라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 뉴런 표면의 단백질을 라벨링하고 차등 2차 항체 라벨링을 사용하여 표면 단백질을 내부화된 단백질과 구별하는 것입니다. 이를 위해 커버 유리에서 배양된 1차 뉴런은 표면 항원결정기에 대항하는 항체와 함께 배양되고 내재화가 가능하도록 배양됩니다. 배양 후, 표면에 노출된 단백질을 식별하기 위해 형광 표지된 2차 항체를 적용합니다.

그런 다음 여분의 표지되지 않은 2차 항체를 적용하여 남아 있는 표면 단백질 1차 항체 복합체를 차단합니다. 그런 다음 배양된 뉴런을 투과하고 다른 색상의 2차 항체를 적용하여 내부화된 단백질을 검출합니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사를 통해 내재화된 단백질과 표면 단백질의 상대적 수준을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차에 따라 소스 표면 단백질 내재화의 시간 경과를 얻어 바질 및 자극 조건에서의 단백질 수송 속도에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. PBS가 들어 있는 3개의 별도 헹굼 접시에 담궈 하루 전에 준비한 세포 배양 세척 폴리리신 코팅 18mm 볼릭 유리 커버 슬립을 위한 커버 슬립을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 12웰 플레이트의 웰에 500마이크로리터의 라미네이트 용액을 추가한 다음 집게를 사용하여 커버 슬립을 각각에 놓습니다. 각 커버 슬립을 아래로 눌러 섭씨 37도에서 2시간 동안 우물 배양 바닥에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오.이 프로토콜은 E 15 마우스 피질 또는 E 18 쥐 하마 Campi를 사용하여 수행할 수 있습니다.

이 데모에서는 마우스 피질이 사용됩니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS가 함유된 1밀리리터의 에이노르에 얼음 위에 반 깔짚 또는 배아 1깔짚의 피질을 놓고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 1 밀리리터 마이크로 피펫을 사용하여 피질 조직에서 PBS를 제거합니다.

그런 다음 배아 반 리터의 피질 조직에 Pappa DNA의 한 용액 500 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15-20분 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 두 번, 배양 후 튜브를 부드럽게 두드려 내용물을 혼합하고, 화염 광택 실리콘 파스터 피펫을 사용하여 세포 분산이 얻어질 때까지 조직을 10-15회 부드럽게 재평가합니다.

해리되지 않은 조직 덩어리가 남아 있어야 하는 경우는 거의 없으며 기포 생성을 피하십시오. 해리된 세포 현탁액을 첨가제가 있는 Hank's BSS의 4%BS, A의 3ml 쿠션 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 그런 다음 스윙 아웃 로터 원심분리기가 있는 탁상형 원심분리기에서 7분 동안 100배 G로 원심분리기

탈수 후 세포 펠릿을 흡인하지 않도록 주의하면서 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 1ml의 완전한 신경 기저 배지를 추가하고 펠릿화된 세포를 다시 현탁시키기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 혈구 분석기를 사용하여 살아있는 세포 농도를 측정합니다.

밝은 위상 세포만 도금 직전에 살아있는 것으로 간주해야 합니다. 덮개에서 흘러나온 여분의 라미네이트 혈청 용액을 흡인하고 1차 뉴런 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 각 웰에 75, 000에서 100, 000 개의 기본 뉴런을 추가합니다.

일째에 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 신경 기저 배지에서 최대 21일 동안 뉴런을 배양하고 그 후 매주 항유사분열 플루오로, 데옥시 우리딘 우리딘을 첨가하여 신경교세포의 과잉 성장을 방지하고 반 배지 변화를 수행합니다. 배양 첫 주 동안, 뉴런은 이틀 된 배양의 이미지에서 볼 수 있듯이 수지상 가지(dendritic arbors)를 발달시켰습니다. 두 번째에서 세 번째 주가 되면 그들은 성숙하고 시냅스 형성을 겪게 될 것입니다.

광범위한 투영 네트워크가 시험관 내에서 14일 동안 수행된 이 그림에 설명되어 있으며, 관심 있는 표면 노출 단백질을 라벨링하고 1차 항체를 적절한 농도로 컨디셔닝된 배지에 직접 추가합니다. 각 상태는 3차적으로 검사해야 합니다.4개의 대조군, 면역 전 혈청 또는 엑소사이토시스 중에 노출되지 않은 단백질의 세포 내 영역을 인식하는 항체는 테스트 1차 항체와 동일한 희석으로 사용할 수 있습니다. 배양 후 1시간, 2시간 또는 4시간 동안 세포를 배양 인큐베이터로 되돌려 놓고 항체가 포함된 배지를 흡인하고 PBS로 웰을 부드럽지만 빠르게 한 번 세척합니다.

우물에 용액을 첨가한 다음 흡입하여 실온을 추가합니다. 그런 다음 갓 준비한 4%파라 포름알데히드를 넣고 5분 동안 배양합니다. 고정 후 세포를 고정하기 위해 실내 온도를 추가합니다.

우물에서 파라 포름알데히드 용액을 제거하고 흄 후드의 액체 폐기물 용기에 버리십시오. 그런 다음 이전과 같이 PBS로 세포를 세 번 빠르게 헹굽니다. 커버 슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 세 번째 세탁을 제자리에 두십시오.

다음으로, 집게를 사용하여 플레이트에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 일회용 배양 플레이트의 바닥이나 뚜껑에 있는 파라머 시트에 셀 면이 위로 향하게 놓습니다. 염색 프로토콜의 나머지 부분은 이 표면에서 PBS 5%BSA의 피펫 차단 용액을 세포에 부드럽게 피펫으로 만들어 덮개 슬립에 둥근 거품 모양의 방울을 만들어 건조되지 않도록 합니다. 30분 동안 배양합니다.

차단 용액에 세제를 첨가하지 않는 것이 중요합니다. 이 단계에서는 세포 표면 단백질만 표지해야 할 때 세포가 투과되어서는 안 됩니다. 막기 후에, 막는 해결책을, 그 후에 표면에 의하여 드러낸 단백질을 레테르를 붙이고, 형광으로 표지된 2차 항체를 적용하고, 그 후에 실내 온도에 2 시간 동안 배양하고, 2차 항체를 흡인하고 표지한 2차 항체에 의해 결합되지 않는 세포 표면에 어떤 단백질든지 막기 위하여 매번 5분 동안 PBS로 덮개 미끄러짐을 두 번 세척하십시오.

비투과성 뉴런을 고농도의 표지되지 않은 2차 항체로 하룻밤 동안 배양합니다. 실온에서. 하룻밤 동안의 배양은 매우 중요합니다.

배양 기간이 짧다고 해서 라벨링된 2차 항체에 완전히 결합되지 않은 1차 항체를 완전히 차단하지는 않습니다. 다음날, 이전과 같이 PBS로 커버 슬립을 각각 5분씩 두 번씩 세탁합니다. 그런 다음 고정제를 제거한 후 실온에서 5분 동안 인산염 완충액에 4%파라 포름알데히드로 세포를 후둡니다.

PBS로 세포를 두 번 빠르게 헹굽니다. 다음으로 세포 내 라벨링을 위해 실온에서 30분 동안 5% BSA 및 0.1% Triton X 100을 함유한 PBS로 세포를 퍼밍 및 블록합니다. 투과 후 차단 용액을 제거합니다.

커버 슬립이 마르지 않도록 주의하십시오. 다르게 태그된 2차 항체를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 두 번째 2차 항체를 제거한 후 PBS로 커버 슬립을 5분 동안 3회 세척합니다.

그런 다음 탈이온수 마운트로 잠시 씻으십시오. 커버는 페이드 방지제가 포함된 수성 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 미끄러지며 형광 신호의 최적 보존을 위해 섭씨 4도의 어두운 곳에서 슬라이드를 건조 보관할 수 있습니다. 적절한 excitation 및 emission filter를 사용하여 컨포칼 현미경에서 immuno stain cell을 이미지화합니다.

이미징 후 모든 반복 및 조건에 대해 동일한 이미징 획득 파라미터를 사용합니다. Fiji Image J 또는 metamorph와 같은 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표준 관심 영역의 통합 밀도 또는 숫자 및 크기와 같은 Punta 속성을 확인하여 발작 관련 유전자 6 또는 6이 뉴런 표면에 존재하고 뉴런 표면에서 내재화되었는지 여부를 확인합니다. 배양된 쥐 해마 뉴런의 이중 색상 라벨링은 이 비디오에 설명된 대로 수행되었습니다.

이 이미지에서 라벨링된 세포 표면 단백질은 청록색으로 표시되고 내재화된 단백질은 녹색으로 표시됩니다. 화살촉에 의해 지시된 이중 염색은 건강하지 않은 것으로 보이는 세포에서만 관찰되었으며, 항체 공급 배양 중에 내재화된 단백질이 엔도솜에 국한되어 있는지 여부를 확인하기 위해 초기 재활용 엔도솜 마커인 트랜스페린 mCherry를 발현하는 뉴런이 수지상 가지의 이 영역에서 볼 수 있듯이 투과 후 면역 염색되었으며, 내재화된 단백질이 엔도솜에 국한되었음을 확인하는 트랜스페린과 반점 염색의 광범위한 중복이 있었습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 항체를 사용하여 세포 표면과 내부화된 단백질 풀을 구별할 수 있다는 것입니다.