocols for CFU quantification, histology, and immunofluorescence to ensure data comparability.
- Limited by graft viability duration and potential mouse-to-microvascular anastomosis variability.
